筛选具有自然杀伤细胞增殖作用的物质和增殖自然杀伤细胞的方法
专利名称：筛选具有自然杀伤细胞增殖作用的物质和增殖自然杀伤细胞的方法
技术领域：
本发明涉及自然杀伤细胞的增殖剂和增殖方法、自然杀伤细胞的 制备方法、以及具有使自然杀伤细胞增殖的作用的物质的筛选方法。 本发明在医疗领域和食品领域等有用。
背景技术：
自然杀伤细胞(NK细胞)是对各种肿瘤细胞或病毒感染细胞、以 及具有不同的主要组织相容性抗原的细胞具有细胞毒性的细胞群，主 要通过识别自身、非自身的受体来调节激活或其抑制。
可以认为NK细胞作为参与自然免疫的淋巴细胞的一种，担负着 重要机能，特别是在病毒感染中，对于在建立由T淋巴细胞和B淋巴细 胞介导的获得免疫之前的初期感染中的免疫应答具有极重要的作用。
即，即使T淋巴细胞和B淋巴细胞正常，在自然杀伤功能缺损 的免疫功能不全患者或小鼠中也非常容易感染特定的病毒。近年来还 明确了 NK细胞的受体可识别特定的病毒产物。
如上所述，由于NK细胞的与肿瘤免疫相关的各种机能，人们尝 试将其有效地用于除去推定为肿瘤治疗或肿瘤的发生源的病毒感染 细胞。
已知由实验动物获得NK细胞的方法是由脾脏、血液、骨髓等采 集细胞进行纯化的方法，但N K细胞在各组织中都只以低比例含有， 因此为了确保实验所必需的NK细胞，必须具有熟练的技术和相应的 设备。
关于NK细胞的制备或增殖方法，已知如果在大量添加白细胞 介素-2的培养液中培养末梢血单核细胞，则对于人，淋巴因子激活的 杀伤淋巴细胞(LAK细胞)在一周左右即可增殖，其中含有较多NK细 胞。最近人们开发出以下的方法对细胞表面几乎不表达I类主要组 织相容性抗原(MHC-I)的人B细胞林721.221照射放射线,制成使其失 去分裂能力的状态，将其与末梢血单核细胞一起混合培养5-6天，从其中纯化NK,再继续培养，从而大重获得NK细胞的方法(例如非专利 文献l).
还分別公开有人NK细胞的增殖方法，该方法包含将末梢血单 核细胞和人Wilms肿瘤细胞抹HFWT混合培养的步騍(专利文献1); 以及提高动物的自然杀伤淋巴细胞的活性的方法，该方法是以共抚亚 油酸类为有效成分进行的(专利文献2).但是，专利文献l所公开的技 术是通过将末梢血单核细胞和人Wilms肺癩细胞林HFWT混合培养来 增殖NK细胞的方法，该文献中并未对采集体内增殖的NK细胞的方 法、或使自然杀伤活性提高的因子的筛选进行^^开.专利文献2是对 于因共轭亚油酸类而提高的杀伤淋巴细胞在脾脏中的变化进行追踪， 并未对采集体内增殖的NK细胞的方法、或使自然杀伤活性提高的因 子的舜选进行公开.
目前，最常规的NK细胞活性(自然杀伤活性NK活性)的测定方 法是观察其对人562细胞或小鼠淋巴瘤细胞Yac-1的细胞毒性，其方 法是将含有用"Cr等放射能标记的Yac-l细胞的细胞群进行共培养， 测定释放到培养上清中的放射活性的方法.在机体内测定NK活性的 方法是将与上述同样进行了放射能标记的肿瘤细胞移植到机体内，或 使动物感染病毒等，然后进行观察.上迷方法都需要特殊的设施或设 备.
已知乳铁蛋白是具有抗菌作用、免疫激活作用、抗肿瘤作用等各 种作用的乳蛋白.乳铁蛋白是来自乳的糖蛋白，安全性髙，可长期连 续使用，其本身几乎无味无臭，作为各种食品、医葯品、饲料的添加 物，是广泛应用性高的蛋白质.
专利文献3(曰本特表2002-515893号)中提出了对患者刺激NK细 胞的方法，该方法包含将含有人乳铁蛋白变异体的组合物施用于患者 的步尿.但是，专利文献3中并未记栽乳铁蛋白变异体刺激NK细胞 的实际效果，其根据不明确.
Toll样受体(TLR)可识别各种细菌菌体构成成分，不仅识别自然免 疫中的细菌，对获得免疫的激活也担负着重要的功能，可以认为它可 识別不同的病原体成分，具有引发独立的应答的功能.目前，哺乳动 物中，Toll样受体包含10个家族成员，已鉴定出各TolI样受体所识别 的病原体构成成分(配体).这些作为病原体构成成分的配体中含有脂质、糖、蛋白质、核酸等(非专利文献2、非专利文献3). 专利文献l:特开2001-14卯69号公报 专利文献2:特表2001-503430号/>报 专利文献3:特表2002-515893号公报
非专利文献l: Proc.Natl. Acad.Sci"USA、笫94巻、1997年、笫 13140^13145页
非专利文献2: Molecular Medicine、笫39巻、2002年、笫238-246页
非专利文献2: Molecular Medicine、笫40巻、2003年、笫186-193页
发明内容
本发明的课题在于提供在体内使NK细胞增殖的技术、以及具 有使NK细胞增殖的作用的物质的筛选方法.
本发明人对舜选使自然杀伤活性提高的来自饮料食品的因子的方 法进行了研究，发现将来自食物(乳)的因子一一乳铁蛋白施用于动物 一定期间，在该施用期间内，以特定的时间安排施用ToH样受体的配 体(Toll样受体配体)，則该动物的腹腔内，腹腔内细胞中的NK细胞的 比例显著增加.还发现根据上迷方法，可在腹腔内诱导NK细胞， 因此可简便地进行自然杀伤活性分析或NK细胞的采集，从而完成了 本发明.
要解决上迷课趙的本申请的第一项发明是动物的NK细胞的增殖 剂，其特征在于包括含有乳铁蛋白的笫1刑、含有Toll样受体配体 的笫2剂，且上述笫l剂和笫2刑分别包装.本发明的NK细胞的增殖 刑以下述1)-3)其中之一作为优选方式.
1) 上述笫1剂是以每公斤体重10^2000mg/天的乳铁蛋白的量，连 续施用5-10天，上述笫2刑是在笫1刑施用结束日的5<2天前，以每 公斤体重10-1000 jig/天的Toll样受体配体的量施用
2) 舍有乳铁蛋白的笫l刑为经口施用，含有Toll样受体配体的笫 2剂为腹腔内施用.
3) 上述Toll样受体配体为聚肌胞苷酸(以下可称为"聚IC"). 本申请的笫二项发明是动物中的NK细胞的增殖方法，其特征在于将乳铁蛋白和ToII样受体配体施用于除人之外的动物.本发明的 NK细胞的增殖方法以下迷4)-6)其中之一作为优选方式.
4) 将乳铁蛋白连续施用5-10天，每公斤体重的施用量是10-2000 mg/天，在乳铁蛋白施用结束日的5>2天前施用Toll样受体配体，每公 斤体重的施用量是l(MOOO吗/天.
5) 经口施用乳铁蛋白，腹腔内施用Toll样受体配体.
6) 上述Toll样受体配体为聚肌胞苷酸.
本申请的笫三项发明是NK细胞的制备方法，其特征在于将乳 铁蛋白和Toll样受体配体施用于除人之外的动物，从该动物采集NK 细胞.本发明的NK细胞的制备方法以下述7)-9)其中之一作为优选方 式.
7) 将乳铁蛋白连续施用于除人之外的动物S-10天，每公斤体重的 施用量是10^2000 mg/天，在乳铁蛋白施用结束日的5-2天前施用Toll 样受体配体，每公斤体重的施用重是10-1000吗/天，由该动物采集自 然杀伤细胞.
8) 经口施用乳铁蛋白，腹腔内施用Toll样受体配体，从腹腔采集 自然杀伤细胞.
9) 上述Toll样受体配体为聚肌胞苷酸.
本申请的笫四项发明是在动物的机体内筛选具有使NK细胞增殖 的作用的物质的方法，该方法包舍将受检物质和Toll样受体配体施用 于除人之外的动物，检测该动物中的NK细胞的谦导.本发明的筛选 方法以下述10>13)其中之一作为优选方式.
10) 将受检物质连续用于于除人之外的动物5-10天，在受检物质 施用结束日的5-2天前施用Toll样受体配体.
11) 经口施用受检物质，腹腔内施用Toll样受体配体.
12) 上述Toll样受体配体为聚肌胞苷酸.
13) 上述受检物质为饮料食品或其成分.
本申请的笫五項发明是乳铁蛋白和Toll样受体配体在动物的自然 杀伤细胞的增殖剂制备中的应用，其特征在于上述自然杀伤细胞的 增殖剂包括含有乳铁蛋白的笫l刑、含Toll样受体配体的笫2刑，且 上述笫1刑和笫2刑分别包装.本发明的应用以下述M)-16)其中之一 作为优选方式.14) 上述笫1剂是以每公斤体重10-2000 mg/天的乳铁蛋白的量，连续施用5-10天，上述笫2剂是在第1刑施用结束日的5-2天前，以每公斤体重10-1000 ng/天的Toll样受体配体的量施用.
15) 含有乳铁蛋白的笫1剂为经口施用，含有Toll样受体配体的笫2剂为腹腔内施用.
16) 上迷Toll样受体配体为聚肌胞苷酸.
实施发明的最佳方式
下面，对本发明的优选实施方案进行详细说明.不过，本发明并不限定于以下的优选实施方案，可在本发明的范围内自由变更.另外，如没有特别说明，本说明书中的百分比表示质量百分比.
本发明的动物的NK细胞的堦殖剂包括含有乳铁蛋白的第1剂、含Toll样受体配体的笫2剂，且上逆笫1刑和笫2剂分別包装.
本发明中使用的乳铁蛋白可以使用以下的乳铁蛋白即以市售的乳铁蛋白或哺乳动物(例如人、牛、山羊、绵羊、马等)的初乳、过渡乳、成熟乳、末乳或这些乳的处理物一一脱脂乳、乳清蛋白等为原料，例如通过离子交换色谱等常规方法，从上述原料中分离而获得.其中，优选使用以工业化規模制备的市售乳铁蛋白(例如森永乳业公司制造).还可以使用通过基因工程的方法，在微生物、动物细胞、转基因动物等中生产的乳铁蛋白，只要无损乳铁蛋白对NK细胞的增殖作用，氨基酸序列被改变或被修饰的变异体也包含在本发明的乳铁蛋白中.
本发明中，乳铁蛋白中的金属含量没有特别限定，可以使用选自下述的乳铁蛋白的任一种、两种或以上的混合物通过盐酸或柠檬酸对乳铁蛋白进行脱铁的脱辅基型乳铁蛋白；用铁、铜、锌、锰等金属使该脱辅基型乳铁蛋白螯合而得到的饱和度为100%状态的金属饱和乳铁蛋白；以及金属以低于100%的各种饱和度鍵合状态的金属部分饱和乳铁蛋白.
本发明中使用的Toll样受体配体只要是识別目前已确认的Toll样受体1-10的家族成员的配体即可，可以是任何一种，其中优选脂多糖、p-葡聚糖、双链RNA、聚肌胞苷酸(聚IC)、泰素等抗痛剂、防御素、热休克蛋白、血纤蛋白元、透明质酸分解产物等，从在施用本发明的NK细胞的增殖刑的动物中、优选腹腔内诱导NK细胞并使其增殖的角
8度考虑，特别优选使用聚IC.不过，即使是目前尚未确认的Toll样受体配体，只要可以与乳铁蛋白一起使动物的NK细胞增殖，也可用于本发明中.
本发明的NK细胞的增殖剂中，上述乳铁蛋白和Toll样受体配体分别包装.本发明中的分别包装是指乳铁蛋白和Toll样受体配体呈分离状态，可分別施用，典型的是乳铁蛋白和Toll样受体配体分别装在容器或袋子等中.含有乳铁蛋白的笫l刑、以及含有Toll样受体配体的笫2剂可分别施用于动物.
上述笫1剂是以每公斤动物体重优选10-2000 mg/天、更优选100-1000mg/天的乳铁蛋白的重施用.施用方法没有特别限定，优逸经口施用.可将上述施用量分成每天一史至数次，优选连续施用5-10天，更优选连续施用7-8天.
上述笫2刑是以每公斤动物体重优选10-1000 pig/天、更优选50-200吗/天、进一步优选约100叫/天的Toll样受体配体的量施用，笫2剂优选一次性施用上述的量，特别优选一次性施用约100 jig/kg的量.第2剂的施用方法没有特别限定，优逸腹腔内施用.笫2刑在乳铁蛋白施用结束日的5-2天前、优选在3天前一次性施用.
第1刑和笫2剂只要制备成上迷的施用方法和施用时间即可，对剂型没有特别限定.笫1剂和笫2刑除含有乳铁蛋白和Toll样受体配体外，还可以含有不损害上述成分的保存和作用的其它成分，例如栽体、赋型剂、pH调节剂等.
本发明的动物的NK细胞的堦殖方法包含将乳铁蛋白和Toll样受体配体施用于动物.乳铁蛋白和Toll样受体配体可以分别是供本发明的NK细胞的增殖剂的笫1剂和第2刑.
上述动物只要是通过施用乳铁蛋白和Toll样受体配体来诱导NK细胞并使其增殖的动物即可，没有特別限定，可以是小鼠、大鼠、山羊、綿羊、马、牛等.
乳铁蛋白和Toll样受体配体的施用方法和施用时间安排与上迷的本发明的NK细胞的增殖刑的相关描述相同.通过施用乳铁蛋白和Toll样受体配体，在经施用的动物中诱导NK细胞并使其增殖.特别是在施用了 Toll样受体配体的脏器或组织中、例如在腹腔内施用时在腹腔内诱导NK细胞.施用Toll样受体配体的优选的时间可以通过预先进行预备试验来确定，以便在所使用的动物中有效地诱导NK细胞.即，对于连续施用乳铁蛋白的动物，改变预定的孔铁蛋白施用结束日到施用Toll样受体配体的期间，施用Toll样受体配体，比较NK细胞的诱导情况，由此可确定优选的条件.优选的条件一旦确定，采用同种动物时，可以按照该条件设定施用时间.
增殖的NK细胞的确认例如可通过对采集自动物的脏器或组织、例如腹腔的细胞，使用识别NK细胞的标记抗体，测定与抗体反应的阳性细胞的比例来进行.例如使用小鼠作为动物时，使用抗CD4外/Pan-NK细胞抗体(例如Pharmingen公司制备)，通过测定CD4外/Pan-NK细胞抗体阳性细胞的比例来进行.此时，为了减少经由与背景相关的CD16/CD32 (FeYni/n受体)的抗体结合，优选使用抗小鼠CD16/CD32抗体或抗大鼠CD32抗体来阻断这些抗原.使用小鼠C57BL/6(抹)时，优选使用抗NKl.l抗体作为识别NK细胞的抗体，通过测定NKl.l阳性细胞的比例来进行.具体来说，如实施例的记栽，可以用FITC标记的NK1.1抗体对细胞进行染色，用流式细胞仪(例如FACSTMCalibur: Becton， Dickinson公司制造)来測定NK1.1阳性细胞的比例.
如上所述，通过从NK细胞得到増殖的动物中采集NK细胞，可以制备NK细胞.从动物中采集NK细胞可以按照预先设定的时间安排，在预想NK细胞得到有效诱导时进行.另外，施用乳铁蛋白后，要在一天之内不要施用任何物质，然后可采集増殖的NK细胞.
NK细胞的采集可按照常規方法进行.例如NK细胞在腹腔内被诱导时，用洗涤液(例如Hank，s溶液)将动物的腹腔内清洗1次或多次，可通过收集洗涤液来采集.从含有NK细胞的洗涤液中纯化NK细胞的方法例如有使用细胞分选仪的方法.
由本发明的方法得到的NK细胞有望保持高的细胞毒性.已知NK细胞具有抗病毒活性或抗肿痏活性.因此，由本发明的方法得到的NK细胞例如可用于疱务病毒或巨细胞病毒等病毒感染症的细胞疗法、对患者进行LAK(淋巴因子激活杀伤)疗法.
本发明显示通过施用Toll样受体配体，可提高乳铁蛋白的NK细胞增殖作用.因此，通过使用Toll样受体配体，可以提高具有NK细胞増殖作用的物质的该作用，可以灵敏度较高地筛选具有NK细胞增殖作用的物质.即，将受检物质和Toll样受体配体施用于动物，通过检测该动物中NK细胞的诱导，可以筛选具有NK细胞增殖作用的物质.
具体来说，例如，按照上述对乳铁蛋白确定的施用时间安排，将乳铁蛋白换为受检物质，将受检物质和Toll样受体配体施用于动物，如果动物中诱导了 NK细胞，則可认为上述受检物质具有NK细胞增殖活性.
施用方法可以与本发明的NK细胞的増殖剂同样.优选受检物质经口施用，Toll样受体配体为腹腔内施用.NK细胞的诱导的检测与上述同样，例如使用识别NK细胞的标记抗体，通过测定与抗体反应的阳性细胞的比例来检测.这样，对于被检測出诱导了 NK细胞的受检物质，进一步优选将该受检物质单独施用于动物，确认该动物的脏器或组织例如脾脏等中NK细胞的增殖情况.
优选的受检物质有动物的乳等饮料食品、或这些饮料食品中的各种成分.
通过本发明的筛选方法发现的具有NK细胞增殖作用的物质、特别是食品或其成分可用作NK细胞的增殖、或目的在于预防可通过NK细胞的增殖来预防的疾病的葯物或保健食品或它们的成分.
实施例
下面给出实施例，更具体地说明本发明，但本发明不限定为以下的实施例.
实施例1
本实施例中，进行了用于研究乳铁蛋白的NK细胞增殖效果的试
验，
(1)试验方法
将45只7周龄的C57BL/6小鼠(购自日本Charles River)分成5组，每组9只，馴化铜养l周，使用经口唯飼针，将溶解于生理盐水(大冢制药公司制迭)的牛乳铁蛋白溶液连续7天施用于各组，牛乳铁蛋白(森永乳业抹式会社制备)的施用量为O(对照试样)、30、 100、 300、 1000mg/kg体重.施用结束后，放置l天，然后由各小鼠采集脾脏，制备脾细胞的悬浮液.将制备的细胞悬浮液中的细胞数调节成每一检样中有
2><106个细胞.使用含有1。/。胎牛血清的细胞清洗(Becton Dickinson公 司制备)溶液(以下称为"稀释緩沖液")，将抗小鼠CD16/CD32单克隆 抗体(Fc BlockTM、 Becton Dickinson公司制备)稀释为1 ng/10fi1的浓 度，将该溶液以每一检样10jil添加到上迷细胞悬浮液中，在冰上静置 5分中，阻断FcylII/II受体.
然后添加10 |tl用稀释援冲液制备成1 jig/10 fil浓度的FITC标记 的抗小鼠NK1.1抗体(Pharmingen公司制备)溶液并混合，静置25分 钟，对NKl.l阳性的NK细胞进行染色.接着，以下述方法洗涤细胞 添加500 pl稀释援冲液，以35000 rpm离心5分钟，将该洗涤搮作重 复2次.然后向细胞中添加500 pi FACSTM lysing solution (Becton Dickinson公司制备)，在室温下静里10分钟，使红细胞溶解.接着用 上述洗涤方法将细胞洗涤2次，向回收的细胞中添加lml稀释緩冲液， 制备细胞悬浮液.制备的细胞悬浮液用尼龙筛网(nylon screen) (flon工 业公司制造、产品编号F-310(M34)过滤，回收到聚乙烯管中，用流 式细胞仪(FACSTMCalibur: Becton Dickinson公司制造)测定NK1.1阳 性细胞的比例，
(2)试验结果
结果，在乳铁蛋白的施用量为10CKM)0mg/kg体重的施用组中，脾 细胞中的NKU阳性细胞、即NK细胞的比例与用量相关性增加.
[实施例2
本试验中，进行了研究乳铁蛋白和Toll样受体配体诱导NK细胞 增殖的效果的试验. (1)试验方法
与实施例l同样，将每组9只共63只小鼠驯化飼养1周，三组为 乳铁蛋白施用组(LF组.乳铁蛋白施用量300 mg/kg体重/天)，余下 的4组为对照组(施用生理盐水).这里制定了如下的施用时间安排使 用经口哏祠针，对全部7组的小鼠连续7天施用各试样(施用乳铁蛋白、 施用生理盐水)，然后一天内不施用任何物质，笫8天为施用结束日. 这里，对三组乳铁蛋白施用组以及三组对照组分别设定为在施用结 束日的7天前腹腔内施用100 |ig聚IC (聚肌胞苷酸钠盐、产品编号:P-0913. Sigma公司制备)的组、在施用结束日的3天前腹腔内施用 100jig聚IC的组、在施用结束日的l天前腹腔内施用IOO吗聚IC的 组.剩下的一组对照组设定为不施用聚IC的组，分别进行试验.
施用结束后，向各组的小鼠腹腔中注入5 ml Hank's平衡盐溶液 (Hank，s液"Nissui"、日水制药/〉司制备)，清洗腹腔内，重复进行2 次，回收洗涤液，制备腹腔内细胞溶液.接着，按照与实施例1同样 的方法，使用FITC标记的NK1.1抗体(Pharmingen公司制备)，对腹 腔内细胞进行染色，用流式细胞仪(FACSTMCaHbur: Becton Dickinson 公司制造)测定NKl.l阳性细胞的比例.
(2)试验结果
上述试验的结果表示在表l中.结果表明，在乳铁蛋白施用组中， 施用结束日的3天前施用聚IC的组中，腹腔内NK细胞的比例和NK 细胞的绝对数量显著增加.但是，其它乳铁蛋白施用组和对照组中， 腹腔内NK细胞的比例和NK细胞的绝对数量都未见显著增加.另外， 在三组乳铁蛋白施用组中，都可见脾脏中NK细胞的比例和NK细胞的 绝对数量的增加，但未见到象在上述腹腔内见到的显著变化.
以上结果表明在上述的施用条件下，特别是在连续7天施用乳 铁蛋白、在第8天结束施用的施用时间安排上，通过在施用结束日的3 天前施用聚IC，腹腔内特异性诱导NK细胞，且可使NK细胞的比例 和NK细胞的绝对数量增加.
表1
施用聚ICNK细胞的比例(y。)NK细胞数(x105)
4.68±0.981.58±0.57
3.97±1.841.55±0.83
结局结束前笫7天LF组 对照组3,77±1.89 4.17±1.881.51±1.06 1.43±0.98
结局结束前笫3天LF组 对照组11.28±4,53* 7.41±2.70 5.56±2.45* 1.99±1,01
结局结束前笫1天LF组 对照组4.89±1.33 3.83±1.811.35±0,63 0.95±0.87
表示对对照组进行Tukey-Kramer，s检验，显著水平p<0.05.由实施例1和实施例2的结果可见通过经口施用乳铁蛋白，至 少在脾脏中NK细胞增殖，以及进一步通过腹腔内施用聚IC, NK细 胞在腹腔内被诱导.以上可认为施用在动物的机体内具有使NK细 胞增殖的作用的其它物质，以此代替乳铁蛋白，再例如腹腔内施用聚 IC等Toll样受体配体，可在腹腔内诱导NK细胞.将所述具有NK细 胞增殖作用的物质和Toll样受体配体组合进行的NK细胞的诱导可用 于具有NK细胞增殖作用的物质的篩选.
产业实用性
本发明产生的主要效杲如下所示.
(1) 通过施用乳铁蛋白和Toll样受体配体、特别是聚IC，可以特 异性诱导包括人的动物的NK细胞、且可使其大重增殖.此时，其它 细胞群几乎不会混杂，因此使用标记抗体制备NK细胞时，可以提高 采集量或纯度.
(2) 可在保持高的细胞毒性的状态下有效获得NK细胞，因此可用 作恶性肿瘤的治疗等细胞免疫疗法等的药物.
(3) 通过经口施用，无需放射能或特殊的设施，即可在体内筛选使 自然杀伤活性(特别是对病毒)提高乃至激活的来自饮料食品(食物)的因 子.
权利要求
1.筛选在动物活体内具有使自然杀伤细胞增殖的作用的物质的方法，该方法包含每天向除人之外的受试动物施用受试物质，施用7天，在开始施用所述受试物质后的第五天向所述动物施用Toll样受体配体，然后检测所述动物中自然杀伤细胞的诱导。
2. 权利要求1的方法，其中在开始施用所述受试物质后的第8 天不向所述动物施用任何物质，然后检测所述动物中自然杀伤细胞的 诱导。
3. 权利要求1或2所述的方法，其中，所述受试物质经口施用， 所述Toll样受体配体为腹腔内施用。
4. 权利要求1-3中任一项的方法，其中，所述的Toll样受体配 体为聚肌胞苷酸。
5. 权利要求1-4中任一项的方法，其中，上述受检物质为食品、 饮料或其成分。
6. 在除人之外的动物细胞中增殖自然杀伤细胞的方法，该方法 包括向受试动物施用作为第1剂的乳铁蛋白和作为第2剂的Toll样 受体配体，其中，所述的第1剂包含每公斤体重10-2000 mg/天、施 用7天的剂量，第2剂包含以每z^斤体重10-1000 ng/天的量在第1 剂开始施用后5天施用的一个剂量。
7. 权利要求6的增殖自然杀伤细胞的方法，其中，所述乳铁蛋 白经口施用，所述Toll样受体配体为腹腔内施用。
8. 权利要求6或7的增殖自然杀伤细胞的方法，其中，所述的 Toll样受体配体为聚肌胞苦酸。
9. 生产自然杀伤细胞的方法，该方法包括向除人之外的受试动 物施用作为第1剂的乳铁蛋白和作为第2剂的Toll样受体配体，并 从所述动物中收集自然杀伤细胞，其中，所述的第l剂包含每公斤体 重10-2000 mg/天、施用7天的剂量，第2剂包含以每7>斤体重10-1000 jig/天的量在第l剂开始施用后5天施用的一个剂量。
10. 权利要求9的生产自然杀伤细胞的方法，其中，所述乳铁蛋 白经口施用，所述Toil样受体配体为腹腔内施用，并且，所述的自 然杀伤细胞从腹腔采集。
11. 权利要求9或10的生产自然杀伤细胞的方法，其中，所述的Toll样受体配体为聚肌胞苷酸。
全文摘要
在正在施用乳铁蛋白的动物的腹腔内施用聚肌胞苷酸等Toll样受体配体，使NK细胞在腹腔内增殖，通过由腹腔采集NK细胞来获得NK细胞。
文档编号A61K49/00GK101658678SQ20091016119
公开日2010年3月3日 申请日期2005年9月7日 优先权日2004年9月15日
发明者久原彻哉, 伊藤岳人 申请人:森永乳业株式会社
技术领域：
本发明涉及自然杀伤细胞的增殖剂和增殖方法、自然杀伤细胞的 制备方法、以及具有使自然杀伤细胞增殖的作用的物质的筛选方法。 本发明在医疗领域和食品领域等有用。
背景技术：
自然杀伤细胞(NK细胞)是对各种肿瘤细胞或病毒感染细胞、以 及具有不同的主要组织相容性抗原的细胞具有细胞毒性的细胞群，主 要通过识别自身、非自身的受体来调节激活或其抑制。
可以认为NK细胞作为参与自然免疫的淋巴细胞的一种，担负着 重要机能，特别是在病毒感染中，对于在建立由T淋巴细胞和B淋巴细 胞介导的获得免疫之前的初期感染中的免疫应答具有极重要的作用。
即，即使T淋巴细胞和B淋巴细胞正常，在自然杀伤功能缺损 的免疫功能不全患者或小鼠中也非常容易感染特定的病毒。近年来还 明确了 NK细胞的受体可识别特定的病毒产物。
如上所述，由于NK细胞的与肿瘤免疫相关的各种机能，人们尝 试将其有效地用于除去推定为肿瘤治疗或肿瘤的发生源的病毒感染 细胞。
已知由实验动物获得NK细胞的方法是由脾脏、血液、骨髓等采 集细胞进行纯化的方法，但N K细胞在各组织中都只以低比例含有， 因此为了确保实验所必需的NK细胞，必须具有熟练的技术和相应的 设备。
关于NK细胞的制备或增殖方法，已知如果在大量添加白细胞 介素-2的培养液中培养末梢血单核细胞，则对于人，淋巴因子激活的 杀伤淋巴细胞(LAK细胞)在一周左右即可增殖，其中含有较多NK细 胞。最近人们开发出以下的方法对细胞表面几乎不表达I类主要组 织相容性抗原(MHC-I)的人B细胞林721.221照射放射线,制成使其失 去分裂能力的状态，将其与末梢血单核细胞一起混合培养5-6天，从其中纯化NK,再继续培养，从而大重获得NK细胞的方法(例如非专利 文献l).
还分別公开有人NK细胞的增殖方法，该方法包含将末梢血单 核细胞和人Wilms肿瘤细胞抹HFWT混合培养的步騍(专利文献1); 以及提高动物的自然杀伤淋巴细胞的活性的方法，该方法是以共抚亚 油酸类为有效成分进行的(专利文献2).但是，专利文献l所公开的技 术是通过将末梢血单核细胞和人Wilms肺癩细胞林HFWT混合培养来 增殖NK细胞的方法，该文献中并未对采集体内增殖的NK细胞的方 法、或使自然杀伤活性提高的因子的筛选进行^^开.专利文献2是对 于因共轭亚油酸类而提高的杀伤淋巴细胞在脾脏中的变化进行追踪， 并未对采集体内增殖的NK细胞的方法、或使自然杀伤活性提高的因 子的舜选进行公开.
目前，最常规的NK细胞活性(自然杀伤活性NK活性)的测定方 法是观察其对人562细胞或小鼠淋巴瘤细胞Yac-1的细胞毒性，其方 法是将含有用"Cr等放射能标记的Yac-l细胞的细胞群进行共培养， 测定释放到培养上清中的放射活性的方法.在机体内测定NK活性的 方法是将与上述同样进行了放射能标记的肿瘤细胞移植到机体内，或 使动物感染病毒等，然后进行观察.上迷方法都需要特殊的设施或设 备.
已知乳铁蛋白是具有抗菌作用、免疫激活作用、抗肿瘤作用等各 种作用的乳蛋白.乳铁蛋白是来自乳的糖蛋白，安全性髙，可长期连 续使用，其本身几乎无味无臭，作为各种食品、医葯品、饲料的添加 物，是广泛应用性高的蛋白质.
专利文献3(曰本特表2002-515893号)中提出了对患者刺激NK细 胞的方法，该方法包含将含有人乳铁蛋白变异体的组合物施用于患者 的步尿.但是，专利文献3中并未记栽乳铁蛋白变异体刺激NK细胞 的实际效果，其根据不明确.
Toll样受体(TLR)可识别各种细菌菌体构成成分，不仅识别自然免 疫中的细菌，对获得免疫的激活也担负着重要的功能，可以认为它可 识別不同的病原体成分，具有引发独立的应答的功能.目前，哺乳动 物中，Toll样受体包含10个家族成员，已鉴定出各TolI样受体所识别 的病原体构成成分(配体).这些作为病原体构成成分的配体中含有脂质、糖、蛋白质、核酸等(非专利文献2、非专利文献3). 专利文献l:特开2001-14卯69号公报 专利文献2:特表2001-503430号/>报 专利文献3:特表2002-515893号公报
非专利文献l: Proc.Natl. Acad.Sci"USA、笫94巻、1997年、笫 13140^13145页
非专利文献2: Molecular Medicine、笫39巻、2002年、笫238-246页
非专利文献2: Molecular Medicine、笫40巻、2003年、笫186-193页
发明内容
本发明的课题在于提供在体内使NK细胞增殖的技术、以及具 有使NK细胞增殖的作用的物质的筛选方法.
本发明人对舜选使自然杀伤活性提高的来自饮料食品的因子的方 法进行了研究，发现将来自食物(乳)的因子一一乳铁蛋白施用于动物 一定期间，在该施用期间内，以特定的时间安排施用ToH样受体的配 体(Toll样受体配体)，則该动物的腹腔内，腹腔内细胞中的NK细胞的 比例显著增加.还发现根据上迷方法，可在腹腔内诱导NK细胞， 因此可简便地进行自然杀伤活性分析或NK细胞的采集，从而完成了 本发明.
要解决上迷课趙的本申请的第一项发明是动物的NK细胞的增殖 剂，其特征在于包括含有乳铁蛋白的笫1刑、含有Toll样受体配体 的笫2剂，且上述笫l剂和笫2刑分别包装.本发明的NK细胞的增殖 刑以下述1)-3)其中之一作为优选方式.
1) 上述笫1剂是以每公斤体重10^2000mg/天的乳铁蛋白的量，连 续施用5-10天，上述笫2刑是在笫1刑施用结束日的5<2天前，以每 公斤体重10-1000 jig/天的Toll样受体配体的量施用
2) 舍有乳铁蛋白的笫l刑为经口施用，含有Toll样受体配体的笫 2剂为腹腔内施用.
3) 上述Toll样受体配体为聚肌胞苷酸(以下可称为"聚IC"). 本申请的笫二项发明是动物中的NK细胞的增殖方法，其特征在于将乳铁蛋白和ToII样受体配体施用于除人之外的动物.本发明的 NK细胞的增殖方法以下迷4)-6)其中之一作为优选方式.
4) 将乳铁蛋白连续施用5-10天，每公斤体重的施用量是10-2000 mg/天，在乳铁蛋白施用结束日的5>2天前施用Toll样受体配体，每公 斤体重的施用量是l(MOOO吗/天.
5) 经口施用乳铁蛋白，腹腔内施用Toll样受体配体.
6) 上述Toll样受体配体为聚肌胞苷酸.
本申请的笫三项发明是NK细胞的制备方法，其特征在于将乳 铁蛋白和Toll样受体配体施用于除人之外的动物，从该动物采集NK 细胞.本发明的NK细胞的制备方法以下述7)-9)其中之一作为优选方 式.
7) 将乳铁蛋白连续施用于除人之外的动物S-10天，每公斤体重的 施用量是10^2000 mg/天，在乳铁蛋白施用结束日的5-2天前施用Toll 样受体配体，每公斤体重的施用重是10-1000吗/天，由该动物采集自 然杀伤细胞.
8) 经口施用乳铁蛋白，腹腔内施用Toll样受体配体，从腹腔采集 自然杀伤细胞.
9) 上述Toll样受体配体为聚肌胞苷酸.
本申请的笫四项发明是在动物的机体内筛选具有使NK细胞增殖 的作用的物质的方法，该方法包舍将受检物质和Toll样受体配体施用 于除人之外的动物，检测该动物中的NK细胞的谦导.本发明的筛选 方法以下述10>13)其中之一作为优选方式.
10) 将受检物质连续用于于除人之外的动物5-10天，在受检物质 施用结束日的5-2天前施用Toll样受体配体.
11) 经口施用受检物质，腹腔内施用Toll样受体配体.
12) 上述Toll样受体配体为聚肌胞苷酸.
13) 上述受检物质为饮料食品或其成分.
本申请的笫五項发明是乳铁蛋白和Toll样受体配体在动物的自然 杀伤细胞的增殖剂制备中的应用，其特征在于上述自然杀伤细胞的 增殖剂包括含有乳铁蛋白的笫l刑、含Toll样受体配体的笫2刑，且 上述笫1刑和笫2刑分别包装.本发明的应用以下述M)-16)其中之一 作为优选方式.14) 上述笫1剂是以每公斤体重10-2000 mg/天的乳铁蛋白的量，连续施用5-10天，上述笫2剂是在第1刑施用结束日的5-2天前，以每公斤体重10-1000 ng/天的Toll样受体配体的量施用.
15) 含有乳铁蛋白的笫1剂为经口施用，含有Toll样受体配体的笫2剂为腹腔内施用.
16) 上迷Toll样受体配体为聚肌胞苷酸.
实施发明的最佳方式
下面，对本发明的优选实施方案进行详细说明.不过，本发明并不限定于以下的优选实施方案，可在本发明的范围内自由变更.另外，如没有特别说明，本说明书中的百分比表示质量百分比.
本发明的动物的NK细胞的堦殖剂包括含有乳铁蛋白的第1剂、含Toll样受体配体的笫2剂，且上逆笫1刑和笫2剂分別包装.
本发明中使用的乳铁蛋白可以使用以下的乳铁蛋白即以市售的乳铁蛋白或哺乳动物(例如人、牛、山羊、绵羊、马等)的初乳、过渡乳、成熟乳、末乳或这些乳的处理物一一脱脂乳、乳清蛋白等为原料，例如通过离子交换色谱等常规方法，从上述原料中分离而获得.其中，优选使用以工业化規模制备的市售乳铁蛋白(例如森永乳业公司制造).还可以使用通过基因工程的方法，在微生物、动物细胞、转基因动物等中生产的乳铁蛋白，只要无损乳铁蛋白对NK细胞的增殖作用，氨基酸序列被改变或被修饰的变异体也包含在本发明的乳铁蛋白中.
本发明中，乳铁蛋白中的金属含量没有特别限定，可以使用选自下述的乳铁蛋白的任一种、两种或以上的混合物通过盐酸或柠檬酸对乳铁蛋白进行脱铁的脱辅基型乳铁蛋白；用铁、铜、锌、锰等金属使该脱辅基型乳铁蛋白螯合而得到的饱和度为100%状态的金属饱和乳铁蛋白；以及金属以低于100%的各种饱和度鍵合状态的金属部分饱和乳铁蛋白.
本发明中使用的Toll样受体配体只要是识別目前已确认的Toll样受体1-10的家族成员的配体即可，可以是任何一种，其中优选脂多糖、p-葡聚糖、双链RNA、聚肌胞苷酸(聚IC)、泰素等抗痛剂、防御素、热休克蛋白、血纤蛋白元、透明质酸分解产物等，从在施用本发明的NK细胞的增殖刑的动物中、优选腹腔内诱导NK细胞并使其增殖的角
8度考虑，特别优选使用聚IC.不过，即使是目前尚未确认的Toll样受体配体，只要可以与乳铁蛋白一起使动物的NK细胞增殖，也可用于本发明中.
本发明的NK细胞的增殖剂中，上述乳铁蛋白和Toll样受体配体分别包装.本发明中的分别包装是指乳铁蛋白和Toll样受体配体呈分离状态，可分別施用，典型的是乳铁蛋白和Toll样受体配体分别装在容器或袋子等中.含有乳铁蛋白的笫l刑、以及含有Toll样受体配体的笫2剂可分别施用于动物.
上述笫1剂是以每公斤动物体重优选10-2000 mg/天、更优选100-1000mg/天的乳铁蛋白的重施用.施用方法没有特别限定，优逸经口施用.可将上述施用量分成每天一史至数次，优选连续施用5-10天，更优选连续施用7-8天.
上述笫2刑是以每公斤动物体重优选10-1000 pig/天、更优选50-200吗/天、进一步优选约100叫/天的Toll样受体配体的量施用，笫2剂优选一次性施用上述的量，特别优选一次性施用约100 jig/kg的量.第2剂的施用方法没有特别限定，优逸腹腔内施用.笫2刑在乳铁蛋白施用结束日的5-2天前、优选在3天前一次性施用.
第1刑和笫2剂只要制备成上迷的施用方法和施用时间即可，对剂型没有特别限定.笫1剂和笫2刑除含有乳铁蛋白和Toll样受体配体外，还可以含有不损害上述成分的保存和作用的其它成分，例如栽体、赋型剂、pH调节剂等.
本发明的动物的NK细胞的堦殖方法包含将乳铁蛋白和Toll样受体配体施用于动物.乳铁蛋白和Toll样受体配体可以分别是供本发明的NK细胞的增殖剂的笫1剂和第2刑.
上述动物只要是通过施用乳铁蛋白和Toll样受体配体来诱导NK细胞并使其增殖的动物即可，没有特別限定，可以是小鼠、大鼠、山羊、綿羊、马、牛等.
乳铁蛋白和Toll样受体配体的施用方法和施用时间安排与上迷的本发明的NK细胞的增殖刑的相关描述相同.通过施用乳铁蛋白和Toll样受体配体，在经施用的动物中诱导NK细胞并使其增殖.特别是在施用了 Toll样受体配体的脏器或组织中、例如在腹腔内施用时在腹腔内诱导NK细胞.施用Toll样受体配体的优选的时间可以通过预先进行预备试验来确定，以便在所使用的动物中有效地诱导NK细胞.即，对于连续施用乳铁蛋白的动物，改变预定的孔铁蛋白施用结束日到施用Toll样受体配体的期间，施用Toll样受体配体，比较NK细胞的诱导情况，由此可确定优选的条件.优选的条件一旦确定，采用同种动物时，可以按照该条件设定施用时间.
增殖的NK细胞的确认例如可通过对采集自动物的脏器或组织、例如腹腔的细胞，使用识别NK细胞的标记抗体，测定与抗体反应的阳性细胞的比例来进行.例如使用小鼠作为动物时，使用抗CD4外/Pan-NK细胞抗体(例如Pharmingen公司制备)，通过测定CD4外/Pan-NK细胞抗体阳性细胞的比例来进行.此时，为了减少经由与背景相关的CD16/CD32 (FeYni/n受体)的抗体结合，优选使用抗小鼠CD16/CD32抗体或抗大鼠CD32抗体来阻断这些抗原.使用小鼠C57BL/6(抹)时，优选使用抗NKl.l抗体作为识别NK细胞的抗体，通过测定NKl.l阳性细胞的比例来进行.具体来说，如实施例的记栽，可以用FITC标记的NK1.1抗体对细胞进行染色，用流式细胞仪(例如FACSTMCalibur: Becton， Dickinson公司制造)来測定NK1.1阳性细胞的比例.
如上所述，通过从NK细胞得到増殖的动物中采集NK细胞，可以制备NK细胞.从动物中采集NK细胞可以按照预先设定的时间安排，在预想NK细胞得到有效诱导时进行.另外，施用乳铁蛋白后，要在一天之内不要施用任何物质，然后可采集増殖的NK细胞.
NK细胞的采集可按照常規方法进行.例如NK细胞在腹腔内被诱导时，用洗涤液(例如Hank，s溶液)将动物的腹腔内清洗1次或多次，可通过收集洗涤液来采集.从含有NK细胞的洗涤液中纯化NK细胞的方法例如有使用细胞分选仪的方法.
由本发明的方法得到的NK细胞有望保持高的细胞毒性.已知NK细胞具有抗病毒活性或抗肿痏活性.因此，由本发明的方法得到的NK细胞例如可用于疱务病毒或巨细胞病毒等病毒感染症的细胞疗法、对患者进行LAK(淋巴因子激活杀伤)疗法.
本发明显示通过施用Toll样受体配体，可提高乳铁蛋白的NK细胞增殖作用.因此，通过使用Toll样受体配体，可以提高具有NK细胞増殖作用的物质的该作用，可以灵敏度较高地筛选具有NK细胞增殖作用的物质.即，将受检物质和Toll样受体配体施用于动物，通过检测该动物中NK细胞的诱导，可以筛选具有NK细胞增殖作用的物质.
具体来说，例如，按照上述对乳铁蛋白确定的施用时间安排，将乳铁蛋白换为受检物质，将受检物质和Toll样受体配体施用于动物，如果动物中诱导了 NK细胞，則可认为上述受检物质具有NK细胞增殖活性.
施用方法可以与本发明的NK细胞的増殖剂同样.优选受检物质经口施用，Toll样受体配体为腹腔内施用.NK细胞的诱导的检测与上述同样，例如使用识别NK细胞的标记抗体，通过测定与抗体反应的阳性细胞的比例来检测.这样，对于被检測出诱导了 NK细胞的受检物质，进一步优选将该受检物质单独施用于动物，确认该动物的脏器或组织例如脾脏等中NK细胞的增殖情况.
优选的受检物质有动物的乳等饮料食品、或这些饮料食品中的各种成分.
通过本发明的筛选方法发现的具有NK细胞增殖作用的物质、特别是食品或其成分可用作NK细胞的增殖、或目的在于预防可通过NK细胞的增殖来预防的疾病的葯物或保健食品或它们的成分.
实施例
下面给出实施例，更具体地说明本发明，但本发明不限定为以下的实施例.
实施例1
本实施例中，进行了用于研究乳铁蛋白的NK细胞增殖效果的试
验，
(1)试验方法
将45只7周龄的C57BL/6小鼠(购自日本Charles River)分成5组，每组9只，馴化铜养l周，使用经口唯飼针，将溶解于生理盐水(大冢制药公司制迭)的牛乳铁蛋白溶液连续7天施用于各组，牛乳铁蛋白(森永乳业抹式会社制备)的施用量为O(对照试样)、30、 100、 300、 1000mg/kg体重.施用结束后，放置l天，然后由各小鼠采集脾脏，制备脾细胞的悬浮液.将制备的细胞悬浮液中的细胞数调节成每一检样中有
2><106个细胞.使用含有1。/。胎牛血清的细胞清洗(Becton Dickinson公 司制备)溶液(以下称为"稀释緩沖液")，将抗小鼠CD16/CD32单克隆 抗体(Fc BlockTM、 Becton Dickinson公司制备)稀释为1 ng/10fi1的浓 度，将该溶液以每一检样10jil添加到上迷细胞悬浮液中，在冰上静置 5分中，阻断FcylII/II受体.
然后添加10 |tl用稀释援冲液制备成1 jig/10 fil浓度的FITC标记 的抗小鼠NK1.1抗体(Pharmingen公司制备)溶液并混合，静置25分 钟，对NKl.l阳性的NK细胞进行染色.接着，以下述方法洗涤细胞 添加500 pl稀释援冲液，以35000 rpm离心5分钟，将该洗涤搮作重 复2次.然后向细胞中添加500 pi FACSTM lysing solution (Becton Dickinson公司制备)，在室温下静里10分钟，使红细胞溶解.接着用 上述洗涤方法将细胞洗涤2次，向回收的细胞中添加lml稀释緩冲液， 制备细胞悬浮液.制备的细胞悬浮液用尼龙筛网(nylon screen) (flon工 业公司制造、产品编号F-310(M34)过滤，回收到聚乙烯管中，用流 式细胞仪(FACSTMCalibur: Becton Dickinson公司制造)测定NK1.1阳 性细胞的比例，
(2)试验结果
结果，在乳铁蛋白的施用量为10CKM)0mg/kg体重的施用组中，脾 细胞中的NKU阳性细胞、即NK细胞的比例与用量相关性增加.
[实施例2
本试验中，进行了研究乳铁蛋白和Toll样受体配体诱导NK细胞 增殖的效果的试验. (1)试验方法
与实施例l同样，将每组9只共63只小鼠驯化飼养1周，三组为 乳铁蛋白施用组(LF组.乳铁蛋白施用量300 mg/kg体重/天)，余下 的4组为对照组(施用生理盐水).这里制定了如下的施用时间安排使 用经口哏祠针，对全部7组的小鼠连续7天施用各试样(施用乳铁蛋白、 施用生理盐水)，然后一天内不施用任何物质，笫8天为施用结束日. 这里，对三组乳铁蛋白施用组以及三组对照组分别设定为在施用结 束日的7天前腹腔内施用100 |ig聚IC (聚肌胞苷酸钠盐、产品编号:P-0913. Sigma公司制备)的组、在施用结束日的3天前腹腔内施用 100jig聚IC的组、在施用结束日的l天前腹腔内施用IOO吗聚IC的 组.剩下的一组对照组设定为不施用聚IC的组，分别进行试验.
施用结束后，向各组的小鼠腹腔中注入5 ml Hank's平衡盐溶液 (Hank，s液"Nissui"、日水制药/〉司制备)，清洗腹腔内，重复进行2 次，回收洗涤液，制备腹腔内细胞溶液.接着，按照与实施例1同样 的方法，使用FITC标记的NK1.1抗体(Pharmingen公司制备)，对腹 腔内细胞进行染色，用流式细胞仪(FACSTMCaHbur: Becton Dickinson 公司制造)测定NKl.l阳性细胞的比例.
(2)试验结果
上述试验的结果表示在表l中.结果表明，在乳铁蛋白施用组中， 施用结束日的3天前施用聚IC的组中，腹腔内NK细胞的比例和NK 细胞的绝对数量显著增加.但是，其它乳铁蛋白施用组和对照组中， 腹腔内NK细胞的比例和NK细胞的绝对数量都未见显著增加.另外， 在三组乳铁蛋白施用组中，都可见脾脏中NK细胞的比例和NK细胞的 绝对数量的增加，但未见到象在上述腹腔内见到的显著变化.
以上结果表明在上述的施用条件下，特别是在连续7天施用乳 铁蛋白、在第8天结束施用的施用时间安排上，通过在施用结束日的3 天前施用聚IC，腹腔内特异性诱导NK细胞，且可使NK细胞的比例 和NK细胞的绝对数量增加.
表1
施用聚ICNK细胞的比例(y。)NK细胞数(x105)
4.68±0.981.58±0.57
3.97±1.841.55±0.83
结局结束前笫7天LF组 对照组3,77±1.89 4.17±1.881.51±1.06 1.43±0.98
结局结束前笫3天LF组 对照组11.28±4,53* 7.41±2.70 5.56±2.45* 1.99±1,01
结局结束前笫1天LF组 对照组4.89±1.33 3.83±1.811.35±0,63 0.95±0.87
表示对对照组进行Tukey-Kramer，s检验，显著水平p<0.05.由实施例1和实施例2的结果可见通过经口施用乳铁蛋白，至 少在脾脏中NK细胞增殖，以及进一步通过腹腔内施用聚IC, NK细 胞在腹腔内被诱导.以上可认为施用在动物的机体内具有使NK细 胞增殖的作用的其它物质，以此代替乳铁蛋白，再例如腹腔内施用聚 IC等Toll样受体配体，可在腹腔内诱导NK细胞.将所述具有NK细 胞增殖作用的物质和Toll样受体配体组合进行的NK细胞的诱导可用 于具有NK细胞增殖作用的物质的篩选.
产业实用性
本发明产生的主要效杲如下所示.
(1) 通过施用乳铁蛋白和Toll样受体配体、特别是聚IC，可以特 异性诱导包括人的动物的NK细胞、且可使其大重增殖.此时，其它 细胞群几乎不会混杂，因此使用标记抗体制备NK细胞时，可以提高 采集量或纯度.
(2) 可在保持高的细胞毒性的状态下有效获得NK细胞，因此可用 作恶性肿瘤的治疗等细胞免疫疗法等的药物.
(3) 通过经口施用，无需放射能或特殊的设施，即可在体内筛选使 自然杀伤活性(特别是对病毒)提高乃至激活的来自饮料食品(食物)的因 子.
权利要求
1.筛选在动物活体内具有使自然杀伤细胞增殖的作用的物质的方法，该方法包含每天向除人之外的受试动物施用受试物质，施用7天，在开始施用所述受试物质后的第五天向所述动物施用Toll样受体配体，然后检测所述动物中自然杀伤细胞的诱导。
2. 权利要求1的方法，其中在开始施用所述受试物质后的第8 天不向所述动物施用任何物质，然后检测所述动物中自然杀伤细胞的 诱导。
3. 权利要求1或2所述的方法，其中，所述受试物质经口施用， 所述Toll样受体配体为腹腔内施用。
4. 权利要求1-3中任一项的方法，其中，所述的Toll样受体配 体为聚肌胞苷酸。
5. 权利要求1-4中任一项的方法，其中，上述受检物质为食品、 饮料或其成分。
6. 在除人之外的动物细胞中增殖自然杀伤细胞的方法，该方法 包括向受试动物施用作为第1剂的乳铁蛋白和作为第2剂的Toll样 受体配体，其中，所述的第1剂包含每公斤体重10-2000 mg/天、施 用7天的剂量，第2剂包含以每z^斤体重10-1000 ng/天的量在第1 剂开始施用后5天施用的一个剂量。
7. 权利要求6的增殖自然杀伤细胞的方法，其中，所述乳铁蛋 白经口施用，所述Toll样受体配体为腹腔内施用。
8. 权利要求6或7的增殖自然杀伤细胞的方法，其中，所述的 Toll样受体配体为聚肌胞苦酸。
9. 生产自然杀伤细胞的方法，该方法包括向除人之外的受试动 物施用作为第1剂的乳铁蛋白和作为第2剂的Toll样受体配体，并 从所述动物中收集自然杀伤细胞，其中，所述的第l剂包含每公斤体 重10-2000 mg/天、施用7天的剂量，第2剂包含以每7>斤体重10-1000 jig/天的量在第l剂开始施用后5天施用的一个剂量。
10. 权利要求9的生产自然杀伤细胞的方法，其中，所述乳铁蛋 白经口施用，所述Toil样受体配体为腹腔内施用，并且，所述的自 然杀伤细胞从腹腔采集。
11. 权利要求9或10的生产自然杀伤细胞的方法，其中，所述的Toll样受体配体为聚肌胞苷酸。
全文摘要
在正在施用乳铁蛋白的动物的腹腔内施用聚肌胞苷酸等Toll样受体配体，使NK细胞在腹腔内增殖，通过由腹腔采集NK细胞来获得NK细胞。
文档编号A61K49/00GK101658678SQ20091016119
公开日2010年3月3日 申请日期2005年9月7日 优先权日2004年9月15日
发明者久原彻哉, 伊藤岳人 申请人:森永乳业株式会社
最新回复(0)