一种具有抗球虫效果的聚合物杀菌剂的制作方法

专利名称：：一种具有抗球虫效果的聚合物杀菌剂的制作方法
技术领域：
：-本发明涉及医药领域，涉及一种治疗家禽球虫病的聚合物，该聚合物是由丙烯醛、丙烯酸、或低烷烯基二酸或多元酸经共聚形成的分子量大于1000的三元共聚物。球虫病是家禽的主要疾病之一，本病除造成鸡只死亡外，还会导致鸡群均匀度差、饲料报酬降低，并易继发其他疾病，致使养殖损失巨大。全世界每年用于防治球虫病上的费用达3.5亿美元，并且球虫对大多数常用药物的抗药性越来越强了。专利号CN200810147235.8，发明名称为"一种杀菌聚合物及其制备方法"的专利涉及一种新的聚合物，具有抗动物和人类细菌和寄生虫感染的杀菌效果，曾提及该聚合物在治疗家禽球虫病中的应用。本发明的目的在于提供一种聚合物药物在治疗家禽球虫病中的应用。上述聚合物是由丙烯醛、丙烯酸、低垸烯基二酸或低烷烯基多元酸经共聚形成的的分子量为1000-10000的三元共聚物，结构包括如下任一单元的重复聚合结构或如下几种单元或全部单元的任意重复共聚结构，但并不局限于下列单元
背景技术：
：
发明内容:\C/H\C/CH<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>HCCOH0、(D)结构中m、n为1或大于1的整数，R为H、或-RiC00H，其中为CoC10烷基、烯烷基以及具有双键的多元酸烷基;优选为C0C5的烷基，更优选为C0C2的垸基，最优选的R为(-CH2COOH)。本发明的聚合物优选其中羧基的含量为0.15~7.5摩尔/公斤；分子量为100010000之间的聚合物，优选为1000-5000之间。本发明的聚合物，其制备原料为丙烯醛，丙烯酸和具有双键的多元酸，其中具有双键的多元酸为顺丁烯二酸、反丁烯二酸或戊烯二酸及其异构体。优选的本发明的原料为丙烯酸，丙烯醛，和反(顺)丁烯二酸。最优选的为丙烯酸，丙烯醛，反丁烯二酸。三者的摩尔比例为丙烯酸丙烯R-HcHcHc醛反丁烯二酸=0-100:0-100:0-100，优选的为丙烯酸丙烯醛反丁烯二酸=0-98:1-50:0-50。进一步优选的三者的摩尔比例为丙烯酸丙烯醛反丁烯二酸=40-90:10-50:0-10。再进一步优选的三者的摩尔比例为丙烯酸丙烯醛反丁烯二酸=50-70:20-40:5-9。最优选的三者的摩尔比例为丙烯酸丙烯醛反丁烯二酸=63:30:7。本发明的优选的聚合物可以采用如下方法制备将丙烯酸、丙烯酸和反丁烯二酸加入无水甲醇，通氮气排气，再加入过氧化苯甲酰，在氮气保护下加热回流，反应液变为棕色粘稠液，减压浓縮至干，制得聚丙烯酸-丙烯醛-反丁烯二酸。本发明还包括含有本发明聚合物的药物组合物，该组合物含有本发明的聚合物作为活性成分，以及药学上可接受的载体。本发明的聚合物可以与其他活性成分组合使用，作为抗菌或抗球虫的增效剂，只要它们不产生拮抗性。本发明的药物组合物可配制成任何一种适宜的剂型，例如口服制剂(如片剂、胶囊剂、口服液、混悬剂、丸剂、颗粒剂)，局部制剂(例如软膏、溶液和栓剂等)。本发明组合物可按照本领域中熟知的方法进行制备。用于本发明药物组合物的载体是药学领域中可得到的常见类型，包括口服制剂用的粘合剂、润滑剂、崩解剂、助溶剂、稀释剂、稳定剂、悬浮剂、矫味剂等；可制成缓释或控释制剂的缓控释载体等；局部制剂用的基质、稀释剂、润滑剂、防腐剂等。本发明的聚合物的使用剂量可以根据活性成分在体内的治疗功效和生物利用度、它们的代谢和排泄速率和用药个体的状况进行适当调整，因此，本发明的治疗剂量可以有大范围的变化。一般来讲，可以根据本发明聚合物或者组合物中最后的制剂中所含有的实际有效成分数量加以适当的调整，以达到其治疗有效量的要求，完成本发明治疗感染的目的。有效剂量可以以单一剂量形式给药或者以一定间隔分若干次给药或连续给药达到。以上活性成分的剂量将因配方而异。然而，如果必要，也可以偏离上述用量，这取决于待治疗的受试者的类型和体重、个体对药物的行为、疾病的性质和严重性、制剂和给药的类型、以及给药时间或间隔。抗球虫效果实验实验方法-试验动物及饲料试验动物选用350只1日龄体重相近、健康的AA肉鸡。全程在育雏笼内饲养，自由饮水和采食，24h光照。试验饲料按NRC禽的营养标准，自配的无抗球虫药饲料。试验药物本发明的聚合物(青岛康地恩药业有限公司)对照药物磺胺氯吡嗪钠，妥曲珠利标准制剂。试验虫卵鸡柔嫩艾美尔球虫标准卵囊。半数致死量为7X104个/只孢子化柔嫩艾美尔球虫卵囊。试验前通过无球虫肉鸡传代增殖l次。虫卵复壮取20日龄试验鸡30只，嗉囊注射感染球虫，每只鸡感染1X104个孢子化柔嫩艾美尔球虫卵囊。第7天收集球虫。(1)收集粪便，将粪便加水浸泡l小时。之后用双层纱布过滤，滤液倒入离心管内，离心3次(2000r/min，15min)。(2)三次沉淀离心结束后，上清液倒掉，用玻璃棒搅拌沉淀，待沉淀搅拌均匀后加饱和食盐水少许，离心2次(1000r/min，5min)。(3)将含有球虫的饱和食盐水倒入另外准备的离心管中，加入十倍于饱和食盐水的自来水，离心(2500r/min，10min)。离心完毕后，将上清液倒去，用玻璃棒将沉淀搅拌均匀，加入到2.5%重铬酸钾溶液中，并置于保温箱中孢子化。每天记录孢子化率，在孢子化率超过80%后停止培养，移入保存瓶置于4'C冰箱中保存备用。根据卵囊采集部位、肉眼病变、卵囊形状、大小等鉴定为柔嫩艾美尔球虫。动物分组及处理17日龄时，选取体重相近(体重差别不超过士5g),并经预备期观察确认为健康的雏鸡270只，随机分为9组，每组30只。1in组为聚合物高、中、低剂量组，ivvn组为磺胺氯吡嗪钠、磺胺氯吡嗪钠+聚合物、妥曲珠利、妥曲珠利+聚合物对照组，VI组为感染不给药对照组，IX为不感染不给药对照组。分组当天对IVID组肉仔鸡感染柔嫩艾美尔球虫孢子化卵囊7.OX104个/只，感染后第9天将鸡捕杀剖检。并于感染后第48小时在对应组饮水中添加药物，连用5天。感染时间、方式及剂量试验鸡17日龄时，将含重铬酸钾溶液的卵囊，离心洗涤去除重铬酸钾，调整至7X104个/ml孢子化卵囊。经嗉囊注射感染，每只鸡感染7X104个孢子化柔嫩艾美尔球虫卵囊。药物分组(见表l)表1药物分组及剂量编号药物剂量I组聚合物A高剂量组500ppm饮水，连用5天，每日2次II组聚合物A中剂量组400ppm饮水，连用5天，每日2次ni组聚合物A低剂量组300ppm饮水，连用5天，每曰2次廳磺胺氯吡嗪钠300ppmL饮水，连用5天，每日2次v组磺胺氯吡嗪钠+A300+300ppm饮水，连用5天，每日2次VI组妥曲珠利75ppm饮水，连用5天，每日2次vn组妥曲珠利+A75+300ppm饮水，连用5天，每日2次VI组感染不给药IX组不感染不给药临床观察接种球虫后观察和记录各组鸡的发病情况，临床症状。感染后第4天开始每天检査粪便，记录血粪情况。第6-8天进行克粪卵囊计数，并对所有死亡鸡剖检，重点检查盲肠病变。统计存活率、增重率、相对增重率、病变值、卵囊值等，计算抗球虫指数。疗效考核指标1.相对增重率于感染后O、3、6、9天早晨每组空腹称重，计算各组鸡的平均体重相对增重率(％)=感染投药组的平均增重/不感染不投药组的平均增重X100%;2.存活率存活率=[(组内总鸡数-每组因感染球虫死亡的鸡数)/组内总鸡数]X100%;3.血便计分-接种卵囊后第4、5、6、7、8天，参照Morehouse(1970)的方法，按以下标准计分。0分粪中无血；l分粪中有少量血；2分有较多血量，其它为正常粪；3分.*有较多血量，其它为白色粘液或有2/3的血，有少量正常粪；4分全部为血，或2/3的血，其它为血色粘液。4.盲肠病变计分参照Johnson和Reid(1970)的标准，根据剖检后肠道病变的严重程度计分。0分肠道无异常，未见病变；l分盲肠壁有极少量散在点状出血斑，肠壁不增厚，内容物正常；2分盲肠内容物有少量血液，盲肠壁增厚，可见多数出血病灶；3分:盲肠内有多量血液或盲肠核(血凝块或灰白色干酪样的香蕉型块状物)，盲肠壁肥厚及明显的盲肠变形，核萎缩；4分盲肠显著萎縮，病变多达直肠深部，肠壁极度肥厚，盲肠内有血凝块或盲肠核，因球虫病死亡也记4分。病变值z每组平均病变计分X105.卵囊排出情况在球虫感染后第6天至第8天收集粪便，按照McMaster's法计算克粪便卵囊数(Oocystpergram，0PG)。方法将每组鸡的粪便分五点进行采集，收集的粪便搅匀后，称取2g，加20mL的自来水搅匀，然后用血细胞计数板计数，最后求其平均值。(1)克粪便卵囊数(0PG)=(红细胞计数室卵囊值X10000X10)/各组鸡只数(2)卵囊比数=(健康组或试验组卵囊数/攻虫组卵囊数)X100%(3)卵囊值参照角田清方法将卵囊比数换算成卵囊值(见表2)。表2卵囊值换算表<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>6.抗球虫指数(ACI)根据美国默克公司(1976)的方法和农业部《临床试验技术规范》标准，计算抗球虫指数。ACI=(相对增重率十存活率)-(病变值+卵囊值)判断标准ACI>180为高效，160《ACI《180为中效，ACK160为低效，ACI<120为无效。7.血液生理指标的测定各试验组鸡分别于感染虫卵后的第6、9天各随机选取3只鸡，心脏采血；分别取2ml血液加入EDTA-Na的抗凝血瓶中，分别测定红细胞数量、红细胞压积和血红蛋白含量。数据分析试验结果采用SPSS统计分析软件进行统计分析，多重比较采用邓肯氏(Duncan)法。试验结果1.发病情况及血便计分接种球虫后第4天开始，各感染组鸡只均表现出不同程度的临床症状，如精神沉郁、羽毛蓬乱、闭目呆立、采食量降低，并伴有少数的神经症状。感染后第5、6天，各感染组鸡只排出不同数量的血便，感染不给药鸡血便最多，其余各组鸡的血便均低于感染不给药组。感染后第7天，各感染组鸡的血便均减少。感染后第8天，各感染组鸡血便消失，只有感染不给药组还见少量血便(见表3)。_表3各组试验鸡血便计分结果_编组名感染后血便计分平均计号I聚合物A高剂量组组II聚合物A中剂量组组III聚合物A低剂量组组IV磺胺氯吡嗪钠对照组组V磺胺氯吡嗪钠+聚合物A中组剂量组VI妥曲珠利对照组组vn妥曲珠利+聚合物a中剂量组组vi感染不给药组4天5天6天0020121120120120110121237天8天分100.6201211.4100.8201200.8201322.2组IX不感染不给药组oooooqn_2.增重及相对增重率接种球虫后的第0，3，6，9天早晨空腹称重，计算每组鸡的平均增重及相对增重率。感染后第3，6，9天，各组都有不同程度的增重，感染不给药组增重最小，其余各感染组的增重均高于感染不给药组。联合用药未显示聚合物A对磺胺氯吡嗪钠和妥曲珠利有增效作用(见表4)。表4各组试验鸡增重情况编组名感染后体重增重相对增号(g)重率(％)o天3天6天9天I聚合物A高剂组量组474.25485.5664.86703.6229.3590.17II聚合物A中剂组量组487.35503.93684.57701.5214.1584.20III聚合物A低剂组量组475.38489.63610.33687.6212.2283.44IV磺胺氯吡嗪钠组对照组500513.29614.25761.75261.75102.92V磺胺氯吡嗪钠组+聚合物A中剂量组479.13496.82612.86758278.88109.65VI妥曲珠利对照组组516.88534.25673.67782.67265.79104.50妥曲珠利+聚组合物A中剂量组493.88508.67639.5709.42215.5584.75VI感染不给药组组479.25492.38560.67595.4116.1545.67IX组不感染不给药组500.67521.45679.5843342.33134.603.存活率及死亡情况接种球虫后第4天开始，感染不给药组死亡一只鸡，第5，6，7天各组均有死亡鸡只，感染不给药组死亡最多，共死亡i3只，其余各组较感染不给药组少，从iv-vn组看，聚合物A对磺胺氯吡嗪钠和妥曲珠利的增效效果不明显，(见表5)。表5存活率及死亡情况感染天死亡数(只)数I组II组I腿廳V组VI组W组窗且IX组麥a沐口聚合物麥a豕口磺胺磺胺妥曲妥曲感染不感物AA中剂物A氯吡氯吡珠利珠利+不给染不高剂量组低剂嗪钠嗪钠+对照麥a豕口药组给药量组量组对照麥a豕口组物A组组物A中剂中剂量组量组4天0000000105天0000010006天34535541007天0111101308天000000000总死亡3564665140数(只)总鸡数303030303030303030(只)存活率90.083.3380.086.6780.00肌0083.3353.33100(%)4.克粪便卵囊数(OPG)及卵囊值接种球虫后第5天，各试验组未见球虫卵囊，从第6天开始，感染组均出现不同数量的卵囊，高峰期在第6，7天，第8天开始下降。感染不给药组的球虫卵囊最多，其余各感染组均低于感染不给药组。不感染不给药组未发现球虫卵囊(见表6)，从RTVn组可以看出磺胺氯吡嗪钠和妥曲珠利分别加聚合物A可以使卵囊数比不加聚合物A降低更快。_表6克粪便卵囊及卵囊值_组另U__卵囊比数卵囊6天7天8天值i组聚合物a高剂量组0.140.180.040.185ii组聚合物a中剂量组0.160.290.080.2810m组聚合物a低剂量组0.210.290.130.3510廳磺胺氯吡嗪钠对照组0.250.300.030.2810v组磺胺氯吡嗪钠+聚合物a中剂量组0.200.2000.195vi组妥曲珠利对照组0.330.5000.3710vd组妥曲珠利+聚合物a中剂量组0.110.1800.125\1组感染不给药组0.501.130.361.0040仅组不感染不给药组000005盲肠病变计分接种球虫后第9天，每组随机取4只鸡剖检观察盲肠病变情况。感染不给药组盲肠病变较严重，盲肠内有少量血液，盲肠壁增厚。其余各感染组的盲肠病变程度较轻，有些鸡只的盲肠未见病变(见表7)，从iv-vn组可以看出磺胺氯吡嗪钠和妥曲珠利分别加聚合物a和不加聚合物a对盲肠病变影响不明显，即聚合物a对磺胺氯吡嗪钠和妥曲珠利没有明显的增效效果。表7盲肠病变计分组别鸡只平均值计分i组ii组in组聚合物a高剂量组聚合物a中剂量组聚合物a低剂量组102031400.250.50.752.57.5籠磺胺氯吡嗪01000.252.5钠对照组v组磺胺氯吡嗪11000.55钠+聚合物A中剂量组VI组妥曲珠利11000.55对照组vn组妥曲珠利+聚01100.55合物A中剂量组VI组感染不23332.7527.5给药组IX组不感染000000不给药组6.抗球虫指数试验结果显示，聚合物高，中，低剂量组的抗球虫指数分别是172.7，152.5，145.9。较磺胺氯吡嗪钠的抗球虫指数低,与妥曲珠利的抗球虫指数相近；聚合物高剂量组的效果好于中剂量和低剂量组，抗球虫指数见表8。表8抗球虫指数编号组名相对增存活率卵囊盲肠抗球虫指重率(％)(%)值病变数(ACI)I组聚合物高剂量组90.1790.052.5172.7II组聚合物中剂量组84.2083.33105152.5in组聚合物低剂量组83.4480.0107.5145.9醒磺胺氯吡嗪钠对照组102.9286.67102.5177.1v组磺胺氯吡嗪钠+聚合物中109.6580.055179.7剂量组VI组妥曲珠利对照组104.5080.0105169.5vn组妥曲珠利+聚合物中剂量84.7583.3355158.1组窗且感染不给药组45.6746.674027.524.8IX组不感染不给药组134.6010000/7.血液生理指标接种球虫后的第6天各感染组鸡只均有不同程度的贫血现象，感染不给药组最严重，其余各试验组的贫血现象较轻微。感染后第9天，试验组鸡只的贫血现象逐渐消失，红细胞数量与空白组差异不大(见表9)。表9各试验组的红细胞数量<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>结果显示，感染球虫组鸡只红细胞总数、血红蛋白含量和红细胞压积较不感染组显著降低((P〈0.05)。其中，感染给药组相应指标高于感染不给药组(P〈0.05).结论聚合物A具有较好的抗球虫效果，抗球虫指数较磺胺氯吡嗪钠的抗球虫指数略低,与妥曲珠利的抗球虫指数相当。具体实施例方式以下通过实施例进一步说明本发明的聚合物在治疗家禽球虫病中的应用。实施例1、合成实验本发明具有代表性的药物(摩尔比为丙烯酸丙烯醛反丁烯二酸=63:30:7)的合成将新蒸馏过的丙烯醛73.7g、新蒸熘过的丙烯酸198.8g和反丁烯二酸35.6g加入装有630ml无水甲醇的三口瓶中，通氮气排气，再加入13.2g过氧化苯甲酰，在氮气保护下加热回流70小时，反应液变为棕色粘稠液，减压浓缩至干，5010(TC继续维持24小时，制得聚(丙烯酸、丙烯醛、反丁烯二酸)命名为聚合物A。实施例2、聚合物B按照实施例1的制备方法把摩尔比为丙烯酸丙烯醛反丁烯二酸=40:50:IO的合成制得聚(丙烯酸、丙烯醛、反丁烯二酸)命名为聚合物B。优选的为丙烯酸丙烯醛反丁烯二酸=0-98:1-50:0-50。进一步优选的三者的摩尔比例为丙烯酸丙烯醛反丁烯二酸=40-90:10-50:0-10。再进一步优选的三者的摩尔比例为丙烯酸丙烯醛反丁烯二酸=50-70:20-40:5-9。实施例3、聚合物C按照实施例1的制备方法把摩尔比为丙烯酸丙烯醛反丁烯二酸=90:10:3的合成制得聚(丙烯酸、丙烯醛、反丁烯二酸)命名为聚合物C。实施例4、聚合物D按照实施例1的制备方法把摩尔比为丙烯酸丙烯醛反丁烯二酸=70:20:5的合成制得聚(丙烯酸、丙烯醛、反丁烯二酸)命名为聚合物D。实施例5、聚合物E按照实施例1的制备方法把摩尔比为丙烯酸丙烯醛反丁烯二酸=50:40:9的合成制得聚(丙烯酸、丙烯醛、反丁烯二酸)命名为聚合物E。实施例6、聚合物F按照实施例1的制备方法把摩尔比为丙烯酸丙烯醛反丁烯二酸=30:45:40的合成制得聚(丙烯酸、丙烯醛、反丁烯二酸)命名为聚合物F。实施例7、聚合物G按照实施例1的制备方法把摩尔比为丙烯酸丙烯醛顺丁烯二酸=30:45:40的合成制得聚(丙烯酸、丙烯醛、顺丁烯二酸)命名为聚合物G。实施例8、聚合物H按照实施例1的制备方法把摩尔比为丙烯酸丙烯醛顺丁烯二酸=50:40:9的合成制得聚(丙烯酸、丙烯醛、顺丁烯二酸)命名为聚合物H。实施例8、聚合物I按照实施例1的制备方法把摩尔比为丙烯酸丙烯酵顺丁烯二酸=63:30:7的合成制得聚(丙烯酸、丙烯醛、顺丁烯二酸)命名为聚合物I。实施例9、抗球虫指数聚合物B-1高剂量组的抗球虫指数见表10。表io抗球虫指数编号组名抗球虫指数(ACI)I组聚合物B高剂量组168.9II组聚合物c高剂量组168.6m组聚合物D高剂量组169.7龍聚合物E高剂量组170.3v组聚合物F高剂量组167.8VI组聚合物G高剂量组160.5VD组聚合物H高剂量组160.1VI组聚合物I高剂量组163.权利要求1、一种聚合物药物在治疗家禽球虫病的中的应用。所述聚合物是由丙烯醛、丙烯酸、低烷烯基二酸或低烷烯基多元酸为原料经共聚反应制成的的分子量为1000-10000的三元共聚物，结构包括(A)～(D)任一单元的重复聚合结构或几种单元或全部单元的任意重复共聚结构上述结构中m、n为1或大于1的整数，R为H、或-R1COOH，其中R1为C0～C10烷基、烯烷基以及具有双键的多元酸烷基。2、根据权利要求1所述的应用，其中A为Co~C5烷基、烯垸基以及具有双键的多元酸烷基。3、根据权利要求1所述的应用，其中R为(-CH2COOH)。4、根据权利要求l所述的应用，其中共聚反应的原料选自丙烯醛、丙烯酸、丁烯二酸或其异构体、戊烯二酸或其异构体。5、根据权利要求4所述的应用，其中原料为丙烯酸、丙烯醛和反丁烯二酸，三者的摩尔比例为丙烯酸:丙烯醛反丁烯二酸=1-100:1-100:1-100。6、根据权利要求4所述的应用，其中原料为丙烯酸、丙烯醛和反丁烯二酸，三者的摩尔比例为丙烯酸丙烯醛反丁烯二酸=50-70:20-40:5-9。7、根据权利要求4所述的应用，其中原料为丙烯酸、丙烯醛和反丁烯二酸，三者的摩尔比例为丙烯酸丙烯醛反丁烯二酸=63:30:7。全文摘要本发明涉及一种治疗家禽球虫病的聚合物，该聚合物是由丙烯醛、丙烯酸、或低烷烯基二酸或多元酸经共聚形成的分子量大于1000的三元共聚物。文档编号A61K31/19GK101601680SQ20091016132公开日2009年12月16日申请日期2009年7月20日优先权日2009年7月20日发明者张志勇,楷徐,殷生章,王巧玲,王英俊,白金宇申请人:青岛康地恩药业有限公司