一种治疗肿瘤的药物的制作方法

专利名称：：一种治疗肿瘤的药物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及六月青水提物、醇提物、石油醚部位及60%乙醇部位在制备治疗肿瘤药中的应用。
背景技术：
：六月青(LYQ)，系爵床科(Acanthaceae)植物肖鸡笼(顶头马兰)Taraphochlamysaffinis(Griff)Bremekhu(Strobilanthesaffinis(griff)Y.C.Tang)的干燥地上部分。发明人对该药进行了大量的研究，实验发现，本品对四氯化碳(CCl4)等所致大鼠急性化学性肝损伤有保护作用，能降低丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)的活性，增加免疫抑制小鼠的胸腺重量，提高血清溶菌酶、肿瘤坏死因子(TNF-α)的含量；能增加S180荷瘤小鼠血清中肿瘤坏死因子(TNF-α)和白细胞介素(IL-2)含量，抑制S180荷瘤小鼠的肿瘤生长。体外试验表明本品可降低H印G2.2.15细胞培养上清中的HBsAg、HBeAg含量，可抑制HBV-DNA的复制；此外，对癌细胞株SGC7901、低分化黏液胃腺癌细胞株MGC803、人乳腺癌细胞株MDA-MB-231、人口腔表皮样癌KB细胞也有较强的抑制作用。六月青对急慢性肝损伤、乙型肝炎，黄疸的治疗有较大的潜在应用价值。目前，尚未发现有把六月青水提物、醇提物等活性部位制成药用制剂并应用于临床的报告。
发明内容本发明的目的是把六月青水提物、醇提物、石油醚部位、60%乙醇部位制成片剂、合剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂等药用制剂，应用于肿瘤的治疗。本发明采取的技术方案六月青提取物在制备治疗肿瘤药中的应用。将六月青进行水提取、醇提取、制取石油醚部位、制取60%乙醇部位，并将六月青水提物、醇提物、石油醚部位、60%乙醇部位加入相应药用辅料制成片剂、合剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂。1、六月青水提物的提取六月青干燥粗粉，加10倍量水，煮3次，每次2h，收集水煮液，浓缩成稠膏。2、六月青醇提物的提取六月青干燥粗粉，加10倍量95%乙醇，回流提取3次，每次2h，提取液回收乙醇，浓缩成稠膏。3、六月青石油醚部位的制备方法是六月青粗粉，加10倍量浓度80%乙醇浸泡30min后，回流提取2h，过滤。药渣再加8倍量80%乙醇，回流提取lh，过滤。合并两次滤液，离心(3000Y/min)15min。回收乙醇后，收集提取液，减压浓缩，用石油醚萃取4次，除去叶绿素，取醚相，醚相经回收得到六月青石油醚部位。4、六月青60%乙醇部位的制备方法是六月青粗粉，加10倍量浓度80%乙醇浸泡30min后，回流提取2h，过滤。药渣再加8倍量80%乙醇，回流提取lh，过滤。合并两次滤液，离心(3000γ/min)15min。回收乙醇后，收集提取液，减压浓缩，得到浸膏，将浸膏与柱层析硅胶拌样，所得粉末依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、水饱和正丁醇、60%乙醇萃取。60%乙醇部位减压回收乙醇后得到六月青60%乙醇部位。5、制剂的制备六月青水提物、醇提物、石油醚部位、60%乙醇部位加入相应药用辅料制成片剂、合剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂。6、六月青水提物、醇提物、石油醚部位、60%乙醇部位对S180荷瘤小鼠的影响无菌抽取S180荷瘤小鼠的腹水，制成癌细胞悬液，将其接种于小鼠右前肢腋部皮下，制成局灶性肿瘤模型，观察六月青水提物、醇提物、石油醚部位、60%乙醇部位部位对S180荷瘤鼠免疫功能的影响，以TNF-α、IL-2的含量、抑瘤率、胸腺指数，脾腺指数做为观测指标。7、六月青水提物、醇提物、石油醚部位、60%乙醇部位对肝癌细胞H印G2.2.15细胞的影响采用WST-8法测定六月青水提物、醇提物、石油醚部位、60%乙醇部位对H印G2.2.15细胞毒性，ELISA法测定细胞培养上清中的HBsAg、HBeAg，测定六月青水提物、醇提物、石油醚部位、60%乙醇部位的半数中毒浓度(TC5tl)、半数抑制浓度(IC5tl)。采用PCR体外扩增法定量检测各活性部位对H印G2.2.15细胞HBV-DNA的拷贝数和循环数(CT)的影响8、六月青水提物、醇提物、石油醚部位、60%乙醇部位对T淋巴细胞转化功能的影响S180荷瘤鼠造模、分组，给药10天后将小鼠处死，于超净台中无菌取出脾脏，制成脾细胞悬液。将其接种于96孔板内，每孔加100μL刀豆蛋白A(ConA,10μg/ml)，观察六月青水提物、醇提物、石油醚部位、60%乙醇部位对T淋巴细胞转化功能的影响，以刺激指数(Si)为观察指标。9、六月青水提物、醇提物、石油醚部位、60%乙醇部位对腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响S180荷瘤鼠造模、分组，给药10天后处死小鼠，无菌条件下制备小鼠腹腔巨噬细胞悬液。观察六月青水提物、醇提物、石油醚部位、60%乙醇部位对腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响。10、六月青水提物、醇提物、石油醚部位、60%乙醇部位对癌细胞株的影响体外培养癌细胞株，采用MTT法观测六月青水提物、醇提物、石油醚部位、60%乙醇部位对所培养的癌细胞的生长有无抑制作用。本发明是对天然药物资源进行挖掘整理，将为中草药的深度开发提供新思路，对促进我国中草药产业现代化具有重大意义。为肿瘤的治疗提供一种新的天然药物制剂。具体实施例方式1、六月青水提物的提取取IOOOg六月青干燥粗粉，加IOL水，煮3次，每次2h，收集水煮液，浓缩成稠膏。加入相应辅料制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、合剂。2、六月青醇提物的提取取IOOOg六月青干燥粗粉，加10L95%乙醇，回流提取3次，每次2h，提取液回收乙醇，浓缩成稠膏。加入相应辅料制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、合剂。3、六月青石油醚部位的制备方法是六月青粗粉，加10倍量浓度80%乙醇浸泡30min后，回流提取2h，过滤。药渣再加8倍量80%乙醇，回流提取lh，过滤。合并两次滤液，离心(3000Y/min)15min。回收乙醇后，收集提取液，减压浓缩，用石油醚萃取4次，除去叶绿素，取醚相，醚相经回收得到六月青石油醚部位。4、六月青60%乙醇部位的制备方法是六月青粗粉，加10倍量浓度80%乙醇浸泡30min后，回流提取2h，过滤。药渣再加8倍量80%乙醇，回流提取lh，过滤。合并两次滤液，离心(3000Y/min)15min。回收乙醇后，收集提取液，减压浓缩，得到浸膏，将浸膏与柱层析硅胶拌样，所得粉末依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、水饱和正丁醇、60%乙醇依次萃取。60%乙醇部位减压回收乙醇后得到六月青60%乙醇部位。药效学研究1、对S180荷瘤小鼠免疫功能的影响选择腹腔接种79天，生长良好的荷S180肉瘤小鼠，断颈处死，无菌抽取腹水，以无菌生理盐水稀释成IXlO7^mr1瘤细胞悬液，接种于健康昆明种小鼠右前肢腋部皮下，制备局灶性肿瘤模型。各组灌胃给药，每日一次，连续10天。期间，每日观察小鼠的一般活动、皮毛、粪便等情况。结果表明给予六月青水提物，醇提物，石油醚部位，60%乙醇部位组的小鼠血清TNF-α和IL-2的含量增加，与荷瘤对照组比较有显著性差异(P<0.01)，表明六月青水提物，醇提物，石油醚部位，60%乙醇部位有一定的抗肿瘤作用。六月青水提物，醇提物，石油醚部位，60%乙醇部位组的胸腺指数较空白对照组、阴性对照组有所增高，脾腺指数则无显著差异(P)O.05)。结果见表1表1六月青活性部位对sl80荷瘤小鼠的影响n=10)胸腺指数血清TNF-α含血清IL-2含量脾脏指数抑瘤率_量(OD值表示)(OD值表示)_(%)空白组2.84+1.020.17+0.010.27+0.036.24+1.12CTX组(20mg/kg1.86±1.01"0.17±0.020.22+0.03"6.28±1.5365.28体重)LYQ水提物组2.81±0.840.18±0.040.22±0.03“6·90±1·0723.22(3.66g/kg体重)LYQ醇提物组2.79±0.750.17土0.020.33+0.04**6.72±1.3933.48(3.79g/kg体重)LYQ石油醚组2.58±1.θΓ0.19±0.02"0.33±0.05"7.13±1.1965.28(50.1mg/kg体重)LYQ60%乙醇组3.22±0.95"0.21±0.02"0.35±0.03"7.64±1.3348.87(361mg/kg体重)__注与模型组比较*P<0.05，**P<0.01。2、对肝癌细胞H印G2.2.15细胞的影响对H印G2.2.15细胞进行细胞分泌动力学实验，以确定加入受度药物时间和周期；采用WST-8法测定六月青水提物，醇提物，石油醚部位，60%乙醇部位对H印G2.2.15细胞毒性，ELISA法测定细胞培养上清中的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)，测定各个活性成分的TC5(I、IC5(I；并采用PCR体外扩增法定量检测H印G2.2.15细胞培养上清中HBV-DNA的拷贝数和循环数(CT)。结果发现，六月青水提物，醇提物，石油醚部位，60%乙醇部位活性成分可降低HBV-DNA的拷贝数和循环数。显示各活性成分对HBV-DNA的复制有抑制作用。结果见表2:表2六月青活性部位对H印G2.2.15细胞的影响(χ土s)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>3、对S180荷瘤小鼠T淋巴细胞转化功能的影响荷瘤鼠造模、分组，给药10天后处死小鼠，于超净台中无菌取出脾脏，用眼科剪反复剪碎，经200目尼龙网过滤至离心管中，1500y/min,离心5min，弃上清，同样方式洗涤细胞两次，制成1XIOVml单个脾细胞悬液。取上述脾细胞悬液接种于96孔板，每只鼠设对照孔，4复孔，每孔加100μ11640培养液；ConA刺激孔，4复孔，每孔加100μ1ConA(10μg/ml)溶液。之后每孔加100μ1脾细胞悬液，于37°C、5%CO2孵箱中孵育40小时。采用MTT法在酶标仪上选择570nm处波长，测OD值，计算刺激指数(Si)。结果发现六月青水提物，醇提物，石油醚部位、60%乙醇部位与对照组比较，均能提高荷瘤鼠T淋巴细胞转化功能，有显著差异(P<0.01)。结果见表3表3六月青活性部位S180荷瘤小鼠T淋巴细胞转化功能的影响n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注与对照组比较，*P<0.05，**P<0.014、对S180荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红试验荷瘤鼠造模、分组，给药10天后处死小鼠，无菌条件下制备小鼠腹腔巨噬细胞悬液，调整细胞密度为2X106/ml，接种于96孔板中，每孔IOOul，设四个复孔，以含10%血清的1640培养基为对照组，置培养箱培养2h，去上清液，用PBS冲洗2次，每孔加入0.075%中性红生理盐水液0.Iml0培养2h后，甩弃中性红，并用预温的PBS清洗未吸收的中性红，吸水纸吸干，每孔加入细胞裂解液(乙酸无水乙醇=11)0.15ml，静置4°C过夜，用酶标仪于波长490nm处测定OD值，表示巨噬细胞吞噬功能的强弱。结果发现六月青水提物、醇提物、石油醚部位、60%乙醇部位能提高荷瘤鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能。结果见表4:表4六月青活性部位对S180荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响(JP±S，η=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注与对照组比较，*P<0.05，**P<0.015、体外细胞抑制试验体外培养胃癌细胞株SGC7901、低分化黏液胃腺癌细胞株MGC803、人乳腺癌细胞株MDA-MB-231、人口腔表皮样癌KB细胞，用MTT法检测各极性部位对各个细胞株的增殖抑制率。结果发现六月青水提物、醇提物、石油醚部位、60%乙醇部位对上述细胞株均有抑制作用。实施例1、六月青水提物的提取及其制剂的制备1.1六月青水提物的制备取六月青干燥粗粉10kg，加100L水，煮3次，每次2h，过滤，收集水煮液，浓缩成比重为1.3的稠膏。1.2制水提物片剂取六月青干燥粗粉10kg，同第1.1项方法制备稠膏，称重并记录稠膏重量，加入2倍量食用淀粉，并加入80%酒精混均，过筛制粒，60°C下干燥，整粒，加入3%的滑石粉、4%的羧甲基淀粉钠，压片(素片要求为0.38/片)，包糖衣片(或薄膜衣片)，外观检查符合规定后即可。1.3制水提物胶囊剂取六月青干燥粗粉10kg，同第1.1项方法制备稠膏，称重并记录稠膏重量，加入2倍量食用淀粉，并加入浓度80%酒精混均，过筛制粒，60°C下干燥，整粒，分装入胶囊(0.5g/颗)。1.4制水提物颗粒剂取六月青干燥粗粉10kg，同第1.1项方法制备稠膏，称重并记录稠膏重量，加1倍量糊精和1倍糖粉搅拌混合均勻，制成干湿合适的松软团块，压过10目筛子，颗粒于5060°C干燥，干燥过的颗粒再过1214目筛，取过筛颗粒装袋密封，规格为IOg/袋。1.5制水提物合剂取六月青干燥粗粉10kg，同第1.1项方法制备稠膏，称重并记录稠膏重量，加入5倍量蒸馏水溶解，高压灭菌，加0.1%苯甲酸，分装入瓶中(IOml/瓶)。1.6制水提物注射剂取六月青干燥粗粉10kg，同第1.1项方法制备稠膏，称重并记录稠膏重量，加入10倍量蒸馏水搅拌溶解，过滤，滤液加入0.3%活性炭，煮沸IOminJA色，过滤，冷却后加入0.2%吐温80，搅勻后过滤，在滤液中加入1%2%苯甲醇，混勻，再用10%氢氧化钠调pH6.5左右，48°C保存过夜，经粗滤后，用94号玻璃除菌漏斗过滤，或通过除菌滤板，如未达到澄明度应再过滤一次，除菌后的药液即装入安瓿中，封口。安瓿再次经蒸汽灭菌。2、六月青醇提物的提取及其制剂的制备2.1六月青醇提物的制备取六月青干燥粗粉1kg，加IOL浓度95%乙醇，回流提取3次，每次2h，过滤，提取液回收乙醇，浓缩成比重为1.3的稠膏。2.2制醇提物片剂取六月青干燥粗粉1kg，同第2.1项方法制备稠膏，称重并记录稠膏重量，加入2倍量食用淀粉，并加入浓度80%酒精混均，过筛制粒，60°C下干燥，整粒，加入3%的滑石粉、4%的羧甲基淀粉钠，压片(素片要求为0.28/片)，包糖衣片(或薄膜衣片)，外观检查符合规定后即可。2.3制醇提物胶囊剂取六月青干燥粗粉1kg，同第2.1项方法制备稠膏，称重并记录稠膏重量，加入2倍量食用淀粉，并加入浓度80%酒精混均，过筛制粒，60°C下干燥，整粒，分装入胶囊(0.2g/颗)。2.4制醇提物颗粒剂取六月青干燥粗粉lkg，同第2.1项方法制备稠膏，称重并记录稠膏重量，加1倍量糊精和1倍糖粉搅拌混合均勻，制成干湿合适的松软团块，压过10目筛子，颗粒于5060°C干燥，干燥过的颗粒再过1214目筛，取过筛颗粒装袋密封，规格为Ig/袋。2.5制醇提物合剂取六月青干燥粗粉1kg，同第2.1项方法制备稠膏，称重并记录稠膏重量，加入5倍量蒸馏水溶解，高压灭菌，加0.苯甲酸，分装入瓶中(IOml/瓶)。2.6制醇提物注射剂取六月青干燥粗粉1kg，同第2.1项方法制备稠膏，称重并记录稠膏重量，加入10倍量蒸馏水搅拌溶解，过滤，滤液加入0.3%活性炭，煮沸IOminJA色，过滤，冷却后加入0.2%吐温80，搅勻后过滤，在滤液中加入1%2%苯甲醇，混勻，再用10%氢氧化钠调pH6.5左右，48°C保存过夜，经粗滤后，用94号玻璃除菌漏斗过滤，或通过除菌滤板，如未达到澄明度应再过滤一次，除菌后的药液即装入安瓿中，封口。安瓿再次经蒸汽灭菌。3、六月青石油醚部位的提取及其制剂的制备3.1六月青石油醚部位的制备称取六月青粗粉1kg，加80%乙醇IOL浸泡30min后，回流提取2h，过滤。药渣再加80%乙醇8L，回流提取lh，过滤。合并两次滤液，离心(3000y/min)15min。回收乙醇后，收集提取液，减压浓缩，用石油醚萃取4次，除去叶绿素，取醚相，醚相经回收得到六月青石油醚活性部位。3.2制石油醚部位片剂取六月青干燥粗粉lkg，同第3.1项方法制备石油醚部位，称重并记录石油醚部位重量，加入2倍量食用淀粉，并加入浓度80%酒精混均，过筛制粒，60°C下干燥，整粒，加入3%的滑石粉、4%的羧甲基淀粉钠，压片(素片要求为0.Ig/片)，包糖衣片(或薄膜衣片)，外观检查符合规定后即可。3.3制石油醚部位胶囊剂取六月青干燥粗粉1kg，同第3.1项方法制备石油醚部位，称重并记录石油醚部位重量，加入2倍量食用淀粉，并加入浓度80%酒精混均，过筛制粒，60°C下干燥，整粒，分装入胶囊(0.2g/颗)。3.4制石油醚部位颗粒剂取六月青干燥粗粉1kg，同第3.1项方法制备石油醚部位，称重并记录石油醚部位重量，加1倍量糊精和1倍糖粉搅拌混合均勻，制成干湿合适的松软团块，压过10目筛子，颗粒于5060°C干燥，干燥过的颗粒再过1214目筛，取过筛颗粒装袋密封，规格为0.5g/袋。3.5制石油醚部位合剂取六月青干燥粗粉1kg，同第3.1项方法制备石油醚部位，称重并记录石油醚部位重量，加入5倍量蒸馏水搅拌混勻，高压灭菌，加0.苯甲酸，分装入瓶中(IOml/瓶)。3.6制石油醚部位注射剂取六月青干燥粗粉1kg，同第3.1项方法制备石油醚部位，称重并记录石油醚部位重量，加入10倍量蒸馏水并用10%氢氧化钠调PH7.2搅拌溶解，过滤，滤液加入0.3%活性炭，煮沸lOmin，脱色，过滤，冷却后加入0.2%吐温80，搅勻后过滤，在滤液中加入1%2%苯甲醇，混勻，再用10%氢氧化钠调pH7.2左右，48°C保存过夜，经粗滤后，用94号玻璃除菌漏斗过滤，或通过除菌滤板，如未达到澄明度应再过滤一次，除菌后的药液即装入安瓿中，封口。安瓿再次经蒸汽灭菌。4、六月青60%乙醇部位的提取及其制剂的制备4.1六月青60%乙醇部位的制备称取六月青粗粉1kg，加80%乙醇IOL浸泡30min后，回流提取2h，过滤。药渣再加80%乙醇8L，回流提取lh，过滤。合并两次滤液，离心(3000Y/min)15min。回收乙醇后，收集提取液，减压浓缩，得到浸膏，将浸膏与柱层析硅胶拌样，所得粉末依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、水饱和正丁醇、60%乙醇萃取。60%乙醇部位减压回收乙醇后得到六月青60%乙醇部位4.2制60%乙醇部位片剂取六月青干燥粗粉lkg，同第4.1项方法制备60%乙醇部位，称重并记录60%乙醇部位重量，加入2倍量食用淀粉，并加入浓度80%酒精混均，过筛制粒，60°C下干燥，整粒，加入3%的滑石粉、4%的羧甲基淀粉钠，压片(素片要求为0.Ig/片)，包糖衣片(或薄膜衣片)，外观检查符合规定后即可。4.3制60%乙醇部位胶囊剂取六月青干燥粗粉1kg，同第4.1项方法制备60%乙醇部位，称重并记录60%乙醇部位重量，加入2倍量食用淀粉，并加入浓度80%酒精混均，过筛制粒，60°C下干燥，整粒，分装入胶囊(0.2g/颗)。4.4制60%乙醇部位颗粒剂取六月青干燥粗粉1kg，同第4.1项方法制备60%乙醇部位，称重并记录60%乙醇部位重量，加1倍量糊精和1倍糖粉搅拌混合均勻，制成干湿合适的松软团块，压过10目筛子，颗粒于5060°C干燥，干燥过的颗粒再过1214目筛，取过筛颗粒装袋密封，规格为0.5g/袋。4.5制60%乙醇部位合剂取六月青干燥粗粉lkg，同第4.1项方法制备60%乙醇部位，称重并记录60%乙醇部位重量，加入5倍量蒸馏水搅拌混勻，高压灭菌，加0.1%苯甲酸，分装入瓶中(IOml/瓶)。4.6制60%乙醇部位注射剂取六月青干燥粗粉1kg，同第4.1项方法制备60%乙醇部位，称重并记录60%乙醇部位重量，加入10倍量蒸馏水并用10%氢氧化钠调pH7.2搅拌溶解，过滤，滤液加入0.3%活性炭，煮沸lOmin，脱色，过滤，冷却后加入0.2%吐温80，搅勻后过滤，在滤液中加入1%2%苯甲醇，混勻，再用10%氢氧化钠调pH7.2左右，48°C保存过夜，经粗滤后，用94号玻璃除菌漏斗过滤，或通过除菌滤板，如未达到澄明度应再过滤一次，除菌后的药液即装入安瓿中，封口。安瓿再次经蒸汽灭菌。权利要求六月青提取物在制备治疗肿瘤药中的应用。全文摘要本发明是从民间药材六月青粗粉提取分离得到六月青水提物、醇提物、石油醚部位和60％乙醇部位。经大量研究、体内实验发现，本品能增加S180荷瘤小鼠血清中肿瘤坏死因子和白细胞介素含量，抑制S180荷瘤小鼠的肿瘤生长。体外试验表明，本品对癌细胞株SGC7901、低分化黏液胃腺癌细胞株MGC803、人乳腺癌细胞株MDA-MB-231、人口腔表皮样癌KB细胞亦有较强的抑制作用。为肿瘤的治疗提供一种新的天然药物制剂。文档编号A61K36/195GK101829169SQ201010183818公开日2010年9月15日申请日期2007年4月29日优先权日2007年4月29日发明者刘曦,张士军,曾嵘,林兴,林军,梁霜,荣延平,莫国艳,蒋伟哲,黄仁彬,黄权芳申请人:黄仁彬