具有整联蛋白抑制剂性质ii的肽和肽模拟物的衍生物的制作方法
专利名称：具有整联蛋白抑制剂性质ii的肽和肽模拟物的衍生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及式I的化合物B-Q-X1(I)其中B是生物活性的细胞粘着-介导的分子，选自 和Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys(ii)Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys(iii)Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys(iv)Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg(v)Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn(vi)Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg(vii)，其中对于(i)X是H2N-C(＝NH)-NH，Het-NH-，H2N-C(＝NH)-，A-C(＝NH)-NH-或Het-，Y是-(CH2)n-或
-(CH2)s-CH(R4)-(CH2)t-或-(CH2)p-Het2-(CH2)q-，Z是N-R2或CH-R2，R2是H或具有1-4个碳原子的烷基，R3是H，Ar，Het或A，R4是H，A，Ar，OH，OA，OAr，芳基烷基，Hal，CN，NO2，CF3或OCF3，A是COOH，NH2或具有1-6个碳原子的烷基，其是未取代的或者被COOH或NH2取代，Ar是未取代的或者被A，OH，NH2，OA，CF3，OCF3，CN，NO2或Hal一取代，二取代或三取代的苯基，其可以被A，OH，OA，OCF3，CN，NO2或Hal一取代，二取代或三取代的苯基以得到未取代的或者取代的联苯基的这样一种方式取代，Hal是F，Cl，Br或I，Het是具有5-10个成环原子的饱和的，部分或完全不饱和的一环或二环杂环基团，其中可以存在1-3个N和/或一个S或O原子，并且该杂环基团可以被CN，Hal，OH，NH2，COOH，OA，CF3，A，NO2，Ar或OCF3一取代或二取代，Het2是具有1-4个N和/或S原子的5-或6-元芳香杂环，其可以是未取代的或者被F，Cl，Br，A，OA或OCF3一取代或二取代，n是4，5或6，m，o，p，q是0，1或2，s，t是0，1，2，3，4，5；Q不存在或者是有机间隔基分子和X1是固定分子，选自-CO-CH＝CH2(viii)-CO-(CH2)1-20-CO-CH＝CH2(ix)-CO-(CH2)1-20-SH (x)-CO-CH(NH2)-CH2-SH(xi)-NH-(CH2)1-20-CO-CH＝CH2(xii)-NH-(CH2)2-20-SH (xiii)-NH-CH(CO2H)-CH2-SH (xiv)其中在化合物(viii)至(xi)的情况下，基团B的自由氨基与间隔基分子Q的自由羧基或固定分子X1的自由羧基，或者基团Q的自由氨基与基团X1的自由羧基相互连接成肽，并且在化合物(xii)至(xiv)的情况下，基团B的自由羧基与间隔基分子Q的自由氨基或固定分子X1的自由氨基，或者基团Q的自由羧基与基团X1的自由氨基相互连接成肽和它们的盐。
类似化合物公开于DE 19932796，DE 19755800和DE 19831710中。
本发明是以发现具有有价值的性质特别是可以用于制备药物的那些性质的新的化合物这一客体为基础的。
发现了式I的化合物和它们的盐具有非常有价值的药学性质，还有好的耐受性。它们特别作为整联蛋白抑制剂起作用，特别抑制αv，β3或β5整联蛋白受体与配体的相互作用，例如血纤蛋白原与β3整联蛋白受体的结合。在整联蛋白αvβ3，αvβ5，αIIbβ3，αvβ1，αvβ6，和αvβ8的情况下，这些化合物表现出特殊活性。
根据例如J.W.Smith等，J.Biol.Chem.265，12267-12271(1990)描述的方法可以证实该作用。P.C.Brooks，R.A.Clark和D.A.Cheresh，Scienee 264，569-71(1994)描述了血管发生进展对血管整联蛋白和胞外基质蛋白之间的相互作用的依赖性。
阻断整联蛋白受体和配体的相互作用，例如血纤蛋白原与血纤蛋白原受体(糖蛋白IIb/IIIa)，的相互作用的式I的化合物，作为GPIIb/IIIa拮抗剂，防止肿瘤细胞通过转移而扩散。这通过下面的观察而证实通过肿瘤细胞与血小板的相互作用通过形成微聚集(微血栓)发生肿瘤细胞从肿瘤病灶向血管系统的扩散。通过微聚集中的保护作用筛选肿瘤细胞，而且免疫系统细胞不识别肿瘤细胞。微聚集接触血管壁，因此更有利于肿瘤细胞向组织的渗透。因为血纤蛋白原与激活的血小板上的血纤蛋白原受体的结合介导微血栓的生成，所以GP IIb/IIIa拮抗剂可以被认作有效的转移抑制剂。
甲基丙烯酸残基用来与例如植入物的生物适应表面共价或吸附结合肽和肽模拟物，所述植入物包含自由丙烯酸或甲基丙烯酸残基，例如聚甲基甲基丙烯酸成型物品(骨胶结剂)或在例如金属表面上含有丙烯酸或甲基丙烯酸层。因此，巯基用来结合肽，例如结合金属表面或者结合含有自由氨基的表面例如胶原(例如利用马来酰亚胺)，和血浆处理过的聚合物或金属表面(参见D.M.Ferris，G.D.Moodie，P.M.Dimond，C.W.D.Giovanni，M.G.Ehrl ich，R.F.Valentini，Biomaterials 20，2323-2331(1999)；D.F.Meyers等，J.Immunol.Methods 121，129-142(1989))或者和经CVD-技术处理过的表面(参见Lahann，J.等，Macromol.Rapid Commun.19，441-444(1998))。
因此本发明涉及通过基团X1官能团与生物适合表面共价或吸附结合的式I的化合物。
在这一点上，参考申请人在同一日期申请的第二个申请，其中基团X1具有另外的意义。
现在根据本发明的肽和肽模拟物利用其包被，主要是被刺激的那些细胞物种的粘着，使得生物材料，特别是所有想得到的器官的植入物的生物功能化成为可能，所述细胞物种在各种情况下应该影响相应的生物材料的组织整合作用。使用这样的包被，能够实现插入到身体之后具有提高的长期稳定性的各种生物材料/植入物的加速和增强的整合作用。
根据本发明的肽选择性结合整联蛋白。在生物适应表面例如植入物上固定之后，它们刺激携带整联蛋白的细胞的粘着。
在表面上包被化合物之后，选择性刺激那些细胞物种以结合，该结合也应该在天然组织中植入之后影响植入物的整合作用，在成骨细胞，破骨细胞和内皮细胞中，这些是例如携带αv-细胞物种。
因此本发明涉及作为植入物中选择性细胞富集的整联蛋白抑制剂的式I的化合物。
固定于作为药物活性物质的生物适应表面之后，可以在人用或兽用药物中使用式I的化合物，特别是它们可以用作治疗植入物引起的疾病，缺陷和炎症的整联蛋白抑制剂，例如生物材料和植入物的，植入物引起的血栓形成的，骨和牙缺陷的，骨质溶解性疾病例如骨质疏松，血栓形成，心肌梗塞，动脉粥样硬化的，促进愈合进程的伤口愈合中的不适和延迟的整合作用，还用于促进和加强植入物或生物适应表面进入组织的整合作用进程。
式I的化合物可以用作在其中使用生物材料，植入物，导管或心脏起搏器的手术中具有杀微生物作用的物质。它们在这里具有抗菌作用。通过P.Valentin-Weigund等，Infection and Immunity，2851-2855(1988)描述的方法可以证明杀微生物活性的效力。
因此本发明涉及用作治疗植入物引起的疾病，缺陷和炎症的，例如骨质疏松，血栓形成，心肌梗塞和动脉粥样硬化的骨质溶解疾病的，还用于促进和加强植入物或生物适应表面进入组织的整合作用进程的整联蛋白抑制剂的式I的化合物。
本发明进一步涉及式I的化合物制备用于治疗植入物引起的疾病，缺陷和炎症，例如骨质疏松，血栓形成，心肌梗塞和动脉粥样硬化的骨质溶解疾病，用于促进和加强植入物或生物适应表面进入组织的整合作用进程的药物的用途。
携带巯基固定基团的相应的肽能够共价连接金-平面载体，例如植入物，亲和色谱或微量滴定平板。
本发明还涉及式I的化合物利用共价或吸附结合来包被用于人或动物器官的植入物的用途。
上文和下文提到的氨基酸残基的缩写表示下面氨基酸残基Abu4-氨基丁酸Aha6-氨基六酸，6-氨基己酸Ala丙氨酸Asn天冬酰胺Asp天冬氨酸Arg精氨酸Cys半胱氨酸Dab2，4-二氨基丁酸Dap2，3-二氨基丙酸Gln谷氨酰胺Glp焦谷氨酸Glu谷氨酸Gly甘氨酸His组氨酸homo-Phe高苯丙氨酸Ile异亮氨酸Leu亮氨酸Lys赖氨酸
Met蛋氨酸Nle正亮氨酸Orn鸟氨酸Phe苯丙氨酸Phg苯基甘氨酸4-Hal-Phe4-卤代-苯丙氨酸Pro脯氨酸Ser丝氨酸Thr苏氨酸Trp色氨酸Tyr酪氨酸Val缬氨酸另外，下面的缩写具有下面的意义Ac乙酰基BOC叔丁氧羰基CBZ或Z苄基氧羰基DCCI二环己基碳化二亚胺DMF二甲基甲酰胺EDCIN-乙基-N，N′-(二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺Et乙基FCA荧光素羧酸FITC荧光素异硫代氰酸酯Fmoc9-芴基甲氧羰基FTH荧光素硫代脲HATUO-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基uronium-六氟磷酸盐HOBt1-羟基苯并三唑Me甲基MBHA4-甲基-二苯甲基胺Mtr4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯基-磺酰基HONSuN-羟基琥珀酰亚胺
OtBu叔丁基酯Oct辛酰基OMe甲酯OEt乙酯POA苯氧乙酰基Pbf五甲基苯并呋喃基Pmc2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基Sal水杨酰基Su丁二酰基TFA三氟乙酸Trt三苯甲基(三苯基甲基)。
如果上述氨基酸可以以多种对映异构体存在，例如，包括上文和下文中所有的这些形式和它们的混合物(例如DL形式)是式I的化合物的一部分。另外，作为式I的化合物的一部分，可以提供带有本身已知的相应的保护基团的氨基酸或自由氨基(xi)或自由羧基(xiv)。总之，例如，在非肽αvβ3拮抗剂情况下进行精氨酸的侧链修饰(例如R.Keenan等，摘要Pap.211th ACS国际会议(NewOrleans，USA)1996，MEDI 236)，也可以在环肽的情况下使用，例如苯并咪唑衍生物代替胍基。
“前体药物衍生物”也包括在根据本发明的化合物中，即例如用烷基或酰基，糖或寡肽修饰的式I的化合物，它们在体内快速裂解，给出根据本发明的活性化合物。这些还包括根据本发明的化合物的生物可降解聚合物衍生物，例如描述于，Int.J.Pharm.115，61-67(1995)。
本发明进一步涉及适合人和动物器官的植入物，由下述组成载体基质和生物活性层，细胞粘着介导的围绕该基质的分子，由式I的化合物形成的包围层，载体基质和该化合物之间存在的共价键或吸附键。优选地，载体基质和/或其表面由金属或金属氧化物或聚合物组成。合适的聚合物优选是聚甲基丙烯酸甲酯，聚羟乙基甲基丙烯酸酯，聚交酯，聚乙二醇酸或者它们的共聚物。
本发明进一步涉及根据本发明的式I的化合物和它的盐的制备方法，特征在于，可以带有保护基团的生物活性分子B，和带有保护基团的间隔基团-固定分子(Q-X1)或者固定分子(X1)彼此以肽的方式连接，然后去除保护基团，和/或特征在于通过用酸或碱处理而将式I的碱性或酸性化合物转化为它的一种盐。
上文和下文中，除非另有说明，基团B，Q和X1具有对于式I指出的定义。
Q不存在或者是有机间隔分子。优选地，这是[CO-(CH2)x-NH-]m-，[CO-CH2-O-CH2CH2)y-NH-]m-，[CO-(CH2)z-CO-]-，[NH-(CH2)z-NH-]-，[CO-CH2-(OCH2CH2)y-O-CH2-CO-]-或[NH-CH2CH2-(OCH2CH2)y-NH-]-基团，和它们的组合，其中权利要求2定义的值的范围适用于m，x，y和z指标。特别有利地提供其中设定m值在1和8之间，x值在1和5之间，并且y和z值在1和6之间的上述化合物。
X1是固定分子，优选选自基团-CO-CH＝CH2，-CO-(CH2)1-20-CO-CH＝CH2，-CO-(CH2)1-20-SH，-CO-CH(NH2)-CH2-SH，-NH-(CH2)1-20-CO-CH＝CH2，-NH-(CH2)2-20-SH，或-NH-CH(CO2H)-CH2-SH。
X优选是H2N-C(＝NH)-NH-，Het-NH-，H2N-C(＝NH)-，A-C(＝NH)-NH或Het基团。
Y优选是-(CH2)n-或 -(CH2)s-CH(R4)-(CH2)t-或-(CH2)p-Het2-(CH2)q-基团。
Z优选是N-R2或CH-R2，其中R2优选是氢原子或具有1-4个碳原子的烷基。
R3优选是氢原子，Ar，Het或A-基团，其中A，Ar和Het具有上文和下文指出的定义之一。
R4优选是氢原子，A，Ar，OH，OA，OAr，芳基烷基，Ha1，CN，NO2，CF3或OCF3基团。芳基烷基优选是苄基，苯乙基，苯丙基，或萘基甲基，特别优选苄基。
A优选是COOH-，NH2-或具有1-6个，优选1，2，3，4，5或6个碳原子的烷基，其是未取代的或者被COOH或NH2取代。A优选是甲基，还有乙基，丙基，正丁基，异丁基，仲丁基，或叔丁基，另外还有正戊基，1-，2-或3-甲基丁基，1，1-，1，2-或2，2-二甲基丙基，1-乙基丙基，己基，1-，2-，3-或4-甲基戊基，1，1-，1，2-，1，3-，2，2-，2，3-或3，3-二甲基丁基，1-或2-乙基丁基，1-乙基-1-甲基丙基，1-乙基-2-甲基丙基，1，1，2-或1，2，2-三甲基丙基。A特别优选甲基。
Ar优选是未取代的或者A，OH，OA，CF3，OCF3，CN，NO2或Hal一取代，二取代或三取代的苯基，其可以被A，OH，OA，NH2，OCF3，CN，NO2或Hal一取代，二取代或三取代的苯基以得到未取代的或者取代的联苯基的这样一种方式取代。
Ar因此优选是苯基，邻-，间-或对-甲基苯基，邻-，间-或对-乙基苯基，邻-，间-或对-丙基苯基，邻-，间-或对-异丙基苯基，邻-，间-或对-叔丁基苯基，邻-，间-或对-羟基苯基，邻-，间-或对-甲氧基苯基，邻-，间-或对-乙氧基苯基，邻-，间-或对-三氟甲基苯基，邻-，间-或对-三氟甲氧基苯基，邻-，间-或对-氟苯基，邻-，间-或对-氯苯基，邻-，间-或对-溴苯基，邻-，间-或对-硝基苯基。
Het是具有5-10个成环原子的饱和的，部分或完全不饱和的一环或二环杂环基团，其中可以存在1-3个N和/或一个S或O原子，并且该杂环基团可以被CN，Hal，OH，NH2，COOH，OA，CF3，A，NO2，Ar或OCF3一取代或二取代。
Het优选是邻-，间-或对-取代的吡啶基，2-，4-，5-或6-取代的嘧啶基或3-，4-，5-或6-取代的哒嗪基，其优选是未取代的或者被甲基，乙基，丙基或甲基氨基，乙基氨基，或丙基氨基取代[涉及提到的所有三种杂芳基]，还有未取代的或者被3-甲基，3-乙基，或3-苄基取代的2-取代的苯并咪唑基，还有2-取代的二氢咪唑基，四氢嘧啶基或四氢吡啶基。
Het优选的例子是 Het1是具有1-4个N和/或S原子的5-或6-元芳香杂环，其可以是未取代的或者被F，Cl，Br，A，OA或OCF3一取代或二取代。
Het1优选是2，4-，3，5-，2，5-二取代吡啶基或2，4-，2，5-，2，6-，或4，6-二取代嘧啶基，2，4-，或2，5-二取代1，3-噁唑基或1，3-噻唑基。
OA优选是甲氧基，乙氧基，丙氧基或丁氧基，还有戊氧基或己氧基。
Hal优选是F，Cl，或Br，还有I。
除非另有说明，指标n，m，o，p，q，s和t具有权利要求1指出的意义。
式I的化合物可以具有一个或多个手性中心，因此存在各种立体异构体形式。式I包括这些所有的形式。
因此，本发明特别涉及其中提到的至少一个基团具有上述优选定义之一的那些式I的化合物。
特别优选的式I的化合物如下a)
b)Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys-Aca-Aca-Cysc)Cys-Aca-Aca-Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lysd)Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys-Aca-Aca-Cyse)Cys-Aca-Aca-Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Argf)Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys-Aca-Aca-Cysg)Cys-Aca-Aca-Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala另外通过本身已知的方法制备式I的化合物还有用于它们的制备的起始物，例如文献中描述的那些技术(例如标准著作中，例如Houben-Weyl，Methoden der organischen Chemie，Georg-Thieme-Verlag，Stuttgart或The Journal of Biological Chemistry，Vol.271，No.44，pp.27221 ff.(1996))，即在已知的并且适合提到的反应的反应条件下进行。在本身已知的变体的情况下也可以使用，但是这里没有更详细地说明。
如果期望，也可以原地制备起始物，这样不用从反应混合物中分离它们，而是立即进一步反应，给出式I的化合物。
在惰性溶剂中进行片段偶联，羧酸片段(丙烯酸酯或巯基连接体)溶解于含有HATU，HOAt和2，4，6-三甲吡啶中，然后用胺片段(线性肽，肽模拟物)处理，反之亦然(连接体＝胺片段；肽/模拟物＝羧酸片段)。
合适的惰性溶剂是例如烃类，例如己烷，石油醚，苯，甲苯，或二甲苯；卤代烃类，例如三氯乙烯，1，2-二氯乙烷，四氯化碳，氯仿，或二氯甲烷；醇类，例如甲醇，乙醇，异丙醇，正丙醇，正丁醇，或叔丁醇；醚类，例如二乙醚，二异丙基醚，四氢呋喃(THF)或二噁烷；二元醇醚类，例如乙二醇一甲基或一乙基醚(甲基乙二醇或乙基乙二醇)，乙二醇二甲醚(二甘醇二甲醚)；酮类，例如丙酮或丁酮；酰胺类，例如乙酰胺，N-甲基吡咯烷酮，二甲基乙酰胺，或二甲酰胺(DMF)；腈类例如乙腈；亚砜类，例如二甲亚砜(DMSO)；二硫化碳；羧酸类，例如甲酸或乙酸；硝基化合物，例如硝基甲烷或硝基苯；酯类，例如乙酸乙酯，水或者提到的溶剂的混合物。
一般操作技术从Aldrich公司，Bachem，Fluka，Neosystem和Novablochem获得这些试剂，不用进一步纯化即可使用。从PepChem公司获得三苯甲基氯/聚苯乙烯树脂(TCP-树脂)。
在Waters and Beckman公司生产的仪器上进行(RP9)-HPLC-分析和半制备分离，使用Knauer and Amersham Pharmacia Biotech生产的仪器(Uvicord)在220nm波长下进行UV检测。下面的柱子材料用于分析(直径4mm)和半制备分离(直径21mm或40mm)NucleosilRP18 5μ，Nucleosil RP18 HD 5μ和Nucleosil RP 18 7μ，购自Macherey& Nagel)。作为洗脱剂，在梯度操作条件下使用各种情况下含有0.1Vol-％TFA的乙腈和水的流动相混合物。
使用购自Finnigan公司的LCQ型仪器进行ESI-质谱。
在Bruker DMX 500上记录NMR-谱。1H和13C化学位移的内标是溶剂DMSO-d52.49ppm(1H-NMR)和39.5ppm(13C-NMR)。
使用从Vetter-Laborbedarf公司(Tübingen)购得的带有PP釉料的10毫升塑料注射管进行固相合成。为了充分混合树脂悬浮液，以大约15rpm从一头到另一头旋转该塑料注射管。排除大气湿度，进行固相上激活的氮杂甘氨酸反应和脒基化反应。
下面的实施例描述利用具有丙烯酸酯固定基团的氮杂-RGD-模拟物多步骤合成根据本发明的化合物。
实施例1Gua-Mab-氮杂Gly-Asp-Hda-εAhx-εAhx-Aca(4)的合成 Gua(Boc)2-Mab-氮杂Gly-Asp(Bu)-OH(1)
已知的多步骤合成之后得到Asp(Bu)-TCP树脂(1.00g，0.6mmol/g，0.6mmol)(参见Gibson，C.；Goodman，S.L.；Hahn，D.；Hlzemann，G.；Kessler，H.，通过Fmoc-方法的氮杂肽和氮杂肽类似物的新的固相合成及其在RGD-模拟物合成中的应用(NovelSolid-Phase Synthesis of Azapeptides and Azapeptoides viaFmoc-Strategy and its Application in the Synthesis of RGD-Mimetics)，J.Org.Chem.1999，64，7388-7394和Gibson，C.；Kessler，H.，在N-芳基-和N-烷基-N-嘧啶-2-基胺的固相合成中2-氟代嘧啶作为有效试剂(2-Fluoropyrimidine as an efficientreagent in solidphase synthesis of N-aryl-and N-alkyl-N-pyrimidin-2-ylamines)，Tetrahydron Lett.2000，41，1725-1728)，化合物1是无色油状物(75.5mg，21％粗产率)。
HPLC(10-90％，30分钟内)Rt＝21.9分钟；ESI-MSm/z 1239.1(30)[2M+Na+]，1217.0(30)[2M+H+]，631.1(30)[M+Na+]，609.0(100)[M+H+]。
Gua(Boc)2-Mab-氮杂Gly-Asp(Bu)-Hda-H(2) Gua(Boc)2-Mab-氮杂Gly-Asp(Bu)-OH(1)(75.2mg，0.123mmol)，HOAt(16.8mg，0.124mmol，1.0当量)和HATU(56.5mg，0.148mmol，1.2当量)溶解于无水DMF(1.5mL)，然后用三甲吡啶(163微升，149mg，1.23mmol，10当量)处理。2小时之后，10℃下剧烈搅拌下向1，6-二氨基己烷(0.287g，2.47mmol，20当量)的DMF(2mL)溶液经5分钟滴加上述溶液。使反应在该温度下进行10分钟，然后在室温下又搅拌70分钟。然后用油泵抽真空浓缩反应混合物。残余物溶解于CH2Cl2(15mL)，并且用H2O(2×15mL)萃取。真空浓缩得到化合物2(82.2mg，95％粗产率)，为棕色固体。
HPLC(10-90％，30分钟内)Rt＝20.1分钟，ESI-MSm/z 1435.2(30)[2M+Na+]，1413.2(30)[2M+H+]，729.2(60)[M+Na+]，707.2(100)[M+H+]。
Gua(Boc)-Mab-氮杂Gly-Asp(Bu)-Hda-εAhx-εAhx-Aca(3a)和Gua(Boc)2-Mab-氮杂Gly-Asp(Bu)-Hda-εAhx-εAhx-Aca(3b)的2∶1混合物 3a R＝H3b R＝Boc6-{[6-(尿膜酸酰基氨基)己酰基]氨基}己酸(Aca-εAhx-εAhx-OH)(69mg，0.23mmol，2.0当量)和HATU(97mg，0.26mmol，2.2当量)溶解于无水DMF(2.5mL)，然后用三甲吡啶(340微升，310mg，2.6mmol，22当量)处理。1小时之后，搅拌下经5分钟滴加Gua(Boc)2-Mab-氮杂Gly-Asp(Bu)-Hda-H(2)(82.0mg，0.116mmol)的DMF(1mL)溶液。2小时之后，用油泵抽真空浓缩反应混合物。残余物溶解于CH2Cl2(1mL)和TFE(250微升)的溶剂混合物，并且缓慢滴加给CH3CN(35mL)，生成无色沉淀，通过离心和倾析去除沉淀。真空去除溶剂并且通过HPLC(30-80％，30分钟内)纯化，得到3a和3b的混合物，HPLC完全比例是2∶1(33.9mg，32％)，为无色固体。
3aHPLC(10-90％，20分钟内)Rt＝11.8分钟，ESI-MSm/z 909.3(70)[M+Na+]，887.3(40)[M+H+]。
3bHPLC(10-90％，20分钟内)Rt＝16.8分钟，ESI-MSm/z 1009.3(90)[M+Na+]。
Gua-Mab-氮杂Gly-Asp-Hda-εAhx-εAhx-Aca(4)3a和3b的2∶1混合物(33mg，36微摩尔)悬浮于CH2Cl2(0.5mL)，然后用95∶5 TFA/H2O混合物处理。1小时之后，真空浓缩反应混合物。用H2O冻干，得到化合物4(29.0mg，95％，有10％去脒基化化合物)，为无色固体。
1H-NMR(500MHz，DMSO)δ＝10.31(s，1H，Ar-CO-NH-NH)，10.02(s，1H，NH-Ar)，8.24(s，1H，Ar-CO-NH-NH)，8.04(mc，1H，CO-NH)7.77(d，J＝7.8Hz，1H，arom)，8.24-7.50(m，8H，2×Ar-H，H2N-CNH2-NH，2×CO-NH)，7.41(d，J＝7.9Hz，1H，arom)，7.17-7.09(m，1H，CO-NH)，6.80(br.s，1H，NH-NH-CO-NH)，6.19(dd，J＝17.2，10.1Hz，1H，CO-CH＝CH2)，6.04(dd，J＝17.1，2.1Hz，1H，CO-CH＝CH顺式H反式)，5.54(dd，J＝10.1，2.1Hz，1H，CO-CH＝CH顺式H反式)，4.42(dt，J＝J′＝7.9Hz，1H，NH-CH-CO)，3.13-2.94(m，8H，4×CO-NH-CH2)AB-信号(δA＝2.63，δB＝2.55，Jab＝16.1，另外插入有JA，H(α)＝5.4Hz和JB，H(α)＝7.2Hz，2H，CH-CH2-CO2H)，2.01(t，J＝7.3Hz，4H，2×CO-CH2)，1.51-1.15(m，20H，aliphat.)；13C-NMR(125.0MHz，DMSO)δ＝172.0，171.83，171.76，170.6.164.4，157.6，155.8，135.6，133.9，131.9，129.8，127.6，125.3，124.7，123.4，50.1，38.7，38.4，38.3，38.2，35.3，29.0，28.9，28.8，26.1，25.9，25.0；HPLC(10-80％，30分钟内)Rt＝10.6分钟；ESI-MSm/z 753.3(10)[M+Na+]，731.3(100)[M+H+]。
B细胞粘着试验实施例研究小鼠MC3T3 H1成骨细胞体外培养物与包被肽的材料表面的粘着。在该项试验中，接种50000细胞/cm2，在37℃/95％大气湿度下在无血清培养基中温育1小时之后，测定粘着细胞的比例。
细胞粘着比例[％]＝粘着细胞/接种细胞×100肽细胞粘着比例[％]Gua-Mab-氮杂Gly-Asp-Hda-εAhx-εAhx-Aca75Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys-Aca-Aca-Cys105
Cys-Aca-Aca-Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys101Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys-Aca-Aca-Cys96Cys-Aca-Aca-Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg17Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys-Aca-Aca-Cys13Cys-Aca-Aca-Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala7现有技术公开了用巯基肽对用牛血清白蛋白(BSA)预包被的聚苯乙烯制成的培养物表面包被(参见DE 19818098(Merck PatentGmbH)，实施例2。DE 19818098，实施例3也描述了用丙烯酸酯肽对PMMA表面的包被。
权利要求
1.式1[sic]的化合物B-Q-X11[sic]其中B是生物活性的细胞粘着-介导的分子，选自 和Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys(ii)Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys(iii)Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys(iv)Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg(v)Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn(vi)Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg(vii)，其中对于(i)X是H2N-C(＝NH)-NH，Het-NH-，H2N-C(＝NH)-，A-C(＝NH)-NH-或Het-，Y是-(CH2)n-或 -(CH2)s-CH(R4)-(CH2)t-或-(CH2)p-Het2-(CH2)q-，Z是N-R2或CH-R2，R2是H或具有1-4个碳原子的烷基，R3是H，Ar，Het或A，R4是H，A，Ar，OH，OA，OAr，芳基烷基，Hal，CN，NO2，CF3或OCF3，A是COOH，NH2或具有1-6个碳原子的烷基，其是未取代的或者被COOH或NH2取代，Ar是未取代的或者被A，OH，NH2，OA，CF3，OCF3，CN，NO2或Hal一取代，二取代或三取代的苯基，其可以被A，OH，OA，OCF3，CN，NO2或Hal一取代，二取代或三取代的苯基以得到未取代的或者取代的联苯基的这样一种方式取代，Hal是F，Cl，Br或I，Het是具有5-10个成环原子的饱和的，部分或完全不饱和的一环或二环杂环基团，其中可以存在1-3个N和/或一个S或O原子，并且该杂环基团可以被CN，Hal，OH，NH2，COOH，OA，CF3，A，NO2，Ar或OCF3一取代或二取代，Het1是具有1-4个N和/或S原子的5-或6-元芳香杂环，其可以是未取代的或者被F，Cl，Br，A，OA或OCF3一取代或二取代，n是4，5或6，m，o，p，q是0，1或2，s，t是0，1，2，3，4，5；Q不存在或者是有机间隔基分子和X1是固定分子，选自-CO-CH＝CH2(viii)-CO-(CH2)1-20-CO-CH＝CH2(ix)-CO-(CH2)1-20-SH (x)-CO-CH(NH2)-CH2-SH (xi)-NH-(CH2)1-20-CO-CH＝CH2(xii)-NH-(CH2)2-20-SH(xiii)-NH-CH(CO2H)-CH2-SH (xiv)其中在化合物(viii)至(xi)的情况下，基团B的自由氨基与间隔基分子Q的自由羧基或固定分子X1的自由羧基，或者基团Q的自由氨基与基团X1的自由羧基相互连接成肽，并且在化合物(xii)至(xiv)的情况下，基团B的自由羧基与间隔基分子Q的自由氨基或固定分子X1的自由氨基，或者基团Q的自由羧基与基团X1的自由氨基相互连接成肽和它们的盐。
2.根据权利要求1的化合物，其中Q选自[CO-(CH2)x-NH-]m-， (xvii)[CO-CH2-O-CH2CH2)y-NH-]m-， (xviii)[CO-(CH2)z-CO-]-， (xix)[NH-(CH2)z-NH-]-， (xx)[CO-CH2-(OCH2CH2)y-O-CH2-CO-]-， (xxi)[NH-CH2CH2-(OCH2CH2)y-NH-]-，(xxii)和它们的组合，其中m在各种情况下各自独立地是1-20，x是1-12，y是1-50，[lacuna]和z是1-12。
3.根据权利要求1的化合物，其中Q选自[CO-(CH2)x-NH-]m-， (xvii)[CO-CH2-O-CH2CH2)y-NH-]m-， (xviii)[CO-(CH2)z-CO-]-， (xix)[NH-(CH2)z-NH-]-， (xx)[CO-CH2-(OCH2CH2)y-O-CH2-CO-]-， (xxi)[NH-CH2CH2-(OCH2CH2)y-NH-]-，(xxii)和它们的组合，其中m在各种情况下各自独立地是1-8，x是1-5，y是1-6，和z是1-6。
4.根据权利要求1的式1[sic]的化合物，其是a) b)Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys-Aca-Aca-Cysc)Cys-Aca-Aca-Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lysd)Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys-Aca-Aca-Cyse)Cys-Aca-Aca-Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Argf)Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys-Aca-Aca-Cysg)Cys-Aca-Aca-Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala
5.根据权利要求1-4之一的作为治疗植入物引起的疾病，缺陷和炎症，例如骨质疏松，血栓形成，心肌梗塞和动脉粥样硬化的骨质溶解疾病，还有用于促进和加强植入物或生物适应表面进入组织的整合作用进程的药物的化合物。
6.适合人和动物器官的植入物，主要由下述组成载体基质和生物活性层，细胞粘着介导的围绕该基质的分子，特征在于包围层由根据权利要求1-4的化合物形成，载体基质和该化合物之间存在共价键或吸附键。
7.根据权利要求6的植入物，特征在于所述载体基质和/或其表面是金属或金属氧化物。
8.根据权利要求6的植入物，特征在于所述载体基质和/或其表面是聚合物。
9.根据权利要求8的植入物，特征在于所述聚合物是聚甲基丙烯酸甲酯，聚羟乙基甲基丙烯酸酯或者它们的共聚物。
10.根据权利要求1的式1[sic]的化合物和它的盐的制备方法，特征在于，可以带有保护基团的生物活性分子B，和带有保护基团的间隔基团-固定分子(Q-X1)或者固定分子(X1)彼此以肽的方式连接，然后去除保护基团，和/或特征在于通过用酸或碱处理而将式I的碱性或酸性化合物转化为它的一种盐。
11.根据权利要求1-4之一的化合物制备用于治疗植入物引起的疾病，缺陷和炎症，例如骨质疏松，血栓形成，心肌梗塞和动脉粥样硬化的骨质溶解疾病，和用于促进和加强植入物或生物适应表面进入组织的整合作用进程的药物的用途。
12.根据权利要求1-4之一的化合物用于利用共价结合或吸附结合包被人和动物器官植入物的用途。
全文摘要
本发明涉及式(I)的化合物B－Q－X
文档编号A61P41/00GK1446230SQ01814101
公开日2003年10月1日 申请日期2001年8月2日 优先权日2000年8月17日
发明者J·梅耶尔, B·尼斯, M·达德, G·赫尔策曼, H·凯斯勒, M·坎特勒纳, U·赫泽尔, C·吉布森, G·舒尔约克 申请人:默克专利股份公司
技术领域：
本发明涉及式I的化合物B-Q-X1(I)其中B是生物活性的细胞粘着-介导的分子，选自 和Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys(ii)Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys(iii)Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys(iv)Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg(v)Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn(vi)Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg(vii)，其中对于(i)X是H2N-C(＝NH)-NH，Het-NH-，H2N-C(＝NH)-，A-C(＝NH)-NH-或Het-，Y是-(CH2)n-或
-(CH2)s-CH(R4)-(CH2)t-或-(CH2)p-Het2-(CH2)q-，Z是N-R2或CH-R2，R2是H或具有1-4个碳原子的烷基，R3是H，Ar，Het或A，R4是H，A，Ar，OH，OA，OAr，芳基烷基，Hal，CN，NO2，CF3或OCF3，A是COOH，NH2或具有1-6个碳原子的烷基，其是未取代的或者被COOH或NH2取代，Ar是未取代的或者被A，OH，NH2，OA，CF3，OCF3，CN，NO2或Hal一取代，二取代或三取代的苯基，其可以被A，OH，OA，OCF3，CN，NO2或Hal一取代，二取代或三取代的苯基以得到未取代的或者取代的联苯基的这样一种方式取代，Hal是F，Cl，Br或I，Het是具有5-10个成环原子的饱和的，部分或完全不饱和的一环或二环杂环基团，其中可以存在1-3个N和/或一个S或O原子，并且该杂环基团可以被CN，Hal，OH，NH2，COOH，OA，CF3，A，NO2，Ar或OCF3一取代或二取代，Het2是具有1-4个N和/或S原子的5-或6-元芳香杂环，其可以是未取代的或者被F，Cl，Br，A，OA或OCF3一取代或二取代，n是4，5或6，m，o，p，q是0，1或2，s，t是0，1，2，3，4，5；Q不存在或者是有机间隔基分子和X1是固定分子，选自-CO-CH＝CH2(viii)-CO-(CH2)1-20-CO-CH＝CH2(ix)-CO-(CH2)1-20-SH (x)-CO-CH(NH2)-CH2-SH(xi)-NH-(CH2)1-20-CO-CH＝CH2(xii)-NH-(CH2)2-20-SH (xiii)-NH-CH(CO2H)-CH2-SH (xiv)其中在化合物(viii)至(xi)的情况下，基团B的自由氨基与间隔基分子Q的自由羧基或固定分子X1的自由羧基，或者基团Q的自由氨基与基团X1的自由羧基相互连接成肽，并且在化合物(xii)至(xiv)的情况下，基团B的自由羧基与间隔基分子Q的自由氨基或固定分子X1的自由氨基，或者基团Q的自由羧基与基团X1的自由氨基相互连接成肽和它们的盐。
类似化合物公开于DE 19932796，DE 19755800和DE 19831710中。
本发明是以发现具有有价值的性质特别是可以用于制备药物的那些性质的新的化合物这一客体为基础的。
发现了式I的化合物和它们的盐具有非常有价值的药学性质，还有好的耐受性。它们特别作为整联蛋白抑制剂起作用，特别抑制αv，β3或β5整联蛋白受体与配体的相互作用，例如血纤蛋白原与β3整联蛋白受体的结合。在整联蛋白αvβ3，αvβ5，αIIbβ3，αvβ1，αvβ6，和αvβ8的情况下，这些化合物表现出特殊活性。
根据例如J.W.Smith等，J.Biol.Chem.265，12267-12271(1990)描述的方法可以证实该作用。P.C.Brooks，R.A.Clark和D.A.Cheresh，Scienee 264，569-71(1994)描述了血管发生进展对血管整联蛋白和胞外基质蛋白之间的相互作用的依赖性。
阻断整联蛋白受体和配体的相互作用，例如血纤蛋白原与血纤蛋白原受体(糖蛋白IIb/IIIa)，的相互作用的式I的化合物，作为GPIIb/IIIa拮抗剂，防止肿瘤细胞通过转移而扩散。这通过下面的观察而证实通过肿瘤细胞与血小板的相互作用通过形成微聚集(微血栓)发生肿瘤细胞从肿瘤病灶向血管系统的扩散。通过微聚集中的保护作用筛选肿瘤细胞，而且免疫系统细胞不识别肿瘤细胞。微聚集接触血管壁，因此更有利于肿瘤细胞向组织的渗透。因为血纤蛋白原与激活的血小板上的血纤蛋白原受体的结合介导微血栓的生成，所以GP IIb/IIIa拮抗剂可以被认作有效的转移抑制剂。
甲基丙烯酸残基用来与例如植入物的生物适应表面共价或吸附结合肽和肽模拟物，所述植入物包含自由丙烯酸或甲基丙烯酸残基，例如聚甲基甲基丙烯酸成型物品(骨胶结剂)或在例如金属表面上含有丙烯酸或甲基丙烯酸层。因此，巯基用来结合肽，例如结合金属表面或者结合含有自由氨基的表面例如胶原(例如利用马来酰亚胺)，和血浆处理过的聚合物或金属表面(参见D.M.Ferris，G.D.Moodie，P.M.Dimond，C.W.D.Giovanni，M.G.Ehrl ich，R.F.Valentini，Biomaterials 20，2323-2331(1999)；D.F.Meyers等，J.Immunol.Methods 121，129-142(1989))或者和经CVD-技术处理过的表面(参见Lahann，J.等，Macromol.Rapid Commun.19，441-444(1998))。
因此本发明涉及通过基团X1官能团与生物适合表面共价或吸附结合的式I的化合物。
在这一点上，参考申请人在同一日期申请的第二个申请，其中基团X1具有另外的意义。
现在根据本发明的肽和肽模拟物利用其包被，主要是被刺激的那些细胞物种的粘着，使得生物材料，特别是所有想得到的器官的植入物的生物功能化成为可能，所述细胞物种在各种情况下应该影响相应的生物材料的组织整合作用。使用这样的包被，能够实现插入到身体之后具有提高的长期稳定性的各种生物材料/植入物的加速和增强的整合作用。
根据本发明的肽选择性结合整联蛋白。在生物适应表面例如植入物上固定之后，它们刺激携带整联蛋白的细胞的粘着。
在表面上包被化合物之后，选择性刺激那些细胞物种以结合，该结合也应该在天然组织中植入之后影响植入物的整合作用，在成骨细胞，破骨细胞和内皮细胞中，这些是例如携带αv-细胞物种。
因此本发明涉及作为植入物中选择性细胞富集的整联蛋白抑制剂的式I的化合物。
固定于作为药物活性物质的生物适应表面之后，可以在人用或兽用药物中使用式I的化合物，特别是它们可以用作治疗植入物引起的疾病，缺陷和炎症的整联蛋白抑制剂，例如生物材料和植入物的，植入物引起的血栓形成的，骨和牙缺陷的，骨质溶解性疾病例如骨质疏松，血栓形成，心肌梗塞，动脉粥样硬化的，促进愈合进程的伤口愈合中的不适和延迟的整合作用，还用于促进和加强植入物或生物适应表面进入组织的整合作用进程。
式I的化合物可以用作在其中使用生物材料，植入物，导管或心脏起搏器的手术中具有杀微生物作用的物质。它们在这里具有抗菌作用。通过P.Valentin-Weigund等，Infection and Immunity，2851-2855(1988)描述的方法可以证明杀微生物活性的效力。
因此本发明涉及用作治疗植入物引起的疾病，缺陷和炎症的，例如骨质疏松，血栓形成，心肌梗塞和动脉粥样硬化的骨质溶解疾病的，还用于促进和加强植入物或生物适应表面进入组织的整合作用进程的整联蛋白抑制剂的式I的化合物。
本发明进一步涉及式I的化合物制备用于治疗植入物引起的疾病，缺陷和炎症，例如骨质疏松，血栓形成，心肌梗塞和动脉粥样硬化的骨质溶解疾病，用于促进和加强植入物或生物适应表面进入组织的整合作用进程的药物的用途。
携带巯基固定基团的相应的肽能够共价连接金-平面载体，例如植入物，亲和色谱或微量滴定平板。
本发明还涉及式I的化合物利用共价或吸附结合来包被用于人或动物器官的植入物的用途。
上文和下文提到的氨基酸残基的缩写表示下面氨基酸残基Abu4-氨基丁酸Aha6-氨基六酸，6-氨基己酸Ala丙氨酸Asn天冬酰胺Asp天冬氨酸Arg精氨酸Cys半胱氨酸Dab2，4-二氨基丁酸Dap2，3-二氨基丙酸Gln谷氨酰胺Glp焦谷氨酸Glu谷氨酸Gly甘氨酸His组氨酸homo-Phe高苯丙氨酸Ile异亮氨酸Leu亮氨酸Lys赖氨酸
Met蛋氨酸Nle正亮氨酸Orn鸟氨酸Phe苯丙氨酸Phg苯基甘氨酸4-Hal-Phe4-卤代-苯丙氨酸Pro脯氨酸Ser丝氨酸Thr苏氨酸Trp色氨酸Tyr酪氨酸Val缬氨酸另外，下面的缩写具有下面的意义Ac乙酰基BOC叔丁氧羰基CBZ或Z苄基氧羰基DCCI二环己基碳化二亚胺DMF二甲基甲酰胺EDCIN-乙基-N，N′-(二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺Et乙基FCA荧光素羧酸FITC荧光素异硫代氰酸酯Fmoc9-芴基甲氧羰基FTH荧光素硫代脲HATUO-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基uronium-六氟磷酸盐HOBt1-羟基苯并三唑Me甲基MBHA4-甲基-二苯甲基胺Mtr4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯基-磺酰基HONSuN-羟基琥珀酰亚胺
OtBu叔丁基酯Oct辛酰基OMe甲酯OEt乙酯POA苯氧乙酰基Pbf五甲基苯并呋喃基Pmc2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基Sal水杨酰基Su丁二酰基TFA三氟乙酸Trt三苯甲基(三苯基甲基)。
如果上述氨基酸可以以多种对映异构体存在，例如，包括上文和下文中所有的这些形式和它们的混合物(例如DL形式)是式I的化合物的一部分。另外，作为式I的化合物的一部分，可以提供带有本身已知的相应的保护基团的氨基酸或自由氨基(xi)或自由羧基(xiv)。总之，例如，在非肽αvβ3拮抗剂情况下进行精氨酸的侧链修饰(例如R.Keenan等，摘要Pap.211th ACS国际会议(NewOrleans，USA)1996，MEDI 236)，也可以在环肽的情况下使用，例如苯并咪唑衍生物代替胍基。
“前体药物衍生物”也包括在根据本发明的化合物中，即例如用烷基或酰基，糖或寡肽修饰的式I的化合物，它们在体内快速裂解，给出根据本发明的活性化合物。这些还包括根据本发明的化合物的生物可降解聚合物衍生物，例如描述于，Int.J.Pharm.115，61-67(1995)。
本发明进一步涉及适合人和动物器官的植入物，由下述组成载体基质和生物活性层，细胞粘着介导的围绕该基质的分子，由式I的化合物形成的包围层，载体基质和该化合物之间存在的共价键或吸附键。优选地，载体基质和/或其表面由金属或金属氧化物或聚合物组成。合适的聚合物优选是聚甲基丙烯酸甲酯，聚羟乙基甲基丙烯酸酯，聚交酯，聚乙二醇酸或者它们的共聚物。
本发明进一步涉及根据本发明的式I的化合物和它的盐的制备方法，特征在于，可以带有保护基团的生物活性分子B，和带有保护基团的间隔基团-固定分子(Q-X1)或者固定分子(X1)彼此以肽的方式连接，然后去除保护基团，和/或特征在于通过用酸或碱处理而将式I的碱性或酸性化合物转化为它的一种盐。
上文和下文中，除非另有说明，基团B，Q和X1具有对于式I指出的定义。
Q不存在或者是有机间隔分子。优选地，这是[CO-(CH2)x-NH-]m-，[CO-CH2-O-CH2CH2)y-NH-]m-，[CO-(CH2)z-CO-]-，[NH-(CH2)z-NH-]-，[CO-CH2-(OCH2CH2)y-O-CH2-CO-]-或[NH-CH2CH2-(OCH2CH2)y-NH-]-基团，和它们的组合，其中权利要求2定义的值的范围适用于m，x，y和z指标。特别有利地提供其中设定m值在1和8之间，x值在1和5之间，并且y和z值在1和6之间的上述化合物。
X1是固定分子，优选选自基团-CO-CH＝CH2，-CO-(CH2)1-20-CO-CH＝CH2，-CO-(CH2)1-20-SH，-CO-CH(NH2)-CH2-SH，-NH-(CH2)1-20-CO-CH＝CH2，-NH-(CH2)2-20-SH，或-NH-CH(CO2H)-CH2-SH。
X优选是H2N-C(＝NH)-NH-，Het-NH-，H2N-C(＝NH)-，A-C(＝NH)-NH或Het基团。
Y优选是-(CH2)n-或 -(CH2)s-CH(R4)-(CH2)t-或-(CH2)p-Het2-(CH2)q-基团。
Z优选是N-R2或CH-R2，其中R2优选是氢原子或具有1-4个碳原子的烷基。
R3优选是氢原子，Ar，Het或A-基团，其中A，Ar和Het具有上文和下文指出的定义之一。
R4优选是氢原子，A，Ar，OH，OA，OAr，芳基烷基，Ha1，CN，NO2，CF3或OCF3基团。芳基烷基优选是苄基，苯乙基，苯丙基，或萘基甲基，特别优选苄基。
A优选是COOH-，NH2-或具有1-6个，优选1，2，3，4，5或6个碳原子的烷基，其是未取代的或者被COOH或NH2取代。A优选是甲基，还有乙基，丙基，正丁基，异丁基，仲丁基，或叔丁基，另外还有正戊基，1-，2-或3-甲基丁基，1，1-，1，2-或2，2-二甲基丙基，1-乙基丙基，己基，1-，2-，3-或4-甲基戊基，1，1-，1，2-，1，3-，2，2-，2，3-或3，3-二甲基丁基，1-或2-乙基丁基，1-乙基-1-甲基丙基，1-乙基-2-甲基丙基，1，1，2-或1，2，2-三甲基丙基。A特别优选甲基。
Ar优选是未取代的或者A，OH，OA，CF3，OCF3，CN，NO2或Hal一取代，二取代或三取代的苯基，其可以被A，OH，OA，NH2，OCF3，CN，NO2或Hal一取代，二取代或三取代的苯基以得到未取代的或者取代的联苯基的这样一种方式取代。
Ar因此优选是苯基，邻-，间-或对-甲基苯基，邻-，间-或对-乙基苯基，邻-，间-或对-丙基苯基，邻-，间-或对-异丙基苯基，邻-，间-或对-叔丁基苯基，邻-，间-或对-羟基苯基，邻-，间-或对-甲氧基苯基，邻-，间-或对-乙氧基苯基，邻-，间-或对-三氟甲基苯基，邻-，间-或对-三氟甲氧基苯基，邻-，间-或对-氟苯基，邻-，间-或对-氯苯基，邻-，间-或对-溴苯基，邻-，间-或对-硝基苯基。
Het是具有5-10个成环原子的饱和的，部分或完全不饱和的一环或二环杂环基团，其中可以存在1-3个N和/或一个S或O原子，并且该杂环基团可以被CN，Hal，OH，NH2，COOH，OA，CF3，A，NO2，Ar或OCF3一取代或二取代。
Het优选是邻-，间-或对-取代的吡啶基，2-，4-，5-或6-取代的嘧啶基或3-，4-，5-或6-取代的哒嗪基，其优选是未取代的或者被甲基，乙基，丙基或甲基氨基，乙基氨基，或丙基氨基取代[涉及提到的所有三种杂芳基]，还有未取代的或者被3-甲基，3-乙基，或3-苄基取代的2-取代的苯并咪唑基，还有2-取代的二氢咪唑基，四氢嘧啶基或四氢吡啶基。
Het优选的例子是 Het1是具有1-4个N和/或S原子的5-或6-元芳香杂环，其可以是未取代的或者被F，Cl，Br，A，OA或OCF3一取代或二取代。
Het1优选是2，4-，3，5-，2，5-二取代吡啶基或2，4-，2，5-，2，6-，或4，6-二取代嘧啶基，2，4-，或2，5-二取代1，3-噁唑基或1，3-噻唑基。
OA优选是甲氧基，乙氧基，丙氧基或丁氧基，还有戊氧基或己氧基。
Hal优选是F，Cl，或Br，还有I。
除非另有说明，指标n，m，o，p，q，s和t具有权利要求1指出的意义。
式I的化合物可以具有一个或多个手性中心，因此存在各种立体异构体形式。式I包括这些所有的形式。
因此，本发明特别涉及其中提到的至少一个基团具有上述优选定义之一的那些式I的化合物。
特别优选的式I的化合物如下a)
b)Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys-Aca-Aca-Cysc)Cys-Aca-Aca-Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lysd)Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys-Aca-Aca-Cyse)Cys-Aca-Aca-Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Argf)Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys-Aca-Aca-Cysg)Cys-Aca-Aca-Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala另外通过本身已知的方法制备式I的化合物还有用于它们的制备的起始物，例如文献中描述的那些技术(例如标准著作中，例如Houben-Weyl，Methoden der organischen Chemie，Georg-Thieme-Verlag，Stuttgart或The Journal of Biological Chemistry，Vol.271，No.44，pp.27221 ff.(1996))，即在已知的并且适合提到的反应的反应条件下进行。在本身已知的变体的情况下也可以使用，但是这里没有更详细地说明。
如果期望，也可以原地制备起始物，这样不用从反应混合物中分离它们，而是立即进一步反应，给出式I的化合物。
在惰性溶剂中进行片段偶联，羧酸片段(丙烯酸酯或巯基连接体)溶解于含有HATU，HOAt和2，4，6-三甲吡啶中，然后用胺片段(线性肽，肽模拟物)处理，反之亦然(连接体＝胺片段；肽/模拟物＝羧酸片段)。
合适的惰性溶剂是例如烃类，例如己烷，石油醚，苯，甲苯，或二甲苯；卤代烃类，例如三氯乙烯，1，2-二氯乙烷，四氯化碳，氯仿，或二氯甲烷；醇类，例如甲醇，乙醇，异丙醇，正丙醇，正丁醇，或叔丁醇；醚类，例如二乙醚，二异丙基醚，四氢呋喃(THF)或二噁烷；二元醇醚类，例如乙二醇一甲基或一乙基醚(甲基乙二醇或乙基乙二醇)，乙二醇二甲醚(二甘醇二甲醚)；酮类，例如丙酮或丁酮；酰胺类，例如乙酰胺，N-甲基吡咯烷酮，二甲基乙酰胺，或二甲酰胺(DMF)；腈类例如乙腈；亚砜类，例如二甲亚砜(DMSO)；二硫化碳；羧酸类，例如甲酸或乙酸；硝基化合物，例如硝基甲烷或硝基苯；酯类，例如乙酸乙酯，水或者提到的溶剂的混合物。
一般操作技术从Aldrich公司，Bachem，Fluka，Neosystem和Novablochem获得这些试剂，不用进一步纯化即可使用。从PepChem公司获得三苯甲基氯/聚苯乙烯树脂(TCP-树脂)。
在Waters and Beckman公司生产的仪器上进行(RP9)-HPLC-分析和半制备分离，使用Knauer and Amersham Pharmacia Biotech生产的仪器(Uvicord)在220nm波长下进行UV检测。下面的柱子材料用于分析(直径4mm)和半制备分离(直径21mm或40mm)NucleosilRP18 5μ，Nucleosil RP18 HD 5μ和Nucleosil RP 18 7μ，购自Macherey& Nagel)。作为洗脱剂，在梯度操作条件下使用各种情况下含有0.1Vol-％TFA的乙腈和水的流动相混合物。
使用购自Finnigan公司的LCQ型仪器进行ESI-质谱。
在Bruker DMX 500上记录NMR-谱。1H和13C化学位移的内标是溶剂DMSO-d52.49ppm(1H-NMR)和39.5ppm(13C-NMR)。
使用从Vetter-Laborbedarf公司(Tübingen)购得的带有PP釉料的10毫升塑料注射管进行固相合成。为了充分混合树脂悬浮液，以大约15rpm从一头到另一头旋转该塑料注射管。排除大气湿度，进行固相上激活的氮杂甘氨酸反应和脒基化反应。
下面的实施例描述利用具有丙烯酸酯固定基团的氮杂-RGD-模拟物多步骤合成根据本发明的化合物。
实施例1Gua-Mab-氮杂Gly-Asp-Hda-εAhx-εAhx-Aca(4)的合成 Gua(Boc)2-Mab-氮杂Gly-Asp(Bu)-OH(1)
已知的多步骤合成之后得到Asp(Bu)-TCP树脂(1.00g，0.6mmol/g，0.6mmol)(参见Gibson，C.；Goodman，S.L.；Hahn，D.；Hlzemann，G.；Kessler，H.，通过Fmoc-方法的氮杂肽和氮杂肽类似物的新的固相合成及其在RGD-模拟物合成中的应用(NovelSolid-Phase Synthesis of Azapeptides and Azapeptoides viaFmoc-Strategy and its Application in the Synthesis of RGD-Mimetics)，J.Org.Chem.1999，64，7388-7394和Gibson，C.；Kessler，H.，在N-芳基-和N-烷基-N-嘧啶-2-基胺的固相合成中2-氟代嘧啶作为有效试剂(2-Fluoropyrimidine as an efficientreagent in solidphase synthesis of N-aryl-and N-alkyl-N-pyrimidin-2-ylamines)，Tetrahydron Lett.2000，41，1725-1728)，化合物1是无色油状物(75.5mg，21％粗产率)。
HPLC(10-90％，30分钟内)Rt＝21.9分钟；ESI-MSm/z 1239.1(30)[2M+Na+]，1217.0(30)[2M+H+]，631.1(30)[M+Na+]，609.0(100)[M+H+]。
Gua(Boc)2-Mab-氮杂Gly-Asp(Bu)-Hda-H(2) Gua(Boc)2-Mab-氮杂Gly-Asp(Bu)-OH(1)(75.2mg，0.123mmol)，HOAt(16.8mg，0.124mmol，1.0当量)和HATU(56.5mg，0.148mmol，1.2当量)溶解于无水DMF(1.5mL)，然后用三甲吡啶(163微升，149mg，1.23mmol，10当量)处理。2小时之后，10℃下剧烈搅拌下向1，6-二氨基己烷(0.287g，2.47mmol，20当量)的DMF(2mL)溶液经5分钟滴加上述溶液。使反应在该温度下进行10分钟，然后在室温下又搅拌70分钟。然后用油泵抽真空浓缩反应混合物。残余物溶解于CH2Cl2(15mL)，并且用H2O(2×15mL)萃取。真空浓缩得到化合物2(82.2mg，95％粗产率)，为棕色固体。
HPLC(10-90％，30分钟内)Rt＝20.1分钟，ESI-MSm/z 1435.2(30)[2M+Na+]，1413.2(30)[2M+H+]，729.2(60)[M+Na+]，707.2(100)[M+H+]。
Gua(Boc)-Mab-氮杂Gly-Asp(Bu)-Hda-εAhx-εAhx-Aca(3a)和Gua(Boc)2-Mab-氮杂Gly-Asp(Bu)-Hda-εAhx-εAhx-Aca(3b)的2∶1混合物 3a R＝H3b R＝Boc6-{[6-(尿膜酸酰基氨基)己酰基]氨基}己酸(Aca-εAhx-εAhx-OH)(69mg，0.23mmol，2.0当量)和HATU(97mg，0.26mmol，2.2当量)溶解于无水DMF(2.5mL)，然后用三甲吡啶(340微升，310mg，2.6mmol，22当量)处理。1小时之后，搅拌下经5分钟滴加Gua(Boc)2-Mab-氮杂Gly-Asp(Bu)-Hda-H(2)(82.0mg，0.116mmol)的DMF(1mL)溶液。2小时之后，用油泵抽真空浓缩反应混合物。残余物溶解于CH2Cl2(1mL)和TFE(250微升)的溶剂混合物，并且缓慢滴加给CH3CN(35mL)，生成无色沉淀，通过离心和倾析去除沉淀。真空去除溶剂并且通过HPLC(30-80％，30分钟内)纯化，得到3a和3b的混合物，HPLC完全比例是2∶1(33.9mg，32％)，为无色固体。
3aHPLC(10-90％，20分钟内)Rt＝11.8分钟，ESI-MSm/z 909.3(70)[M+Na+]，887.3(40)[M+H+]。
3bHPLC(10-90％，20分钟内)Rt＝16.8分钟，ESI-MSm/z 1009.3(90)[M+Na+]。
Gua-Mab-氮杂Gly-Asp-Hda-εAhx-εAhx-Aca(4)3a和3b的2∶1混合物(33mg，36微摩尔)悬浮于CH2Cl2(0.5mL)，然后用95∶5 TFA/H2O混合物处理。1小时之后，真空浓缩反应混合物。用H2O冻干，得到化合物4(29.0mg，95％，有10％去脒基化化合物)，为无色固体。
1H-NMR(500MHz，DMSO)δ＝10.31(s，1H，Ar-CO-NH-NH)，10.02(s，1H，NH-Ar)，8.24(s，1H，Ar-CO-NH-NH)，8.04(mc，1H，CO-NH)7.77(d，J＝7.8Hz，1H，arom)，8.24-7.50(m，8H，2×Ar-H，H2N-CNH2-NH，2×CO-NH)，7.41(d，J＝7.9Hz，1H，arom)，7.17-7.09(m，1H，CO-NH)，6.80(br.s，1H，NH-NH-CO-NH)，6.19(dd，J＝17.2，10.1Hz，1H，CO-CH＝CH2)，6.04(dd，J＝17.1，2.1Hz，1H，CO-CH＝CH顺式H反式)，5.54(dd，J＝10.1，2.1Hz，1H，CO-CH＝CH顺式H反式)，4.42(dt，J＝J′＝7.9Hz，1H，NH-CH-CO)，3.13-2.94(m，8H，4×CO-NH-CH2)AB-信号(δA＝2.63，δB＝2.55，Jab＝16.1，另外插入有JA，H(α)＝5.4Hz和JB，H(α)＝7.2Hz，2H，CH-CH2-CO2H)，2.01(t，J＝7.3Hz，4H，2×CO-CH2)，1.51-1.15(m，20H，aliphat.)；13C-NMR(125.0MHz，DMSO)δ＝172.0，171.83，171.76，170.6.164.4，157.6，155.8，135.6，133.9，131.9，129.8，127.6，125.3，124.7，123.4，50.1，38.7，38.4，38.3，38.2，35.3，29.0，28.9，28.8，26.1，25.9，25.0；HPLC(10-80％，30分钟内)Rt＝10.6分钟；ESI-MSm/z 753.3(10)[M+Na+]，731.3(100)[M+H+]。
B细胞粘着试验实施例研究小鼠MC3T3 H1成骨细胞体外培养物与包被肽的材料表面的粘着。在该项试验中，接种50000细胞/cm2，在37℃/95％大气湿度下在无血清培养基中温育1小时之后，测定粘着细胞的比例。
细胞粘着比例[％]＝粘着细胞/接种细胞×100肽细胞粘着比例[％]Gua-Mab-氮杂Gly-Asp-Hda-εAhx-εAhx-Aca75Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys-Aca-Aca-Cys105
Cys-Aca-Aca-Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys101Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys-Aca-Aca-Cys96Cys-Aca-Aca-Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg17Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys-Aca-Aca-Cys13Cys-Aca-Aca-Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala7现有技术公开了用巯基肽对用牛血清白蛋白(BSA)预包被的聚苯乙烯制成的培养物表面包被(参见DE 19818098(Merck PatentGmbH)，实施例2。DE 19818098，实施例3也描述了用丙烯酸酯肽对PMMA表面的包被。
权利要求
1.式1[sic]的化合物B-Q-X11[sic]其中B是生物活性的细胞粘着-介导的分子，选自 和Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys(ii)Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys(iii)Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys(iv)Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg(v)Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn(vi)Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg(vii)，其中对于(i)X是H2N-C(＝NH)-NH，Het-NH-，H2N-C(＝NH)-，A-C(＝NH)-NH-或Het-，Y是-(CH2)n-或 -(CH2)s-CH(R4)-(CH2)t-或-(CH2)p-Het2-(CH2)q-，Z是N-R2或CH-R2，R2是H或具有1-4个碳原子的烷基，R3是H，Ar，Het或A，R4是H，A，Ar，OH，OA，OAr，芳基烷基，Hal，CN，NO2，CF3或OCF3，A是COOH，NH2或具有1-6个碳原子的烷基，其是未取代的或者被COOH或NH2取代，Ar是未取代的或者被A，OH，NH2，OA，CF3，OCF3，CN，NO2或Hal一取代，二取代或三取代的苯基，其可以被A，OH，OA，OCF3，CN，NO2或Hal一取代，二取代或三取代的苯基以得到未取代的或者取代的联苯基的这样一种方式取代，Hal是F，Cl，Br或I，Het是具有5-10个成环原子的饱和的，部分或完全不饱和的一环或二环杂环基团，其中可以存在1-3个N和/或一个S或O原子，并且该杂环基团可以被CN，Hal，OH，NH2，COOH，OA，CF3，A，NO2，Ar或OCF3一取代或二取代，Het1是具有1-4个N和/或S原子的5-或6-元芳香杂环，其可以是未取代的或者被F，Cl，Br，A，OA或OCF3一取代或二取代，n是4，5或6，m，o，p，q是0，1或2，s，t是0，1，2，3，4，5；Q不存在或者是有机间隔基分子和X1是固定分子，选自-CO-CH＝CH2(viii)-CO-(CH2)1-20-CO-CH＝CH2(ix)-CO-(CH2)1-20-SH (x)-CO-CH(NH2)-CH2-SH (xi)-NH-(CH2)1-20-CO-CH＝CH2(xii)-NH-(CH2)2-20-SH(xiii)-NH-CH(CO2H)-CH2-SH (xiv)其中在化合物(viii)至(xi)的情况下，基团B的自由氨基与间隔基分子Q的自由羧基或固定分子X1的自由羧基，或者基团Q的自由氨基与基团X1的自由羧基相互连接成肽，并且在化合物(xii)至(xiv)的情况下，基团B的自由羧基与间隔基分子Q的自由氨基或固定分子X1的自由氨基，或者基团Q的自由羧基与基团X1的自由氨基相互连接成肽和它们的盐。
2.根据权利要求1的化合物，其中Q选自[CO-(CH2)x-NH-]m-， (xvii)[CO-CH2-O-CH2CH2)y-NH-]m-， (xviii)[CO-(CH2)z-CO-]-， (xix)[NH-(CH2)z-NH-]-， (xx)[CO-CH2-(OCH2CH2)y-O-CH2-CO-]-， (xxi)[NH-CH2CH2-(OCH2CH2)y-NH-]-，(xxii)和它们的组合，其中m在各种情况下各自独立地是1-20，x是1-12，y是1-50，[lacuna]和z是1-12。
3.根据权利要求1的化合物，其中Q选自[CO-(CH2)x-NH-]m-， (xvii)[CO-CH2-O-CH2CH2)y-NH-]m-， (xviii)[CO-(CH2)z-CO-]-， (xix)[NH-(CH2)z-NH-]-， (xx)[CO-CH2-(OCH2CH2)y-O-CH2-CO-]-， (xxi)[NH-CH2CH2-(OCH2CH2)y-NH-]-，(xxii)和它们的组合，其中m在各种情况下各自独立地是1-8，x是1-5，y是1-6，和z是1-6。
4.根据权利要求1的式1[sic]的化合物，其是a) b)Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys-Aca-Aca-Cysc)Cys-Aca-Aca-Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lysd)Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys-Aca-Aca-Cyse)Cys-Aca-Aca-Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Argf)Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys-Aca-Aca-Cysg)Cys-Aca-Aca-Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala
5.根据权利要求1-4之一的作为治疗植入物引起的疾病，缺陷和炎症，例如骨质疏松，血栓形成，心肌梗塞和动脉粥样硬化的骨质溶解疾病，还有用于促进和加强植入物或生物适应表面进入组织的整合作用进程的药物的化合物。
6.适合人和动物器官的植入物，主要由下述组成载体基质和生物活性层，细胞粘着介导的围绕该基质的分子，特征在于包围层由根据权利要求1-4的化合物形成，载体基质和该化合物之间存在共价键或吸附键。
7.根据权利要求6的植入物，特征在于所述载体基质和/或其表面是金属或金属氧化物。
8.根据权利要求6的植入物，特征在于所述载体基质和/或其表面是聚合物。
9.根据权利要求8的植入物，特征在于所述聚合物是聚甲基丙烯酸甲酯，聚羟乙基甲基丙烯酸酯或者它们的共聚物。
10.根据权利要求1的式1[sic]的化合物和它的盐的制备方法，特征在于，可以带有保护基团的生物活性分子B，和带有保护基团的间隔基团-固定分子(Q-X1)或者固定分子(X1)彼此以肽的方式连接，然后去除保护基团，和/或特征在于通过用酸或碱处理而将式I的碱性或酸性化合物转化为它的一种盐。
11.根据权利要求1-4之一的化合物制备用于治疗植入物引起的疾病，缺陷和炎症，例如骨质疏松，血栓形成，心肌梗塞和动脉粥样硬化的骨质溶解疾病，和用于促进和加强植入物或生物适应表面进入组织的整合作用进程的药物的用途。
12.根据权利要求1-4之一的化合物用于利用共价结合或吸附结合包被人和动物器官植入物的用途。
全文摘要
本发明涉及式(I)的化合物B－Q－X
文档编号A61P41/00GK1446230SQ01814101
公开日2003年10月1日 申请日期2001年8月2日 优先权日2000年8月17日
发明者J·梅耶尔, B·尼斯, M·达德, G·赫尔策曼, H·凯斯勒, M·坎特勒纳, U·赫泽尔, C·吉布森, G·舒尔约克 申请人:默克专利股份公司
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