有整联蛋白抑制剂性质的肽和肽模拟结合物的制作方法
专利名称：有整联蛋白抑制剂性质的肽和肽模拟结合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及式I化合物及其盐B-Q-X1I式中B是一种生物活性的细胞粘附介导分子，Q不存在或者是一种有机间隔分子，和X1是一种锚固分子，选自基团-Lys-(CO-CH2-(CH2)n-PO3H2)2(i)-Lys-[Lys-(CO-CH2-(CH2)n-PO3H2)2]2(ii)或-Lys-(Lys[-Lys-(CO-CH2-(CH2)n-PO3H2)2]2)2(iii)，且n在每种情况下都彼此独立地是0、1、2或3，其中，基团B的一个游离氨基和间隔分子Q或锚固分子X1的一个游离羧基，或者基团Q的一个游离氨基和基团X1的一个游离羧基彼此像肽一样连接。
类似的化合物公开于DE 19932796、DE 19755800和DE 19831710中。
本发明是以寻找有宝贵性质的新型化合物、尤其可用于医药生产的化合物的目标为基础的。
已经发现，式I化合物及其盐有非常有价值的药理学性质，兼备良好的可耐受性。它们尤其可用作整联蛋白抑制剂，具体地说，抑制αvβ3或αvβ5整联蛋白受体与配体的相互作用，例如纤维蛋白原与β3整联蛋白受体的结合。这些化合物在整联蛋白αvβ3、αvβ5、αIIbβ3、αvβ1、αvβ6和αvβ8的情况下显示特定的活性。
这种作用可以，例如，按照J.W.Smithetal.在J.Biol.Chem.265，12267-12271(1990)中所述的方法证实。
P.C.Brooks，R.A.Clark和D.A.Cheresh在Science264，569-71(1994)描述了血管形成的发展对血管整联蛋白与细胞外基质蛋白之间的相互作用的依赖性。P.C.Brooks，A.M.Montgomery，M.Rosenfeld，R.A.Reisfeld，T.-Hu，G.Klier和D.A.Cheresh在Cell79，1157-64(1994)描述了借助于环状肽抑制这种相互作用从而诱导血管形成性血管细胞的凋亡的可能性。
能阻断整联蛋白受体与配体的相互作用例如纤维蛋白原与纤维蛋白原受体(糖蛋白IIb/IIIa)的相互作用的式I化合物，作为GPIIb/IIIa拮抗剂，防止了肿瘤细胞通过转移扩散。
肿瘤细胞从局部肿瘤向血管系统中的扩散是通过肿瘤细胞与血小板的相互作用而经由微聚集体(微血栓)的形成发生的。肿瘤细胞因在微聚集体中的保护而受屏蔽，而且不被免疫系统的细胞所认识。这些微聚集体会附着到血管壁上，因此，有利于肿瘤细胞进一步穿透到该组织中。
由于微血栓的形成是通过结合到活化血小板上的纤维蛋白原受体的纤维蛋白原传递的，因而，GPIIb/IIIa拮抗药可以视为有效的转移抑制剂。
磷酸基用来使这些肽离子型地或吸附性地结合到诸如含有氧化物的植入物的生物相容性表面上，例如金属表面(如钛或钛合金例如TiAl6V4)，或含阳离子的表面，例如无定形或烧结磷酸钙(如羟基磷灰石、骨骼、牙齿)或磷酸钙粘固剂(如Biocement D)。
因此，本发明具体地涉及用于通过X1的官能团与生物相容性表面进行离子型或吸附性结合用的式I化合物。
现在，本发明的肽使得生物材料、尤其人体和动器的植入物的生物机能化借助于其涂层成为可能，主要是使那些在每一种情况下都应当影响该对应生物材料的整合的受刺激细胞种类的粘附成为可能。利用这样的涂层，可以实现各种在掺入体内之后具有改善的长期稳定性的生物材料/植入物的整合加速和强化。
本发明的肽解选择性地结合整联蛋白。在固定到生物相容性表面例如植入物上之后，它们刺激携带整联蛋白的细胞的粘附。
在该化合物涂布到这些表面上之后，就会选择性地刺激那些也应影响植入物在植入天然组织中之后的整合的细胞种类的结合。在成骨细胞、破骨细胞和内皮细胞中，这些是例如携带αv的细胞种类。
因此，本发明涉及作为植入物中用于选择性富集细胞的整联蛋白抑制剂的式I化合物。
在锚固到生物相容性表面上之后，作为药物活性化合物，式I化合物可以用于人体医药和兽医药中，具体地说，它们可以作为整联蛋白抑制剂用于治疗植入物引起的疾病、缺陷和炎症，例如生物材料和植入物的整合不足和延迟，植入物引起的血栓形成、骨骼和牙齿缺损、以及溶骨性疾病例如骨质疏松症、血栓形成、心肌梗塞、动脉硬化，用于帮助愈合过程的创伤愈合，也用于加速和增强该植入物或生物相容性表面整合到该组织中的过程。
式I化合物可以作为有抗微生物作用的物质用于使用生物材料、植入物、导管或心脏起搏器的手术。在此，它们有防腐作用。抗微生物活性的药效可以用P.Valentin-Weigund et al.，在Infection andImmunity，2851-2855(1988)中所述的程序证实。
因此，本发明涉及作为整联蛋白抑制剂的式I化合物，它用于治疗植入物引起的疾病、缺乏和炎症，治疗溶骨性疾病例如骨质疏松症、血栓形成、心肌梗塞和动脉硬化，也用于加速和增强植入物或生物相容性表面与组织的整合过程。
本发明一步涉及式I化合物在制造一种药物中的用途，该药物用于治疗植入物引起的疾病、缺陷和炎症，治疗溶骨性疾病例如骨质疏松症、血栓形成、心肌梗塞和动脉硬化，以及用于加速和增强植入物或生物相容性表面整合到组织中的过程。
携带膦酸锚固剂的对应肽可以离子型地结合到具有含氧化物表面的载体例如植入物、亲和色谱材料、或微量滴定板上，或结合到含阳离子表面上例如无定形或烧结磷酸钙(例如羟基磷灰石、骨骼、牙齿)或者磷酸钙粘固剂(例如Bio-cement D)上。
本发明也涉及式I化合物用于通过离子型或吸附型结合而涂布人和动物器官的植入物的用途。
以上和以下提到的氨基酸残基的缩略语代表下列氨基酸基团Abu 4-氨基丁酸Aha 6-氨基己酸Ala 丙氨酸Asn 天冬酰胺Asp 天冬氨酸Arg 精氨酸Cys 半胱氨酸Dab 2，4-二氨基丁酸DaP 2，3-二氨基丙酸Gln 谷氨酰胺Glp 焦谷氨酸Glu 谷氨酸Gly 甘氨酸His 组氨酸homo-Phe 高苯丙氨酸Ile 异亮氨酸Leu 亮氨酸Lys 赖氨酸Met 甲硫氨酸Nle 正亮氨酸Orn 鸟氨酸Phe 苯丙氨酸Phg 苯甘氨酸4-Hal-Phe 4-卤代苯丙氨酸Pro 脯氨酸Ser 丝氨酸Thr 苏氨酸Trp 色氨酸Tyr 酪氨酸Val 缬氨酸此外，以下缩略语的含义如下Ac乙酰基BOC 叔丁氧羰基CBZ或Z苄氧羰基DCCI 二环己基碳二亚胺DMF 二甲基甲酰胺EDCI N-基-N，N’-二(二甲基氨基丙基)碳二亚胺Et乙基FCA 荧光素羧酸FITC 荧光素异硫氰酸酯Fmoc 9-芴基甲氧羰基FTH荧光素硫脲HOBt 1-羟基苯并三唑Me 甲基MBHA 4-甲基二苯甲胺Mtr4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰基HATU 0-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲·六氟磷酸盐HONSu N-羟基琥珀酰亚胺OtBu 叔丁酯Oct辛酰基OMe甲酯OEt乙酯POA苯氧乙酰基Pbf五甲基苯并呋喃基Pmc2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基Sal水杨酰基Su 琥珀酰基TIPS 三异丙基甲硅烷TFA三氟乙酸TMSBr 三甲基甲硅烷基溴Trt三苯甲基如果以上提到的氨基酸能以多种对映体形式出现，则所有这些形式及其混合物(例如DL形式)在以上和以下都作为式I化合物的一部分包括在内。此外，可以给诸如作为式I化合物的氨基酸提供本身已知的对应保护基团。
首先，诸如在非肽αvβ3拮抗剂的情况下进行的精氨酸侧链修饰(例如R.Keenan et al.，Abstr.Pap.211th ACS National Meeting(New Orleans，USA)1996，MEDI236)也可以用于环状肽例如除胍基外的苯并咪唑衍生物的情况。
在本发明的化合物中也包括“药物前体衍生物”，即能在体内迅速裂解而给出本发明的活性化合物的、用诸如烷基或酰基、糖或寡肽修饰的式I化合物。
本发明进一步涉及一种适用于人体和动物器官的植入物，其组成为一种载体基质和围绕这种基质的一层生物活性的细胞粘附介导分子，该围绕层是从式I化合物形成的，而且在载体基质与这种化合物之间存在一种离子键或吸附键。优选地，该载体基质和/或其表面由一种金属或金属氧化物组成。特别优选的是，该载体基质和/或其表面由一种骨骼或牙齿代用材料例如磷酸钙混合物组成。
本发明进一步涉及权利要求1的式I化合物及其盐的制备工艺，其特征在于，使一种可以被提供保护基团的生物活性分子B和一种提供了保护基团的间隔-锚固分子(Q-X1)或锚固分子(X1)彼此以肽方式连接，然后脱除保护基团，和/或在于，使式I[sic]的一种碱性或酸性化合物通过用一种酸或碱处理转化成其盐之一。
在以上和以下，基团B、Q和X1具有式I所指出的含义，除非另有专门说明。
B优选是一种环状-(Arg-Gly-Asp-Z1)-， Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys-，Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys-，Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys-，Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-，Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-或一种Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-残基，式中Z1在每一种情况下都彼此独立地是一种氨基残基或者一种二肽或三肽残基，且其中氨基酸彼此独立地选自下列组成的一组Ala，Asn，Asp，Arg，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Homo-Phe，Ile，Leu，Lys，Orn，Met，Phe，Phg，Pro，Ser， Thr，Trp，Tyr，Val。
Q不存在或者是一种有机间隔分子。优选，这是一个m-，[CO-CH2(O-CH2CH2)y-NH-]m-， [CO-(CH2)z-CO-]-，[NH-(CH2)z-NH-]-，[CO-CH2-(OCH2CH2)y-O-CH2-CO-]-或一个[NH-CH2CH2-(OCH2CH2)y-NH-]-基团及其组合，其中，权利要求3中主张的数值范围适用于指数m、x、y和z。以上提到的、m可以采用1-8的值、x可以采用1-5的值、y和z可以采用1-6的值的化合物已经证明是特别有利的。
X1是一种锚固分子，优选来自基团-Lys-(CO-CH2-(CH2)n-PO3H2)2，-Lys-[Lys-(CO-CH2-(CH2)n-PO3H2)2]2或-Lys-(Lys[-Lys-(CO-CH2-(CH2)n-PO3H2)2]2)2，式中n因情况而异，可以彼此独立地是0、1、2、或3。
在Z1的含义中提到的氨基酸和氨基酸残基也可以是衍生化的，且优选是N-甲基、N-乙基、N-丙基、N-苄基或Cα甲基衍生物。也优选的是Asp和Glu的衍生物，特别是侧链羧基的甲酯、乙酯、丙酯、丁酯、叔丁酯、新戊酯或苄酯，以及Arg的衍生物，Arg可以在-NH-C(＝NH)-NH2基团上被乙酰基、苯甲酰基、甲氧羰基或乙氧羰基取代。
X优选是H2N-C(＝NH)-NH-，Het-NH-，H2N-C(＝NH)-，A-C(＝NH)-NH或一个Het基团。Y优选是-(CH2)n-或 -(CH2)s-CH(R4)-(CH2)t-或-(CH2)p-Het1(CH2)q-基团。
Z优选是N-R2或CH-R2，其中R2优选可以是H原子或有1-4个C原子的烷基。
R3优选是一个H原子、Ar、Het或A基团，其中A、Ar和Het有以上或以下指出的含义之一。
R4优选是一个H原子、A、Ar、OH、OA、OAr、芳烷基、Hal、CN、NO2、CF3或OCF3基团。芳烷基优选是苄基、苯乙基、苯丙基或萘甲基，特别优选的是苄基。
A优选是COOH、NH2或有1-6个C原子的烷基，该烷基是无取代的或者被COOH或NH2取代的。A优选是甲基，进而是乙基、丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基，此外也可以是正戊基，1-，2-或3-甲基丁基，1，1-、1，2-或2，2-二甲基丙基，1-乙基丙基，己基，1-、2-、3-或4-甲基戊基，1，1-、1，2-、1，3-、2，2-、2，3-或3，3-二甲基丁基，1-或2-乙基丁基，1-乙基-1-甲基丙基，1-乙基-2-甲基丙基，1，1，2-或1，2，2-三甲基丙基。A特别优选是甲基。
Ar优选是苯基，该苯基是无取代的或者被A、OH、OA、CF3、OCF3、CN、NO2或Hal一取代、二取代或三取代，该苯基还可以被苯基以能产生一种无取代或有取代的联苯基这样一种方式取代，后一个苯基被A、OH、OA、NH2、OCF3、CN、NO2或Hal一取代、二取代或三取代。
因此，Ar优选是苯基，邻、间或对甲基苯基，邻、间或对乙基苯基，邻、间或对丙基苯基、邻、间或对异丙基苯基，邻、间或对叔丁基苯基，邻、间或对羟基苯基，邻、间或对甲氧基苯基，邻、间或对乙氧基苯基，邻、间或对三氟甲基苯基，邻、间或对三氟甲氧基苯基，邻、间或对氟苯基，邻、间或对氯苯基，邻、间或对溴苯基，邻、间或对硝基苯基，邻、间或对氨基苯基。
Het是一个饱和的、部分不饱和的或完全不饱和的单环式或双环式5元-10元杂环基，其中可以存在1-3个N和/或1个S或O原子，且该杂环基可以被CN、Hal、OH、NH2、COOH、OA、CF3、A、NO2、Ar或OCF3-取代或二取代。
Het优选是一个有邻、间或对位取代的吡啶基，一个有2-、4-、5-或6-取代的嘧啶基，或一个有3-、4-、5-或6-取代的哒嗪基，它们优选是无取代的或者被一个甲基、乙基或丙基或者一个甲基氨基、乙基氨基或丙基氨基取代[涉及所提到的所有三种杂芳香族]，以及一个2-取代的苯并咪唑基，它是无取代的或者被一个3-甲基、3-乙基或3-苄基取代，以及被一个2-取代的二氢咪唑基、四氢嘧啶或四氢吡啶基取代。
Het中优选含有的实例是 Het1是一个有1-4个N、O和/或S原子的5元或6元芳香族杂环，该杂环可以是无取代的或者是被F、Cl、Br、A、OA或OCF3-取代或二取代。
Het1优选是一个2，4-、3，5-或2，5-二取代的吡啶基，或一个2，4-、2，5-、2，6-或4，6-二取代的嘧啶基，一个2，4-或2，5-二取代的1，3-噁唑基或1，3-噻唑基。
OA优选是甲氧基、乙氧基、丙氧基或丁氧基，此外，也可以是戊氧基或乙氧基。
Hal优选是F、Cl或Br，但也可以是I。
指数n、m、o、p、q、s和t有权利要求2中指出的含义，除非另有专门说明。
式I化合物可以有一个或多个手性中心，因此，呈各种不同的立体异构体形式。式I包括所有这些形式。
因此，本发明具体地涉及那些其中所提到的基团中至少一种有以上所指出的优选含义之一的式I化合物。
特别优选的式I化合物是下列a)环状-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(NεH-[CO-(CH2)5-NH]2-Lys-[Lys-(CO-CH2-(CH2)n-PO3H2)2]2))；b)环状-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(NεH-[CO-(CH2)5-NH]3-Lys-[Lys-(CO-CH2-(CH2)n-PO3H2)2]2))；c)环状-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(NεH-[CO-CH2(-O-CH2CH2)6-NH]2-Lys-[Lys-(CO-CH2-(CH2)n-PO3H2)2]2))；
式中n是1。
式I化合物及其制备用起始物质还可以用本身已知的方法例如文献上所述(如见标准著作，例如Houben-Weyl，Methoden derorganischen Chemie[Methods of Organic Chemistry]，Georg-Thieme-Verlag，Stuttgart；)即在已知的和适用于所提到的反应的反应条件下制备的。在这种情况下也可以使用本身已知的变化，但在此不予赘述。
如果希望，该起始物质也可以就地生成，使得它们不从反应混合物中分离出来，而是立即进行一步反应以给出式I化合物。
片段偶合或配体与接头之间的偶合一般是在惰性溶剂进行的，把羧酸片段(膦酸接头，例如HO-[CO-(CH2)5-NH]2-Lys-[Lys-(CO-CH2-CH2-PO3(C2H5)2)2]2)溶解于有HATU、HOAt和2，4，6-三甲基吡啶的DMF中，再用一种胺片段(环状肽，例如c[R((Pbf)G(OtBu)fK])处理。
适用惰性溶剂是，例如，烃如乙烷、石油醚、苯、甲苯或二甲苯；氯代烃如三氯乙烯、1，2-二氯乙烷、四氯化碳、氯仿或二氯甲烷；醇如甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇、正丁醇或叔丁醇；醚如二乙醚、二异丙醚、四氢呋喃(THF)或二噁烷；二醇醚如乙二醇-甲醚或-乙醚、乙二醇二甲醚(diglyme)；酮如丙酮或丁酮；酰胺如乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二甲基乙酰胺或二甲基甲酰胺(DMF)；腈如乙腈；亚砜如二甲基亚砜(DMSO)、二硫化碳；羧酸如甲酸或乙酸；硝基化合物如硝基甲烷或硝基苯；酯如乙酸乙酯，水或所提到的溶剂的混合物。
环状化合物可以通过线型化合物的环化来制备，例如，DE 43 10643、Houben-Weyl，1.c.，卷15/II，pp.1-806(1974)或S.Zimmer，E.Hoffmann，G.Jung和H.Kessler，Liebig’s Ann.Chem.1993，497-501中所述。线型肽可以，例如，按照R.B.Merrifield，Angew.Chemie 1985m，97，801-812进行合成。
开链线型化合物例如式I化合物还可以用惯常的氨基酸和肽合成方法，例如，按照Merrifield(也见，例如，B.F.Gysin和R.B.Merrifie1d，J.Am.Chem.Soc.94，3012ff.(1972))的固相合成法制备。
式I化合物还可以通过溶剂解尤其水解或通过氢解而使其从其功能衍生物中释放来获得。
溶剂解或氢解用的优选起始物质是那些不含一个或多个游离氨基和/或羟基，而是含有相应的被保护的氨基和/或羧基者，优选是那些不携带与N原子键合的H原子而携带氨基保护基团者，例如那些与式I对应但不含NH2基团而含有NHR’基团(其中，R’是氨基保护基团，例如BOC或CBZ团)者。
进而，起始物质优选是那些不携带羟基的H原子而携带羟基保护基者，例如那些与式I对应但不含羟苯基基团而含有R”O-苯基基团(其中，R”是羟基保护基团)者。
在该起始物质的分子中，也可以存在多个相同或不同的受保护氨基和/或羟基基团。若所存在的保护基团彼此不同，则在很多情况下它们可以选择性地脱除。
“氨基保护基团”这一表达是普遍知道的，而且涉及那些适用于保护(封闭)氨基基团免于化学反应但在该分子中其它位置上进行了所希望的化学反应之后可以容易地脱除的基团。这种类型的典型基团，具体地说，是无取代的或有取代的酰基、芳基、芳烷氧甲基或芳烷基基团。由于保护基团是在所希望的反应(或反应序列)之后脱除的，因而，其性质和大小本来并不重要；然而，优选的是那些有1-20个、尤其1-8个C原子者。“酰基基团”之一表达要在最广泛的意义上与本发明的工艺联系起来解释。它包括从脂肪族、芳脂族、芳香族或杂环族羧酸或磺酸衍生的酰基基团，具体地说，也包括烷氧羰基、芳氧羰基、尤其芳烷氧羰基。这种类型的酰基基团实例是链烷酰基例如乙酰基、丙酰基、丁酰基；芳烷酰基例如苯乙酰基；芳酰基例如苯甲酰基或甲基苯甲酰基；芳氧基链烷酰基例如POA；烷氧羰基例如甲氧羰基、乙氧羰基、2，2，2-三氯乙氧羰基、BOC、2-碘乙氧羰基；芳烷氧羰基例如CBZ(“苄酯基”)、4-甲氧基苄氧羰基、FMOC；芳基磺酰基例如Mtr、Pbf或Pmc。优选的氨基保护基团是BOC和Mtr，此外还有CBZ、Fmoc、苄基和乙酰基。
“羟基保护基团”这一表达同样是普遍知道的，而且涉及那些适用于保护羟基基团免于化学反应但在该分子中其它位置上已经进行了所希望的化学反应之后可容易地脱除的基团。这种类型的典型基团是以上提到的无取代或有取代芳基、芳烷基或酰基基团，此外还有烷基基团。该羟基保护基的性质和大小并不重要，因为它们在所希望的化学反应或反应序列之后还要脱除；优选的是含有1-20个、尤其1-10个C原子的基团。羟基保护基实例，除其它外，有苄基、对硝基苄基、对甲苯磺酰基、叔丁基和乙酰基，特别好的是苄基和叔丁基。天冬氨酸和谷氨酸中的COOH优选以其叔丁酯的形式(例如Asp(OtBu))保护。
式I化合物从其功能衍生物中的释放，因所使用的保护基团而异，是诸如使用强酸、适宜地使用TFA或过氯酸、但也使用其它强无机酸例如盐酸或硫酸、强有机羧酸例如三氯乙酸或磺酸例如苯磺或对苯磺酸进行的。额外惰性溶剂的存在是可以的，但并非总是必要的。适用惰性溶剂优选是有机溶剂，例如，羧酸如乙酸、醚如四氢呋喃或二噁烷、酰胺如DMF、卤代烃如二氯甲烷，此外还有醇如甲醇、乙醇或异丙醇，以及水。此外，以上所述溶剂的混合物也是适用的。TFA优选以过量使用而不添加进一步的溶剂，过氯酸优选以乙酸与70％过氯酸之比为9∶1的混合物形式使用。裂解反应温度适当地在大约0℃与大约50℃之间，反应优选在15℃-30℃之间(室温)进行。
基团BOC、OtBu和Mtr可以，例如，优选用TFA在二氯甲烷中、或用大约3-5N HCl在二噁烷中于15-30℃脱除，FMOC基团可以使用二甲胺、二乙胺或哌啶在DMF中的大约5-50％溶液于15-30℃脱除。
三苯甲基基团用于组氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和半胱氨酸等氨基酸的保护。因所希望的最终产物而异，脱除是用TFA/10％苯硫酚进行的，三苯甲基基团从以上提到的所有氨基酸上脱除；当使用TFA/茴香醚、TFA/硫代茴香醚或TFA/TIPS/H2O时，三苯甲基基团只从His、Asn和Gln上脱除，但仍留在Cys侧链上。
Pbf(五甲基苯并呋喃基)基团用于保护Arg。脱除是，例如，用TFA在二氯甲烷中进行的。
可氢解脱除的保护基团(例如CBZ或苄基)可以，例如，通过在一种催化剂(例如一种贵金属催化剂如钯，适当地载带于一种载体如碳上)的存在下用氢处理来脱除。在这种情况下，适用溶剂是以上指出的那些，具体地说，例如，醇类如甲醇或乙醇，或酰胺类如DMF。通常，氢解是在大约0℃-100℃之间的温度和大约1-200巴之间的压力、优选在10-30℃和1-10巴进行。例如，CBZ基团的氢解在甲醇中用5-10％Pd/C或者在甲醇/DMF中用甲酸铵(代替氢)和Pt/C于10-30℃容易地进行。
式I的碱可以用一种酸，例如通过相当量的该酸和该碱在一种惰性溶剂如乙醇中反应和随后的蒸发，转化成相关的酸加成盐。可用于此反应的酸，具体地说，是那些能给出生理上可接受盐者。因此，可以使用无机酸例如硫酸、硝酸、氢卤酸如盐酸或氢溴酸、磷酸如正磷酸、氨基磺酸、此外还可以使用有机酸，具体地说，脂肪族、脂环族、芳脂族、芳香族或杂环的一元或多元羧酸、磺酸或硫酸，例如甲酸、乙酸、丙酸、新戊酸、二乙基乙酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、富马酸、马来酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、葡糖酸、抗坏血酸、烟酸、酸异烟酸、甲磺酸或乙磺酸、乙二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、萘-磺酸和萘二磺酸、十二烷基硫酸。与生理上不可接受酸的盐例如苦味酸盐可以用于式I化合物的分离和/或纯化。
另一方面，式I的酸可以通过与一种碱反应而转化成其生理上可接受金属盐或铵盐之一。在这种情况下，适用盐具体地是钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、铵盐，以及有取代铵盐例如二甲铵盐、二乙铵盐或二异丙铵盐、一乙醇铵盐、二乙醇铵盐或二异丙醇铵盐，环己基铵盐或二环己基铵盐，二苄基乙二铵盐，进而，例如，精氨酸或赖氨酸的盐。
以上和以下所有温度都用℃表示。在下列实施例中，“惯常后处理”系指必要时加水，必要时因最终产物的构成而异把该混合物调整到2-10之间的pH且用乙酸乙酯或二氯甲烷萃取，将有机相分离、用硫酸钠干燥、蒸发，残渣用硅胶色谱法和/或结晶法纯化。硅胶柱的Rf值洗脱剂为乙酸乙酯/甲醇＝9∶1。
在下列系统中在HPLC上的RT＝保留时间(分钟)[A]柱YMC ODS A RP 5C18，250×4.6mm洗脱剂A0.1％TFA水溶液洗脱剂B0.1％TFA乙腈溶液流动速率1ml/min梯度0-50％B/30min。同[A]
梯度5-50％B/30min。同[A]；梯度10-50％B/30min。
质谱法(MS)EI(电子撞击电离)M+FAB(快原子轰击)(M+H)+ESI(电喷电离)(M+H)+DMPP树脂代表4-(2’，4’-二甲氧基苯基羟甲基)苯氧基树脂，它使得能够诸如合成有侧链保护的肽；TCP树脂系指三苯甲基氯-聚苯乙烯树脂。
下列实施例一方面描述片段偶合和膦酸酯裂解，另一方面描述所选择的有膦酸接头的环状肽衍生物的合成。借助于实施例7-9，详细解释了用金属或骨骼代用材料制成的各种成形物品的涂布工艺。
实施例1溶液中的片段偶合将0.2mmol羧酸片段(膦酸衍接物，例如HO-[CO-(CH2)5-NH]2-Lys-[Lys-(CO-CH2-CH2-PO3(C2H5)2)2]2)，0.98eq HATU，1.1eq HOAT和10eq2，4，6-三甲基吡啶溶解于2mlDMF中。1.5小时后，添加1eq胺片段(环状肽，例如c[R(Pbf)G(OtBu)fK])。混合物在室温下搅拌24小时，产物用制备型HPLC纯化。
实施例2膦酸酯在膦酸接头上裂解有膦酸酯基团的肽溶解于或适当时悬浮于无水CHCl3与TMSBr的10∶1混合物的超声波浴中。在超声波浴中搅拌3天且适当时偶尔使沉淀物浆状化之后，将溶剂蒸出。残渣冻干脱H2O。
用惯常技术脱除酸性侧链保护基团。
实施例3膦酸接头的合成按照Fmoe方法，用固相肽合成法合成了膦酸接头(见G.B.Fields，R.L.Nobie，Int.J.Pept.ProteinRes.1990，35，161-214)。
偶合的最后一个结构单元是3-(二乙基膦酰基)丙酸。
3-(二乙基膦酰基)丙酸的合成3-溴丙酸苄酯在一个配备氯化钙管的250ml圆底烧瓶中，在搅拌下，使58.3mmol 3-溴丙酰氯(10.0g)和1eq苄醇(6.3g)溶解于100ml干燥DCM中。2天后，向该混合物中添加200ml CHCl3，有机相用饱和NaHCO3溶液萃取2次。用MgSO4干燥后蒸出溶剂，得到无色液体状产品。
产率13.8g(56.8mmol，97％)Rf＝0.75(H∶EA 1∶1).NMR(CDCl3)1H(250MHz)δ＝7.35(s，5H；H ar)，5.16(s，2H；CH2-OCO)，3.58(t，3J(H，H)＝7Hz，2H；CH2Br)，2.95(t，3J(H，H)＝7Hz，2H；CH2CO).GC-MSm+＝242.0.
3-(二乙基磷酰基)丙酸苄酯在一个以压力平衡用气球密封的蒸馏装置中，在搅拌下，将56.8mmol 3-溴丙酸苄酯(13.8g)和1.7eq亚磷酸三乙酯(16.0g)加热到140℃。反应期间生成的溴乙烷连续蒸出并收集在一冷却到0℃的接收瓶中。4小时后，剩余的油状残留物在高真空下经由Vigreux柱分馏；产物是无色油状物。
产率12.1g(40.3mmol，71％)，稍有杂质，Rf＝0.33(A∶H＝2∶3)。
为了提高纯度，产物适当时可用急骤色谱法(洗脱剂A∶H＝2∶3)纯化。NMR(CDCl3)1H(250MHz)＝7.31(s，5H；H ar)，5.10(s，2H，CH2-OCO)，4.05(m，4H；CH2OP)，2.61(m，2H；CH2CO)，2.04(m，2H；CH2P)，1.26(t，3J(H，H)＝7Hz，6H；CH3).31P(101.256MHz)δ＝28.5(s).GC-MSm+＝300.0.
3-(二乙基膦酰基)丙酸将40.3mmol 3-(二乙基膦酰基)丙酸苄酯(12.1g)溶解于100ml乙醇中，添加2g催化剂(5％Pd/C)。在H2气氛下搅拌4小时后，把活性炭滤出、并蒸出溶剂。得到无色油状产物，该产物在室温下慢慢凝固成一种无色固体。该产物稍微沾染3-(二乙基膦酰基)丙酸乙酯，后者适当时可通过与水和乙烷一起摇荡若干次而转移到有机相中和去除。
产率8.2g(39.0mmol，97％).NMR(CDCl3)1H(250MHz)δ＝10.6O(bs，1H；COOH)，4.07(m，4H；CH2O)，2.59(m，2H；CH2CO)，2.06(m，2H；CH2P)，1.29(t，3J(H，H)＝7Hz，6H；CH3).13C(62.896MHz)δ＝174.5(d，J(C，P)＝18.5Hz；COOH)，62.1(d，J(C，P)＝6.6Hz；CH2-O)，27.1(d，J(C，P)＝3.8Hz；CH2-COOH)，2.07(d，J(C，P)＝144.9Hz；CH2-P)，16.2(d，J(C，P)＝6.1Hz；CH3).31P(101.256MHz)δ＝29.5(s).
有膦酸接头的环状肽的分析数据实施例4(间隔物中的2-氨基乙酸)环状-(Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys(NεH-[CO-(CH2)5-NH]2-Lys-[Lys-(CO-CH2-CH2-PO3H2)2]2))MS(ESI)m/z(％)1756.9(100)[m-H+]，1778.8(48)[m+Na+-2H+]，1794.9(18)[m+K+-2H+].NMR([D6]DMSO)31P(101.256MHz)δ＝29.63(s，1P)，29.59(s，1P)，29.57(s，1P)，29.38(s，1P).
实施例5(间隔物中的3-氨基己酸)环状-(Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys(NεH-[CO-(CH2)5-NH]3-Lys-[Lys-(CO-CH2-CH2-PO3H2)2]2))MS(ESI)m/z(％)934.9(100)[m-2H+]，1870.O(27)[m-H+].NMR([D6]DMSO)31P(101.256MHz)δ＝29.57(s，1P)，29.51(s，2P)，29.33(s，1P).
实施例6(间隔物中的2-七甘醇氨基羧酸)环状-(Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys(NεH-[CO-CH2(-O-CH2CH2)6-NH]2-Lys-[Lys-(CO-CH2-CH2-PO3H2)2]2))MS(ESI)m/z(％)1086.4(100)[m-2H+]，1097.7(73)[m+Na+-3H+].NMR([D6]DMSO)31P(101.256MHz)δ＝29.66(s，1P)，29.61(s，1P)，29.59(s，1P)，29.45(s，1P).
此外，以上提到的肽全部都用1H NMR谱法(250MHz)表征，并得到预期谱图。
实施例7直径10mm且高1-2mm的Ti或TiAl6V4成形物品用60℃蒸馏水于超声波浴中预清洗15分钟，然后用丙酮洗涤30分钟，然后用蒸馏水洗涤2次，并在烘箱中干燥8小时。
将该成形物品转移到48孔板(Costar公司，“所处理的非组织培养物”Art.No.3574)。为了使生物活性的细胞粘附介导分子B(其中，B可以是按照权利要求2的一种环状肽、肽模拟物或线型肽)附着到所准备的成形物品上，制备一种含有分子B的储备溶液(“B溶液”)，使其在缓冲剂水溶液Tris-HCl(10mM，pH8.7)、Tris-HClO4(10mM，pH8.7)或PBS(pH7.4)之一中的最终浓度的1mM。然后，用PBS(pH7.4)稀释，配制在每种情况下“B溶液”最终浓度为1nm、10nm、100nm、1μm、10μm和100μm的浓度系列。该成形物品每一个都覆盖250μl各B溶液，然后在室温下培养18-24小时。为了除去未结合的B分子，各样品用PBS(pH7.4)洗涤3次，并在PBS(pH7.4)中于4℃贮存过程。
通过添加250μl 5％BSA(牛血清清蛋白)溶液(pH7.4)到每一个成形物品上、然后在室温下培养2小时、用PBS(pH7.4)洗涤一次，使非特异性细胞结合位点封闭。
用对应缓冲溶液(Tris-HCl 10mM，pH8.7；Tris-HClO410mM，pH8.7；PBS，pH7.4)代替B溶液处理的Ti和TiAl6V4成形物品用来作为阴性对照组。
这些成形物品上所得到涂层的程度通过分析进行评价，生物学活性是借助于细胞粘附试验体外确定的。
实施例8通过切削出直径10mm的圆柱体、随后用Buehler ISOMET低速锯锯成厚度100μm，生产直径10mm、高度100μm、作为天然骨骼代用材料模型的象牙状物品。然后，这些样品用60℃蒸馏水在超声波浴中清洗10分钟，此后用蒸馏水洗涤2次，在烘箱中干燥8小时。
用B溶液涂布成形物品的程序同实施例7中所述。
这些成形物品上所得到涂层的程度通过分析进行评价，生物学活性是借助于细胞粘附试验体外确定的。
实施例9通过切削出直径10mm的圆柱体、随后用Buehler ISOMET低速锯锯成厚度100μm，生产直径10mm、高度100μm、商业上可得骨骼代用材料Endobone(购自Biomet Merek公司，德国)的成形物品。然后，这些样品用60℃蒸馏水在超声波浴中清洗10分钟，此后用蒸馏水洗涤2次，在烘箱中干燥8小时。
这些成形物品上所得到涂层的程度通过分析进行评价，生物学活性是借助于细胞粘附试验体外确定的。
细胞粘附试验实施例研究了小鼠MC3T3 H1成骨细胞培养物在体外条件下对有RGD肽涂层的材料表面的粘附。在这种试验中，接种50000细胞/cm2，并在无血清培养基中于37℃/95％大气湿度下培养1小时之后确定粘附细胞的比例。
细胞粘附率[％]＝粘附细胞/接种细胞×100肽细胞粘附率[％]环状-(Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys(NεH-[CO-(CH2)5-NH]2-Lys-[Lys-(CO-CH2-CH2-PO3H2)2]2))75环状-(Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys(NεH-[CO-(CH2)5-NH]3-Lys-[Lys-(CO-CH2-CH2-PO3H2)2]2))6权利要求
1.式I化合物及其盐B-Q-X1I式中B是一种生物活性的细胞粘附介导分子，Q不存在或者是一种有机间隔分子，和X1是一种锚固分子，选自基团-Lys-(CO-CH2-(CH2)n-PO3H2)2(i)-Lys-[Lys-(CO-CH2-(CH2)n-PO3H2)2]2(ii)或-Lys-(Lys[-Lys-(CO-CH2-(CH2)n-PO3H2)2]2)2(iii)，且n在每种情况下都彼此独立地是0、1、2或3，其中，基团B的一个游离氨基和间隔分子Q或锚固分子X1的一个游离羧基，或者基团Q的一个游离氨基和基团X1的一个游离羧基彼此像肽一样连接。
2.按照权利要求1的化合物，其中，基团B选自基团环状-(Arg-Gly-Asp-Z1) (iv) 和Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys (vi)Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys (vii)Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys (viii)Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg (ix)Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn (x)Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg (xi)式中Z1在每种情况下都彼此独立地是一种氨基酸残基或一种二肽或三肽残基，其中，该氨基酸彼此独立地选自下列组成的一组Ala，Asn，Asp，Arg，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Homo-Phe，Ile，Leu，Lys，Met，Orn，Phe，Phg，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，Val，其中，对于(v)来说X是H2N-C(＝NH)-NH，Het-NH-，H2N-C(＝NH)-，A-C(＝NH)-NH-或Het-，Y是-(CH2)n-或 -(CH2)s-CH(R4)-(CH2)t-或-(CH2)p-Het1(CH2)q-，Z是N-R2或CH-R2，R2是H或有1-4个C原子的烷基，R3是H，Ar，Het或A，R4是H，A，Ar，OH，OA，OAr，芳烷基，Hal，CN，NO2，CF3或OCF3，A是COOH、NH2、或者有1-6个C原子的无取代或被COOH或NH2取代的烷基，Ar是无取代的或者被A、OH、OA、CF3、OCF3、CN、NO2或Hal一取代、二取代或三取代的苯基，该苯基还可以被苯基以能产生一种无取代或有取代的联苯基这样一种方式取代，后一个苯基被A、OH、OA、NH2、OCF3、CN、NO2或Hal一取代、二取代或三取代，Hal是F、Cl、Br或I，Het是一种饱和的、部分不饱和的或完全不饱和的单环式或双环式的有5-10元的杂环基，其中可以存在1-3个N和/或1个S或O原子，且该杂环基可以被CN、Hal、OH、NH2、COOH、OA、CF3、A、NO2、Ar或OCF3一取代或二取代，Het1是一种有1-4个N和/或S原子的5元或6元芳香族杂环，该杂环可以是无取代的或者被F、Cl、Br、A、OA或OCF3一取代或二取代，n是4，5或6，m，o，p，q是0，1或2，s，t是0，1，2，3，4或5
3.按照权利要求1或2的化合物，其中，Q选自基团[CO-(CH2)x-NH-]m， (xii)[CO-CH2(-O-CH2CH2)y-NH-]m(xiii)[CO-(CH2)z-CO-](xiv)[NH-(CH2)z-NH-](xv)[CO-CH2-(OCH2CH2)y-O-CH2-CO-](xvi)[NH-CH2CH2-(OCH2CH2)y-NH-] (xvii)及其组合其中，m在每种情况下都彼此独立地是1-20，x是1-12，y是1-50且z是1-12。
4.按照权利要求1或2的化合物，其中，Q选自基团[CO-(CH2)x-NH-]m， (xviii)[CO-CH2(-O-CH2CH2)y-NH-]m(xix)[CO-(CH2)z-CO-] (xx)[NH-(CH2)z-NH-] (xxi)[CO-CH2-(OCH2CH2)y-O-CH2-CO-] (xxii)[NH-CH2CH2-(OCH2CH2)y-NH-](xxiii)及其组合其中m在每种情况下都彼此独立地是1-8，x是1-5，y是1-6且z是1-6。
5.按照权利要求1的式1[sic]化合物a)环状-(Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys(NεH-[CO-(CH2)5-NH]2-Lys-[Lys-(CO-CH2-(CH2)n-PO3H2)2]2))；b)环状-(Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys(NεH-[CO-(CH2)5-NH]3-Lys-[Lys-(CO-CH2-(CH2)n-PO3H2)2]2))；c)环状-(Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys(NεH-[CO-CH2(-O-CH2CH2)6-NH]2-Lys-[Lys-(CO-CH2-(CH2)n-PO3H2)2]2))；其中n是1。
6.按照权利要求1-5之一的化合物，作为药剂，用于治疗植入物引起的疾病、缺陷和炎症，治疗溶骨性疾病例如骨质疏松症、血栓形成、心肌梗塞和动脉硬化，也用于加速和增强植入物或生物相容性表面整合到组织中的过程。
7.适用于人体和动物器官的植入物，由一种载体基质和围绕这种基质的一层生物活性的细胞粘附介导分子组成，其特征在于，该围绕层是从按照权利要求1-5的化合物形成的，在载体基质与这种化合物之间存在一种离子键或吸附键。
8.按照权利要求7的植入物，其特征在于，该载体基质和/或其表面是一种金属或一种金属氧化物。
9.按照权利要求7的植入物，其特征在于，该载体基质和/或其表面是一种骨骼或牙齿代用材料。
10.按照权利要求9的植入物，其特征在于，该骨骼或牙齿代用材料由磷酸钙混合物组成。
11.按照权利要求1的化合物及其盐的制备工艺，其特征在于，使一种可以被提供保护基团的生物活性分子B与一种提供了保护基团的间隔-锚固分子(Q-X1)或锚固分子(X1)彼此以肽方式连接，然后脱除该保护基团，和/或在于，使式I的碱性或酸性化合物通过用一种酸或碱处理而转化成其盐之一。
12.按照权利要求1-5之一的化合物在制造一种药物中的用途，该药物用于治疗植入物引起的疾病、缺陷和炎症，治疗溶骨性疾病例如骨质疏松症、血栓形成、心肌梗塞和动脉硬化，也用于加速和增强植入物或生物相容性表面整合到组织中的过程。
13.按照权利要求1-5之一的化合物用于通过离子型或吸附型结合而涂布人体和动物器官的植入物的用途。
全文摘要
本发明涉及式(I)B－Q－X
文档编号A61P19/10GK1447699SQ01814238
公开日2003年10月8日 申请日期2001年8月2日 优先权日2000年8月17日
发明者J·迈尔, B·尼斯, M·达尔, G·霍尔茨曼, H·凯斯勒, M·康德莱纳, U·埃尔泽尔, C·吉布森, G·苏尔约克 申请人:默克专利股份公司
技术领域：
本发明涉及式I化合物及其盐B-Q-X1I式中B是一种生物活性的细胞粘附介导分子，Q不存在或者是一种有机间隔分子，和X1是一种锚固分子，选自基团-Lys-(CO-CH2-(CH2)n-PO3H2)2(i)-Lys-[Lys-(CO-CH2-(CH2)n-PO3H2)2]2(ii)或-Lys-(Lys[-Lys-(CO-CH2-(CH2)n-PO3H2)2]2)2(iii)，且n在每种情况下都彼此独立地是0、1、2或3，其中，基团B的一个游离氨基和间隔分子Q或锚固分子X1的一个游离羧基，或者基团Q的一个游离氨基和基团X1的一个游离羧基彼此像肽一样连接。
类似的化合物公开于DE 19932796、DE 19755800和DE 19831710中。
本发明是以寻找有宝贵性质的新型化合物、尤其可用于医药生产的化合物的目标为基础的。
已经发现，式I化合物及其盐有非常有价值的药理学性质，兼备良好的可耐受性。它们尤其可用作整联蛋白抑制剂，具体地说，抑制αvβ3或αvβ5整联蛋白受体与配体的相互作用，例如纤维蛋白原与β3整联蛋白受体的结合。这些化合物在整联蛋白αvβ3、αvβ5、αIIbβ3、αvβ1、αvβ6和αvβ8的情况下显示特定的活性。
这种作用可以，例如，按照J.W.Smithetal.在J.Biol.Chem.265，12267-12271(1990)中所述的方法证实。
P.C.Brooks，R.A.Clark和D.A.Cheresh在Science264，569-71(1994)描述了血管形成的发展对血管整联蛋白与细胞外基质蛋白之间的相互作用的依赖性。P.C.Brooks，A.M.Montgomery，M.Rosenfeld，R.A.Reisfeld，T.-Hu，G.Klier和D.A.Cheresh在Cell79，1157-64(1994)描述了借助于环状肽抑制这种相互作用从而诱导血管形成性血管细胞的凋亡的可能性。
能阻断整联蛋白受体与配体的相互作用例如纤维蛋白原与纤维蛋白原受体(糖蛋白IIb/IIIa)的相互作用的式I化合物，作为GPIIb/IIIa拮抗剂，防止了肿瘤细胞通过转移扩散。
肿瘤细胞从局部肿瘤向血管系统中的扩散是通过肿瘤细胞与血小板的相互作用而经由微聚集体(微血栓)的形成发生的。肿瘤细胞因在微聚集体中的保护而受屏蔽，而且不被免疫系统的细胞所认识。这些微聚集体会附着到血管壁上，因此，有利于肿瘤细胞进一步穿透到该组织中。
由于微血栓的形成是通过结合到活化血小板上的纤维蛋白原受体的纤维蛋白原传递的，因而，GPIIb/IIIa拮抗药可以视为有效的转移抑制剂。
磷酸基用来使这些肽离子型地或吸附性地结合到诸如含有氧化物的植入物的生物相容性表面上，例如金属表面(如钛或钛合金例如TiAl6V4)，或含阳离子的表面，例如无定形或烧结磷酸钙(如羟基磷灰石、骨骼、牙齿)或磷酸钙粘固剂(如Biocement D)。
因此，本发明具体地涉及用于通过X1的官能团与生物相容性表面进行离子型或吸附性结合用的式I化合物。
现在，本发明的肽使得生物材料、尤其人体和动器的植入物的生物机能化借助于其涂层成为可能，主要是使那些在每一种情况下都应当影响该对应生物材料的整合的受刺激细胞种类的粘附成为可能。利用这样的涂层，可以实现各种在掺入体内之后具有改善的长期稳定性的生物材料/植入物的整合加速和强化。
本发明的肽解选择性地结合整联蛋白。在固定到生物相容性表面例如植入物上之后，它们刺激携带整联蛋白的细胞的粘附。
在该化合物涂布到这些表面上之后，就会选择性地刺激那些也应影响植入物在植入天然组织中之后的整合的细胞种类的结合。在成骨细胞、破骨细胞和内皮细胞中，这些是例如携带αv的细胞种类。
因此，本发明涉及作为植入物中用于选择性富集细胞的整联蛋白抑制剂的式I化合物。
在锚固到生物相容性表面上之后，作为药物活性化合物，式I化合物可以用于人体医药和兽医药中，具体地说，它们可以作为整联蛋白抑制剂用于治疗植入物引起的疾病、缺陷和炎症，例如生物材料和植入物的整合不足和延迟，植入物引起的血栓形成、骨骼和牙齿缺损、以及溶骨性疾病例如骨质疏松症、血栓形成、心肌梗塞、动脉硬化，用于帮助愈合过程的创伤愈合，也用于加速和增强该植入物或生物相容性表面整合到该组织中的过程。
式I化合物可以作为有抗微生物作用的物质用于使用生物材料、植入物、导管或心脏起搏器的手术。在此，它们有防腐作用。抗微生物活性的药效可以用P.Valentin-Weigund et al.，在Infection andImmunity，2851-2855(1988)中所述的程序证实。
因此，本发明涉及作为整联蛋白抑制剂的式I化合物，它用于治疗植入物引起的疾病、缺乏和炎症，治疗溶骨性疾病例如骨质疏松症、血栓形成、心肌梗塞和动脉硬化，也用于加速和增强植入物或生物相容性表面与组织的整合过程。
本发明一步涉及式I化合物在制造一种药物中的用途，该药物用于治疗植入物引起的疾病、缺陷和炎症，治疗溶骨性疾病例如骨质疏松症、血栓形成、心肌梗塞和动脉硬化，以及用于加速和增强植入物或生物相容性表面整合到组织中的过程。
携带膦酸锚固剂的对应肽可以离子型地结合到具有含氧化物表面的载体例如植入物、亲和色谱材料、或微量滴定板上，或结合到含阳离子表面上例如无定形或烧结磷酸钙(例如羟基磷灰石、骨骼、牙齿)或者磷酸钙粘固剂(例如Bio-cement D)上。
本发明也涉及式I化合物用于通过离子型或吸附型结合而涂布人和动物器官的植入物的用途。
以上和以下提到的氨基酸残基的缩略语代表下列氨基酸基团Abu 4-氨基丁酸Aha 6-氨基己酸Ala 丙氨酸Asn 天冬酰胺Asp 天冬氨酸Arg 精氨酸Cys 半胱氨酸Dab 2，4-二氨基丁酸DaP 2，3-二氨基丙酸Gln 谷氨酰胺Glp 焦谷氨酸Glu 谷氨酸Gly 甘氨酸His 组氨酸homo-Phe 高苯丙氨酸Ile 异亮氨酸Leu 亮氨酸Lys 赖氨酸Met 甲硫氨酸Nle 正亮氨酸Orn 鸟氨酸Phe 苯丙氨酸Phg 苯甘氨酸4-Hal-Phe 4-卤代苯丙氨酸Pro 脯氨酸Ser 丝氨酸Thr 苏氨酸Trp 色氨酸Tyr 酪氨酸Val 缬氨酸此外，以下缩略语的含义如下Ac乙酰基BOC 叔丁氧羰基CBZ或Z苄氧羰基DCCI 二环己基碳二亚胺DMF 二甲基甲酰胺EDCI N-基-N，N’-二(二甲基氨基丙基)碳二亚胺Et乙基FCA 荧光素羧酸FITC 荧光素异硫氰酸酯Fmoc 9-芴基甲氧羰基FTH荧光素硫脲HOBt 1-羟基苯并三唑Me 甲基MBHA 4-甲基二苯甲胺Mtr4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰基HATU 0-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲·六氟磷酸盐HONSu N-羟基琥珀酰亚胺OtBu 叔丁酯Oct辛酰基OMe甲酯OEt乙酯POA苯氧乙酰基Pbf五甲基苯并呋喃基Pmc2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基Sal水杨酰基Su 琥珀酰基TIPS 三异丙基甲硅烷TFA三氟乙酸TMSBr 三甲基甲硅烷基溴Trt三苯甲基如果以上提到的氨基酸能以多种对映体形式出现，则所有这些形式及其混合物(例如DL形式)在以上和以下都作为式I化合物的一部分包括在内。此外，可以给诸如作为式I化合物的氨基酸提供本身已知的对应保护基团。
首先，诸如在非肽αvβ3拮抗剂的情况下进行的精氨酸侧链修饰(例如R.Keenan et al.，Abstr.Pap.211th ACS National Meeting(New Orleans，USA)1996，MEDI236)也可以用于环状肽例如除胍基外的苯并咪唑衍生物的情况。
在本发明的化合物中也包括“药物前体衍生物”，即能在体内迅速裂解而给出本发明的活性化合物的、用诸如烷基或酰基、糖或寡肽修饰的式I化合物。
本发明进一步涉及一种适用于人体和动物器官的植入物，其组成为一种载体基质和围绕这种基质的一层生物活性的细胞粘附介导分子，该围绕层是从式I化合物形成的，而且在载体基质与这种化合物之间存在一种离子键或吸附键。优选地，该载体基质和/或其表面由一种金属或金属氧化物组成。特别优选的是，该载体基质和/或其表面由一种骨骼或牙齿代用材料例如磷酸钙混合物组成。
本发明进一步涉及权利要求1的式I化合物及其盐的制备工艺，其特征在于，使一种可以被提供保护基团的生物活性分子B和一种提供了保护基团的间隔-锚固分子(Q-X1)或锚固分子(X1)彼此以肽方式连接，然后脱除保护基团，和/或在于，使式I[sic]的一种碱性或酸性化合物通过用一种酸或碱处理转化成其盐之一。
在以上和以下，基团B、Q和X1具有式I所指出的含义，除非另有专门说明。
B优选是一种环状-(Arg-Gly-Asp-Z1)-， Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys-，Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys-，Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys-，Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-，Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-或一种Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-残基，式中Z1在每一种情况下都彼此独立地是一种氨基残基或者一种二肽或三肽残基，且其中氨基酸彼此独立地选自下列组成的一组Ala，Asn，Asp，Arg，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Homo-Phe，Ile，Leu，Lys，Orn，Met，Phe，Phg，Pro，Ser， Thr，Trp，Tyr，Val。
Q不存在或者是一种有机间隔分子。优选，这是一个m-，[CO-CH2(O-CH2CH2)y-NH-]m-， [CO-(CH2)z-CO-]-，[NH-(CH2)z-NH-]-，[CO-CH2-(OCH2CH2)y-O-CH2-CO-]-或一个[NH-CH2CH2-(OCH2CH2)y-NH-]-基团及其组合，其中，权利要求3中主张的数值范围适用于指数m、x、y和z。以上提到的、m可以采用1-8的值、x可以采用1-5的值、y和z可以采用1-6的值的化合物已经证明是特别有利的。
X1是一种锚固分子，优选来自基团-Lys-(CO-CH2-(CH2)n-PO3H2)2，-Lys-[Lys-(CO-CH2-(CH2)n-PO3H2)2]2或-Lys-(Lys[-Lys-(CO-CH2-(CH2)n-PO3H2)2]2)2，式中n因情况而异，可以彼此独立地是0、1、2、或3。
在Z1的含义中提到的氨基酸和氨基酸残基也可以是衍生化的，且优选是N-甲基、N-乙基、N-丙基、N-苄基或Cα甲基衍生物。也优选的是Asp和Glu的衍生物，特别是侧链羧基的甲酯、乙酯、丙酯、丁酯、叔丁酯、新戊酯或苄酯，以及Arg的衍生物，Arg可以在-NH-C(＝NH)-NH2基团上被乙酰基、苯甲酰基、甲氧羰基或乙氧羰基取代。
X优选是H2N-C(＝NH)-NH-，Het-NH-，H2N-C(＝NH)-，A-C(＝NH)-NH或一个Het基团。Y优选是-(CH2)n-或 -(CH2)s-CH(R4)-(CH2)t-或-(CH2)p-Het1(CH2)q-基团。
Z优选是N-R2或CH-R2，其中R2优选可以是H原子或有1-4个C原子的烷基。
R3优选是一个H原子、Ar、Het或A基团，其中A、Ar和Het有以上或以下指出的含义之一。
R4优选是一个H原子、A、Ar、OH、OA、OAr、芳烷基、Hal、CN、NO2、CF3或OCF3基团。芳烷基优选是苄基、苯乙基、苯丙基或萘甲基，特别优选的是苄基。
A优选是COOH、NH2或有1-6个C原子的烷基，该烷基是无取代的或者被COOH或NH2取代的。A优选是甲基，进而是乙基、丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基，此外也可以是正戊基，1-，2-或3-甲基丁基，1，1-、1，2-或2，2-二甲基丙基，1-乙基丙基，己基，1-、2-、3-或4-甲基戊基，1，1-、1，2-、1，3-、2，2-、2，3-或3，3-二甲基丁基，1-或2-乙基丁基，1-乙基-1-甲基丙基，1-乙基-2-甲基丙基，1，1，2-或1，2，2-三甲基丙基。A特别优选是甲基。
Ar优选是苯基，该苯基是无取代的或者被A、OH、OA、CF3、OCF3、CN、NO2或Hal一取代、二取代或三取代，该苯基还可以被苯基以能产生一种无取代或有取代的联苯基这样一种方式取代，后一个苯基被A、OH、OA、NH2、OCF3、CN、NO2或Hal一取代、二取代或三取代。
因此，Ar优选是苯基，邻、间或对甲基苯基，邻、间或对乙基苯基，邻、间或对丙基苯基、邻、间或对异丙基苯基，邻、间或对叔丁基苯基，邻、间或对羟基苯基，邻、间或对甲氧基苯基，邻、间或对乙氧基苯基，邻、间或对三氟甲基苯基，邻、间或对三氟甲氧基苯基，邻、间或对氟苯基，邻、间或对氯苯基，邻、间或对溴苯基，邻、间或对硝基苯基，邻、间或对氨基苯基。
Het是一个饱和的、部分不饱和的或完全不饱和的单环式或双环式5元-10元杂环基，其中可以存在1-3个N和/或1个S或O原子，且该杂环基可以被CN、Hal、OH、NH2、COOH、OA、CF3、A、NO2、Ar或OCF3-取代或二取代。
Het优选是一个有邻、间或对位取代的吡啶基，一个有2-、4-、5-或6-取代的嘧啶基，或一个有3-、4-、5-或6-取代的哒嗪基，它们优选是无取代的或者被一个甲基、乙基或丙基或者一个甲基氨基、乙基氨基或丙基氨基取代[涉及所提到的所有三种杂芳香族]，以及一个2-取代的苯并咪唑基，它是无取代的或者被一个3-甲基、3-乙基或3-苄基取代，以及被一个2-取代的二氢咪唑基、四氢嘧啶或四氢吡啶基取代。
Het中优选含有的实例是 Het1是一个有1-4个N、O和/或S原子的5元或6元芳香族杂环，该杂环可以是无取代的或者是被F、Cl、Br、A、OA或OCF3-取代或二取代。
Het1优选是一个2，4-、3，5-或2，5-二取代的吡啶基，或一个2，4-、2，5-、2，6-或4，6-二取代的嘧啶基，一个2，4-或2，5-二取代的1，3-噁唑基或1，3-噻唑基。
OA优选是甲氧基、乙氧基、丙氧基或丁氧基，此外，也可以是戊氧基或乙氧基。
Hal优选是F、Cl或Br，但也可以是I。
指数n、m、o、p、q、s和t有权利要求2中指出的含义，除非另有专门说明。
式I化合物可以有一个或多个手性中心，因此，呈各种不同的立体异构体形式。式I包括所有这些形式。
因此，本发明具体地涉及那些其中所提到的基团中至少一种有以上所指出的优选含义之一的式I化合物。
特别优选的式I化合物是下列a)环状-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(NεH-[CO-(CH2)5-NH]2-Lys-[Lys-(CO-CH2-(CH2)n-PO3H2)2]2))；b)环状-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(NεH-[CO-(CH2)5-NH]3-Lys-[Lys-(CO-CH2-(CH2)n-PO3H2)2]2))；c)环状-(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(NεH-[CO-CH2(-O-CH2CH2)6-NH]2-Lys-[Lys-(CO-CH2-(CH2)n-PO3H2)2]2))；
式中n是1。
式I化合物及其制备用起始物质还可以用本身已知的方法例如文献上所述(如见标准著作，例如Houben-Weyl，Methoden derorganischen Chemie[Methods of Organic Chemistry]，Georg-Thieme-Verlag，Stuttgart；)即在已知的和适用于所提到的反应的反应条件下制备的。在这种情况下也可以使用本身已知的变化，但在此不予赘述。
如果希望，该起始物质也可以就地生成，使得它们不从反应混合物中分离出来，而是立即进行一步反应以给出式I化合物。
片段偶合或配体与接头之间的偶合一般是在惰性溶剂进行的，把羧酸片段(膦酸接头，例如HO-[CO-(CH2)5-NH]2-Lys-[Lys-(CO-CH2-CH2-PO3(C2H5)2)2]2)溶解于有HATU、HOAt和2，4，6-三甲基吡啶的DMF中，再用一种胺片段(环状肽，例如c[R((Pbf)G(OtBu)fK])处理。
适用惰性溶剂是，例如，烃如乙烷、石油醚、苯、甲苯或二甲苯；氯代烃如三氯乙烯、1，2-二氯乙烷、四氯化碳、氯仿或二氯甲烷；醇如甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇、正丁醇或叔丁醇；醚如二乙醚、二异丙醚、四氢呋喃(THF)或二噁烷；二醇醚如乙二醇-甲醚或-乙醚、乙二醇二甲醚(diglyme)；酮如丙酮或丁酮；酰胺如乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二甲基乙酰胺或二甲基甲酰胺(DMF)；腈如乙腈；亚砜如二甲基亚砜(DMSO)、二硫化碳；羧酸如甲酸或乙酸；硝基化合物如硝基甲烷或硝基苯；酯如乙酸乙酯，水或所提到的溶剂的混合物。
环状化合物可以通过线型化合物的环化来制备，例如，DE 43 10643、Houben-Weyl，1.c.，卷15/II，pp.1-806(1974)或S.Zimmer，E.Hoffmann，G.Jung和H.Kessler，Liebig’s Ann.Chem.1993，497-501中所述。线型肽可以，例如，按照R.B.Merrifield，Angew.Chemie 1985m，97，801-812进行合成。
开链线型化合物例如式I化合物还可以用惯常的氨基酸和肽合成方法，例如，按照Merrifield(也见，例如，B.F.Gysin和R.B.Merrifie1d，J.Am.Chem.Soc.94，3012ff.(1972))的固相合成法制备。
式I化合物还可以通过溶剂解尤其水解或通过氢解而使其从其功能衍生物中释放来获得。
溶剂解或氢解用的优选起始物质是那些不含一个或多个游离氨基和/或羟基，而是含有相应的被保护的氨基和/或羧基者，优选是那些不携带与N原子键合的H原子而携带氨基保护基团者，例如那些与式I对应但不含NH2基团而含有NHR’基团(其中，R’是氨基保护基团，例如BOC或CBZ团)者。
进而，起始物质优选是那些不携带羟基的H原子而携带羟基保护基者，例如那些与式I对应但不含羟苯基基团而含有R”O-苯基基团(其中，R”是羟基保护基团)者。
在该起始物质的分子中，也可以存在多个相同或不同的受保护氨基和/或羟基基团。若所存在的保护基团彼此不同，则在很多情况下它们可以选择性地脱除。
“氨基保护基团”这一表达是普遍知道的，而且涉及那些适用于保护(封闭)氨基基团免于化学反应但在该分子中其它位置上进行了所希望的化学反应之后可以容易地脱除的基团。这种类型的典型基团，具体地说，是无取代的或有取代的酰基、芳基、芳烷氧甲基或芳烷基基团。由于保护基团是在所希望的反应(或反应序列)之后脱除的，因而，其性质和大小本来并不重要；然而，优选的是那些有1-20个、尤其1-8个C原子者。“酰基基团”之一表达要在最广泛的意义上与本发明的工艺联系起来解释。它包括从脂肪族、芳脂族、芳香族或杂环族羧酸或磺酸衍生的酰基基团，具体地说，也包括烷氧羰基、芳氧羰基、尤其芳烷氧羰基。这种类型的酰基基团实例是链烷酰基例如乙酰基、丙酰基、丁酰基；芳烷酰基例如苯乙酰基；芳酰基例如苯甲酰基或甲基苯甲酰基；芳氧基链烷酰基例如POA；烷氧羰基例如甲氧羰基、乙氧羰基、2，2，2-三氯乙氧羰基、BOC、2-碘乙氧羰基；芳烷氧羰基例如CBZ(“苄酯基”)、4-甲氧基苄氧羰基、FMOC；芳基磺酰基例如Mtr、Pbf或Pmc。优选的氨基保护基团是BOC和Mtr，此外还有CBZ、Fmoc、苄基和乙酰基。
“羟基保护基团”这一表达同样是普遍知道的，而且涉及那些适用于保护羟基基团免于化学反应但在该分子中其它位置上已经进行了所希望的化学反应之后可容易地脱除的基团。这种类型的典型基团是以上提到的无取代或有取代芳基、芳烷基或酰基基团，此外还有烷基基团。该羟基保护基的性质和大小并不重要，因为它们在所希望的化学反应或反应序列之后还要脱除；优选的是含有1-20个、尤其1-10个C原子的基团。羟基保护基实例，除其它外，有苄基、对硝基苄基、对甲苯磺酰基、叔丁基和乙酰基，特别好的是苄基和叔丁基。天冬氨酸和谷氨酸中的COOH优选以其叔丁酯的形式(例如Asp(OtBu))保护。
式I化合物从其功能衍生物中的释放，因所使用的保护基团而异，是诸如使用强酸、适宜地使用TFA或过氯酸、但也使用其它强无机酸例如盐酸或硫酸、强有机羧酸例如三氯乙酸或磺酸例如苯磺或对苯磺酸进行的。额外惰性溶剂的存在是可以的，但并非总是必要的。适用惰性溶剂优选是有机溶剂，例如，羧酸如乙酸、醚如四氢呋喃或二噁烷、酰胺如DMF、卤代烃如二氯甲烷，此外还有醇如甲醇、乙醇或异丙醇，以及水。此外，以上所述溶剂的混合物也是适用的。TFA优选以过量使用而不添加进一步的溶剂，过氯酸优选以乙酸与70％过氯酸之比为9∶1的混合物形式使用。裂解反应温度适当地在大约0℃与大约50℃之间，反应优选在15℃-30℃之间(室温)进行。
基团BOC、OtBu和Mtr可以，例如，优选用TFA在二氯甲烷中、或用大约3-5N HCl在二噁烷中于15-30℃脱除，FMOC基团可以使用二甲胺、二乙胺或哌啶在DMF中的大约5-50％溶液于15-30℃脱除。
三苯甲基基团用于组氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和半胱氨酸等氨基酸的保护。因所希望的最终产物而异，脱除是用TFA/10％苯硫酚进行的，三苯甲基基团从以上提到的所有氨基酸上脱除；当使用TFA/茴香醚、TFA/硫代茴香醚或TFA/TIPS/H2O时，三苯甲基基团只从His、Asn和Gln上脱除，但仍留在Cys侧链上。
Pbf(五甲基苯并呋喃基)基团用于保护Arg。脱除是，例如，用TFA在二氯甲烷中进行的。
可氢解脱除的保护基团(例如CBZ或苄基)可以，例如，通过在一种催化剂(例如一种贵金属催化剂如钯，适当地载带于一种载体如碳上)的存在下用氢处理来脱除。在这种情况下，适用溶剂是以上指出的那些，具体地说，例如，醇类如甲醇或乙醇，或酰胺类如DMF。通常，氢解是在大约0℃-100℃之间的温度和大约1-200巴之间的压力、优选在10-30℃和1-10巴进行。例如，CBZ基团的氢解在甲醇中用5-10％Pd/C或者在甲醇/DMF中用甲酸铵(代替氢)和Pt/C于10-30℃容易地进行。
式I的碱可以用一种酸，例如通过相当量的该酸和该碱在一种惰性溶剂如乙醇中反应和随后的蒸发，转化成相关的酸加成盐。可用于此反应的酸，具体地说，是那些能给出生理上可接受盐者。因此，可以使用无机酸例如硫酸、硝酸、氢卤酸如盐酸或氢溴酸、磷酸如正磷酸、氨基磺酸、此外还可以使用有机酸，具体地说，脂肪族、脂环族、芳脂族、芳香族或杂环的一元或多元羧酸、磺酸或硫酸，例如甲酸、乙酸、丙酸、新戊酸、二乙基乙酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、富马酸、马来酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、葡糖酸、抗坏血酸、烟酸、酸异烟酸、甲磺酸或乙磺酸、乙二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、萘-磺酸和萘二磺酸、十二烷基硫酸。与生理上不可接受酸的盐例如苦味酸盐可以用于式I化合物的分离和/或纯化。
另一方面，式I的酸可以通过与一种碱反应而转化成其生理上可接受金属盐或铵盐之一。在这种情况下，适用盐具体地是钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、铵盐，以及有取代铵盐例如二甲铵盐、二乙铵盐或二异丙铵盐、一乙醇铵盐、二乙醇铵盐或二异丙醇铵盐，环己基铵盐或二环己基铵盐，二苄基乙二铵盐，进而，例如，精氨酸或赖氨酸的盐。
以上和以下所有温度都用℃表示。在下列实施例中，“惯常后处理”系指必要时加水，必要时因最终产物的构成而异把该混合物调整到2-10之间的pH且用乙酸乙酯或二氯甲烷萃取，将有机相分离、用硫酸钠干燥、蒸发，残渣用硅胶色谱法和/或结晶法纯化。硅胶柱的Rf值洗脱剂为乙酸乙酯/甲醇＝9∶1。
在下列系统中在HPLC上的RT＝保留时间(分钟)[A]柱YMC ODS A RP 5C18，250×4.6mm洗脱剂A0.1％TFA水溶液洗脱剂B0.1％TFA乙腈溶液流动速率1ml/min梯度0-50％B/30min。同[A]
梯度5-50％B/30min。同[A]；梯度10-50％B/30min。
质谱法(MS)EI(电子撞击电离)M+FAB(快原子轰击)(M+H)+ESI(电喷电离)(M+H)+DMPP树脂代表4-(2’，4’-二甲氧基苯基羟甲基)苯氧基树脂，它使得能够诸如合成有侧链保护的肽；TCP树脂系指三苯甲基氯-聚苯乙烯树脂。
下列实施例一方面描述片段偶合和膦酸酯裂解，另一方面描述所选择的有膦酸接头的环状肽衍生物的合成。借助于实施例7-9，详细解释了用金属或骨骼代用材料制成的各种成形物品的涂布工艺。
实施例1溶液中的片段偶合将0.2mmol羧酸片段(膦酸衍接物，例如HO-[CO-(CH2)5-NH]2-Lys-[Lys-(CO-CH2-CH2-PO3(C2H5)2)2]2)，0.98eq HATU，1.1eq HOAT和10eq2，4，6-三甲基吡啶溶解于2mlDMF中。1.5小时后，添加1eq胺片段(环状肽，例如c[R(Pbf)G(OtBu)fK])。混合物在室温下搅拌24小时，产物用制备型HPLC纯化。
实施例2膦酸酯在膦酸接头上裂解有膦酸酯基团的肽溶解于或适当时悬浮于无水CHCl3与TMSBr的10∶1混合物的超声波浴中。在超声波浴中搅拌3天且适当时偶尔使沉淀物浆状化之后，将溶剂蒸出。残渣冻干脱H2O。
用惯常技术脱除酸性侧链保护基团。
实施例3膦酸接头的合成按照Fmoe方法，用固相肽合成法合成了膦酸接头(见G.B.Fields，R.L.Nobie，Int.J.Pept.ProteinRes.1990，35，161-214)。
偶合的最后一个结构单元是3-(二乙基膦酰基)丙酸。
3-(二乙基膦酰基)丙酸的合成3-溴丙酸苄酯在一个配备氯化钙管的250ml圆底烧瓶中，在搅拌下，使58.3mmol 3-溴丙酰氯(10.0g)和1eq苄醇(6.3g)溶解于100ml干燥DCM中。2天后，向该混合物中添加200ml CHCl3，有机相用饱和NaHCO3溶液萃取2次。用MgSO4干燥后蒸出溶剂，得到无色液体状产品。
产率13.8g(56.8mmol，97％)Rf＝0.75(H∶EA 1∶1).NMR(CDCl3)1H(250MHz)δ＝7.35(s，5H；H ar)，5.16(s，2H；CH2-OCO)，3.58(t，3J(H，H)＝7Hz，2H；CH2Br)，2.95(t，3J(H，H)＝7Hz，2H；CH2CO).GC-MSm+＝242.0.
3-(二乙基磷酰基)丙酸苄酯在一个以压力平衡用气球密封的蒸馏装置中，在搅拌下，将56.8mmol 3-溴丙酸苄酯(13.8g)和1.7eq亚磷酸三乙酯(16.0g)加热到140℃。反应期间生成的溴乙烷连续蒸出并收集在一冷却到0℃的接收瓶中。4小时后，剩余的油状残留物在高真空下经由Vigreux柱分馏；产物是无色油状物。
产率12.1g(40.3mmol，71％)，稍有杂质，Rf＝0.33(A∶H＝2∶3)。
为了提高纯度，产物适当时可用急骤色谱法(洗脱剂A∶H＝2∶3)纯化。NMR(CDCl3)1H(250MHz)＝7.31(s，5H；H ar)，5.10(s，2H，CH2-OCO)，4.05(m，4H；CH2OP)，2.61(m，2H；CH2CO)，2.04(m，2H；CH2P)，1.26(t，3J(H，H)＝7Hz，6H；CH3).31P(101.256MHz)δ＝28.5(s).GC-MSm+＝300.0.
3-(二乙基膦酰基)丙酸将40.3mmol 3-(二乙基膦酰基)丙酸苄酯(12.1g)溶解于100ml乙醇中，添加2g催化剂(5％Pd/C)。在H2气氛下搅拌4小时后，把活性炭滤出、并蒸出溶剂。得到无色油状产物，该产物在室温下慢慢凝固成一种无色固体。该产物稍微沾染3-(二乙基膦酰基)丙酸乙酯，后者适当时可通过与水和乙烷一起摇荡若干次而转移到有机相中和去除。
产率8.2g(39.0mmol，97％).NMR(CDCl3)1H(250MHz)δ＝10.6O(bs，1H；COOH)，4.07(m，4H；CH2O)，2.59(m，2H；CH2CO)，2.06(m，2H；CH2P)，1.29(t，3J(H，H)＝7Hz，6H；CH3).13C(62.896MHz)δ＝174.5(d，J(C，P)＝18.5Hz；COOH)，62.1(d，J(C，P)＝6.6Hz；CH2-O)，27.1(d，J(C，P)＝3.8Hz；CH2-COOH)，2.07(d，J(C，P)＝144.9Hz；CH2-P)，16.2(d，J(C，P)＝6.1Hz；CH3).31P(101.256MHz)δ＝29.5(s).
有膦酸接头的环状肽的分析数据实施例4(间隔物中的2-氨基乙酸)环状-(Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys(NεH-[CO-(CH2)5-NH]2-Lys-[Lys-(CO-CH2-CH2-PO3H2)2]2))MS(ESI)m/z(％)1756.9(100)[m-H+]，1778.8(48)[m+Na+-2H+]，1794.9(18)[m+K+-2H+].NMR([D6]DMSO)31P(101.256MHz)δ＝29.63(s，1P)，29.59(s，1P)，29.57(s，1P)，29.38(s，1P).
实施例5(间隔物中的3-氨基己酸)环状-(Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys(NεH-[CO-(CH2)5-NH]3-Lys-[Lys-(CO-CH2-CH2-PO3H2)2]2))MS(ESI)m/z(％)934.9(100)[m-2H+]，1870.O(27)[m-H+].NMR([D6]DMSO)31P(101.256MHz)δ＝29.57(s，1P)，29.51(s，2P)，29.33(s，1P).
实施例6(间隔物中的2-七甘醇氨基羧酸)环状-(Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys(NεH-[CO-CH2(-O-CH2CH2)6-NH]2-Lys-[Lys-(CO-CH2-CH2-PO3H2)2]2))MS(ESI)m/z(％)1086.4(100)[m-2H+]，1097.7(73)[m+Na+-3H+].NMR([D6]DMSO)31P(101.256MHz)δ＝29.66(s，1P)，29.61(s，1P)，29.59(s，1P)，29.45(s，1P).
此外，以上提到的肽全部都用1H NMR谱法(250MHz)表征，并得到预期谱图。
实施例7直径10mm且高1-2mm的Ti或TiAl6V4成形物品用60℃蒸馏水于超声波浴中预清洗15分钟，然后用丙酮洗涤30分钟，然后用蒸馏水洗涤2次，并在烘箱中干燥8小时。
将该成形物品转移到48孔板(Costar公司，“所处理的非组织培养物”Art.No.3574)。为了使生物活性的细胞粘附介导分子B(其中，B可以是按照权利要求2的一种环状肽、肽模拟物或线型肽)附着到所准备的成形物品上，制备一种含有分子B的储备溶液(“B溶液”)，使其在缓冲剂水溶液Tris-HCl(10mM，pH8.7)、Tris-HClO4(10mM，pH8.7)或PBS(pH7.4)之一中的最终浓度的1mM。然后，用PBS(pH7.4)稀释，配制在每种情况下“B溶液”最终浓度为1nm、10nm、100nm、1μm、10μm和100μm的浓度系列。该成形物品每一个都覆盖250μl各B溶液，然后在室温下培养18-24小时。为了除去未结合的B分子，各样品用PBS(pH7.4)洗涤3次，并在PBS(pH7.4)中于4℃贮存过程。
通过添加250μl 5％BSA(牛血清清蛋白)溶液(pH7.4)到每一个成形物品上、然后在室温下培养2小时、用PBS(pH7.4)洗涤一次，使非特异性细胞结合位点封闭。
用对应缓冲溶液(Tris-HCl 10mM，pH8.7；Tris-HClO410mM，pH8.7；PBS，pH7.4)代替B溶液处理的Ti和TiAl6V4成形物品用来作为阴性对照组。
这些成形物品上所得到涂层的程度通过分析进行评价，生物学活性是借助于细胞粘附试验体外确定的。
实施例8通过切削出直径10mm的圆柱体、随后用Buehler ISOMET低速锯锯成厚度100μm，生产直径10mm、高度100μm、作为天然骨骼代用材料模型的象牙状物品。然后，这些样品用60℃蒸馏水在超声波浴中清洗10分钟，此后用蒸馏水洗涤2次，在烘箱中干燥8小时。
用B溶液涂布成形物品的程序同实施例7中所述。
这些成形物品上所得到涂层的程度通过分析进行评价，生物学活性是借助于细胞粘附试验体外确定的。
实施例9通过切削出直径10mm的圆柱体、随后用Buehler ISOMET低速锯锯成厚度100μm，生产直径10mm、高度100μm、商业上可得骨骼代用材料Endobone(购自Biomet Merek公司，德国)的成形物品。然后，这些样品用60℃蒸馏水在超声波浴中清洗10分钟，此后用蒸馏水洗涤2次，在烘箱中干燥8小时。
这些成形物品上所得到涂层的程度通过分析进行评价，生物学活性是借助于细胞粘附试验体外确定的。
细胞粘附试验实施例研究了小鼠MC3T3 H1成骨细胞培养物在体外条件下对有RGD肽涂层的材料表面的粘附。在这种试验中，接种50000细胞/cm2，并在无血清培养基中于37℃/95％大气湿度下培养1小时之后确定粘附细胞的比例。
细胞粘附率[％]＝粘附细胞/接种细胞×100肽细胞粘附率[％]环状-(Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys(NεH-[CO-(CH2)5-NH]2-Lys-[Lys-(CO-CH2-CH2-PO3H2)2]2))75环状-(Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys(NεH-[CO-(CH2)5-NH]3-Lys-[Lys-(CO-CH2-CH2-PO3H2)2]2))6权利要求
1.式I化合物及其盐B-Q-X1I式中B是一种生物活性的细胞粘附介导分子，Q不存在或者是一种有机间隔分子，和X1是一种锚固分子，选自基团-Lys-(CO-CH2-(CH2)n-PO3H2)2(i)-Lys-[Lys-(CO-CH2-(CH2)n-PO3H2)2]2(ii)或-Lys-(Lys[-Lys-(CO-CH2-(CH2)n-PO3H2)2]2)2(iii)，且n在每种情况下都彼此独立地是0、1、2或3，其中，基团B的一个游离氨基和间隔分子Q或锚固分子X1的一个游离羧基，或者基团Q的一个游离氨基和基团X1的一个游离羧基彼此像肽一样连接。
2.按照权利要求1的化合物，其中，基团B选自基团环状-(Arg-Gly-Asp-Z1) (iv) 和Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys (vi)Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys (vii)Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg-Lys (viii)Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn-Arg (ix)Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg-Asn (x)Thr-Trp-Tyr-Lys-Ile-Ala-Phe-Gln-Arg (xi)式中Z1在每种情况下都彼此独立地是一种氨基酸残基或一种二肽或三肽残基，其中，该氨基酸彼此独立地选自下列组成的一组Ala，Asn，Asp，Arg，Cys，Gln，Glu，Gly，His，Homo-Phe，Ile，Leu，Lys，Met，Orn，Phe，Phg，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，Val，其中，对于(v)来说X是H2N-C(＝NH)-NH，Het-NH-，H2N-C(＝NH)-，A-C(＝NH)-NH-或Het-，Y是-(CH2)n-或 -(CH2)s-CH(R4)-(CH2)t-或-(CH2)p-Het1(CH2)q-，Z是N-R2或CH-R2，R2是H或有1-4个C原子的烷基，R3是H，Ar，Het或A，R4是H，A，Ar，OH，OA，OAr，芳烷基，Hal，CN，NO2，CF3或OCF3，A是COOH、NH2、或者有1-6个C原子的无取代或被COOH或NH2取代的烷基，Ar是无取代的或者被A、OH、OA、CF3、OCF3、CN、NO2或Hal一取代、二取代或三取代的苯基，该苯基还可以被苯基以能产生一种无取代或有取代的联苯基这样一种方式取代，后一个苯基被A、OH、OA、NH2、OCF3、CN、NO2或Hal一取代、二取代或三取代，Hal是F、Cl、Br或I，Het是一种饱和的、部分不饱和的或完全不饱和的单环式或双环式的有5-10元的杂环基，其中可以存在1-3个N和/或1个S或O原子，且该杂环基可以被CN、Hal、OH、NH2、COOH、OA、CF3、A、NO2、Ar或OCF3一取代或二取代，Het1是一种有1-4个N和/或S原子的5元或6元芳香族杂环，该杂环可以是无取代的或者被F、Cl、Br、A、OA或OCF3一取代或二取代，n是4，5或6，m，o，p，q是0，1或2，s，t是0，1，2，3，4或5
3.按照权利要求1或2的化合物，其中，Q选自基团[CO-(CH2)x-NH-]m， (xii)[CO-CH2(-O-CH2CH2)y-NH-]m(xiii)[CO-(CH2)z-CO-](xiv)[NH-(CH2)z-NH-](xv)[CO-CH2-(OCH2CH2)y-O-CH2-CO-](xvi)[NH-CH2CH2-(OCH2CH2)y-NH-] (xvii)及其组合其中，m在每种情况下都彼此独立地是1-20，x是1-12，y是1-50且z是1-12。
4.按照权利要求1或2的化合物，其中，Q选自基团[CO-(CH2)x-NH-]m， (xviii)[CO-CH2(-O-CH2CH2)y-NH-]m(xix)[CO-(CH2)z-CO-] (xx)[NH-(CH2)z-NH-] (xxi)[CO-CH2-(OCH2CH2)y-O-CH2-CO-] (xxii)[NH-CH2CH2-(OCH2CH2)y-NH-](xxiii)及其组合其中m在每种情况下都彼此独立地是1-8，x是1-5，y是1-6且z是1-6。
5.按照权利要求1的式1[sic]化合物a)环状-(Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys(NεH-[CO-(CH2)5-NH]2-Lys-[Lys-(CO-CH2-(CH2)n-PO3H2)2]2))；b)环状-(Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys(NεH-[CO-(CH2)5-NH]3-Lys-[Lys-(CO-CH2-(CH2)n-PO3H2)2]2))；c)环状-(Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys(NεH-[CO-CH2(-O-CH2CH2)6-NH]2-Lys-[Lys-(CO-CH2-(CH2)n-PO3H2)2]2))；其中n是1。
6.按照权利要求1-5之一的化合物，作为药剂，用于治疗植入物引起的疾病、缺陷和炎症，治疗溶骨性疾病例如骨质疏松症、血栓形成、心肌梗塞和动脉硬化，也用于加速和增强植入物或生物相容性表面整合到组织中的过程。
7.适用于人体和动物器官的植入物，由一种载体基质和围绕这种基质的一层生物活性的细胞粘附介导分子组成，其特征在于，该围绕层是从按照权利要求1-5的化合物形成的，在载体基质与这种化合物之间存在一种离子键或吸附键。
8.按照权利要求7的植入物，其特征在于，该载体基质和/或其表面是一种金属或一种金属氧化物。
9.按照权利要求7的植入物，其特征在于，该载体基质和/或其表面是一种骨骼或牙齿代用材料。
10.按照权利要求9的植入物，其特征在于，该骨骼或牙齿代用材料由磷酸钙混合物组成。
11.按照权利要求1的化合物及其盐的制备工艺，其特征在于，使一种可以被提供保护基团的生物活性分子B与一种提供了保护基团的间隔-锚固分子(Q-X1)或锚固分子(X1)彼此以肽方式连接，然后脱除该保护基团，和/或在于，使式I的碱性或酸性化合物通过用一种酸或碱处理而转化成其盐之一。
12.按照权利要求1-5之一的化合物在制造一种药物中的用途，该药物用于治疗植入物引起的疾病、缺陷和炎症，治疗溶骨性疾病例如骨质疏松症、血栓形成、心肌梗塞和动脉硬化，也用于加速和增强植入物或生物相容性表面整合到组织中的过程。
13.按照权利要求1-5之一的化合物用于通过离子型或吸附型结合而涂布人体和动物器官的植入物的用途。
全文摘要
本发明涉及式(I)B－Q－X
文档编号A61P19/10GK1447699SQ01814238
公开日2003年10月8日 申请日期2001年8月2日 优先权日2000年8月17日
发明者J·迈尔, B·尼斯, M·达尔, G·霍尔茨曼, H·凯斯勒, M·康德莱纳, U·埃尔泽尔, C·吉布森, G·苏尔约克 申请人:默克专利股份公司
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