聚合胶束组合物的制作方法
专利名称：聚合胶束组合物的制作方法
1.发明领域本发明涉及含有用于递送治疗剂的聚合胶束的组合物，其中的治疗剂包括抗肿瘤药物，但不局限于此。
2.发明背景与化学治疗剂的应用相关的主要障碍是对癌细胞缺乏选择性。这种选择性的缺乏与使用这些制剂所带来的有害副作用有关，因为它们既可以被递送到异常细胞中，也可以被递送到正常细胞中。在对除癌症外的各种疾病进行治疗的过程中，药物对靶细胞缺乏选择性同样是个难题。大部分的研究工作集中于开发一些能够将药物选择性地递送到靶细胞的药物载体。例如，为了提高低治疗指数药物的递送选择性，现已对多种药物载体进行了研究，如脂质体、微颗粒、超微联合体以及药物-聚合物结合体。
将脂质体(磷脂泡)作为定向装置的研究吸引了广泛的关注。但是，由于脂质体可被肝脏和脾脏中网状内皮(RE)细胞快速地清除，并且它在血浆中不稳定，所以这些脂质体的定向效率受到限制，此外由于尺寸引起的外渗、制备脂质体的技术难题和易于受到氧化作用，这些脂质体的能力也受到限制。已经找到针对单个问题的解决方法，但是很少有某个单独的组合物能同时解决一个以上的问题。举例来说，如果降低RE细胞的识别率和提高脂质体的稳定性，那么获得直径小于50nm的稳定脂质体就很困难了。
将聚合胶束作为药物载体是1984年由Bader，H.et al.，Angew.Makromol.Chem.123/124(1984)457-485首先提出的。聚合胶束越来越成为科学界的研究热点，并且成为有潜力的弱水溶性药物的载体，因为这些聚合胶束能将那些药物溶解在其内部核中，并且提供一些优良特性，如普遍小的尺寸(＜100nm)和能避免被网状内皮系统(RES)清除的性质。
经常将胶束与病毒或脂蛋白等天然载体比较。这三种载体都表现出一种相似的核-壳式结构，不管是病毒所含的DNA，还是脂蛋白和胶束所含的不溶于水的药物，这一结构都可以在向靶细胞运送的过程中保护其内含物。
由于肿瘤表现出对低密度脂蛋白的需求增加，所以建议将脂蛋白作为载体，用以将抗肿瘤化合物定向于癌细胞。然而，脂蛋白载体的效率受到了置疑，主要是因为掺入脂蛋白的药物也可能被健康细胞识别，并且还因为它们必须与天然脂蛋白竞争肿瘤细胞上的受体位点。而病毒载体主要用于递送遗传物质，并且由于它们可能引发免疫应答，所以在不需要反复使用递送载体的应用领域中非常适用。
聚合胶束可能是递送不溶于水的药物的最有效的载体之一。聚合胶束的特征在于具有一种核-壳式结构。关于聚合胶束的药学研究主要集中于具有A-B双嵌段结构的共聚物，其中A和B分别是亲水壳部分和疏水核合聚物。多嵌段共聚物如聚(环氧乙烷)-聚(环氧丙烷)-聚(环氧乙烷)(PEO-PPO-PEO)(A-B-A)能够自组装以形成胶束，并且被认为是有潜力的药物载体。Kabanov，A.V.et al.，FEBS Lett.258(1989)343-345。通常由可生物降解的聚合物组成的疏水核起着不溶性药物的贮存器的作用，保护药物免与水性环境接触，这些可生物降解的聚合物如聚(β-苯甲基-L-天冬氨酸)(PBLA)、聚(DL-乳酸)(PDLLA)以及聚(ε-己内酯)(PCL)。上述核还可以由一种水溶性聚合物组成，如聚(天冬氨酸)(P(Asp))，该聚合物通过与疏水药物的化学结合而被赋予疏水性，或者通过两种所带电荷相反的聚离子结合而形成(聚离子复合胶束)。在一些研究中描述了作为内核构成成分的非生物降解性聚合物或弱生物降解性聚合物，如聚苯乙烯(Pst)或聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)的应用。参阅，例如，Zhao，C.L.et al.，Langmuir 6(1990)514-516；Zhang，L.et al.，Science268(1995)1728-1731以及Inoue，T.et ar.，J.ControlledRelease51(1998)211-229。非生物降解聚合物必须是无毒的，并且具有足够低的分子量以便能经肾脏途径排泄，才能成为临床有关的药物载体。此外，上述疏水内核还可以由一种高疏水的短链组成，如烃链，或一种二酰基脂类，如二硬脂酰磷酯酰乙醇胺(DSPE)。该疏水链既可以与聚合物的一个末端结合，也可以随机分布在聚合结构中。
上述外壳负责胶束的稳定性以及胶束与血浆蛋白和细胞膜之间的相互作用。该外壳通常由PEO等亲水性、非生物降解性、生物相容性聚合物构成的一些链所组成。该载体的生物分布主要取决于亲水外壳的性质。诸如聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPA)和聚(烷基丙烯酸)等其他聚合物则赋予上述胶束温度敏感性或pH敏感性，并且可最终用于使胶束具有生物粘附特性。此外还了解在胶束表面具有能与定向部分结合的官能团。参阅，例如，Scholz，C.et al.，Macromolecules28(1995)7295-7297。
聚(N-乙烯基-2-吡咯烷酮)(PVP)是一种众所周知的具有高度极性的内酰胺基团的水溶性、生物相容性、两亲性聚合物，其中的内酰胺基团在骨架上被非极性的亚甲基所包围，在环上被非极性的次甲基所包围。通常将PVP用作为聚苯乙烯乳胶合成中的空间稳定剂。参阅，例如Gabaston，L.I.et al.，Macromolecules 31(1998)2883-2888；Rutt，J.S.et al.，J.Polym.Sci.Part APolym.Chem.，32(1994)2505-2515。此外，PVP还可以用作冷冻保护剂和冻干保护剂。参阅，例如，Skaer，H.B.et al.，J.Microsc.110(1997)257-270；Townsend，M.W.et ar.，J.Prenter.Sci.Technol.，42(1998)190-199。
与PEG相比，PVP对非离子型和离子型共溶质都表现出显著的相互作用多样性。参阅，Molyneux，P.，Proc.Int.Symp.Povidone(1983)1-19。具有长烷基链或芳香族部分的分子会最明显地发生结合作用。与PEG相似，PVP也能增加胶质载体和肽/蛋白在体内的循环时间。参阅，例如，kamada，H.et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.257(1999)448-453；Torchilin，V.P.，J.Microencapsulation15(1998)1-19。此外还有研究表明，含有聚(D，L-乳酸)和聚(乙二醇)(PEG)的双嵌段共聚物的超微颗粒经冷冻干燥后会发生聚集。参阅，De Jaeghere，F.et al.，Pharm.Res.16(1999)859-866.这个问题可以通过使用冻干保护剂加以避免。由于PVP本身是一种冻干保护剂，所以使用PVP就可以解决该问题。
N-乙烯基吡咯烷酮(VP)能与多种乙烯基单体发生共聚反应。它与负电性单体聚合后形成交替型共聚物，而与丙烯酸酯则形成无规共聚物。举例来说，可以制备由聚(L-丙交酯)(PLLA)和PVP组成的接枝共聚物。参阅，Eguiburu，J.L.，J.San Roman，Polymer37(1996)3615-3622。在该研究中，PLLA巨单体与VP共聚，但是聚合胶束的形成过程还没有确定。
到目前为止，大部分关于制备生物可降解聚合胶束的研究工作都集中于如何利用PEG形成亲水外壳。参阅，例如，X.Zhang，X.，etal.，Inter.J.Pharm.132(1996)195-206；Yokoyama，M.，et al.，J.Control.Release55(1998)219-229，以及Allen，C.，et al.，J.Control.Release63(2000)275-286。
因此，仍然需要一些新的生物相容性-生物可降解性的聚合胶束体系，这些体系不含有PEG，但也能表现出良好的溶解性质，并且这些系统还提供一些供多种药物结合的位点。此外，在其冻干形式中加入水后，这些体系还必须容易地再分散或再溶解。本发明的这种体系由双嵌段PVP-聚(D，L-丙交酯)(PLLA)构成。
3.发明概述本发明提供一种胶束形成组合物，其中包括一种疏水核，该核被一种亲水外壳所包围，并且其中所述亲水外壳是PVP。
本发明还提供一种胶束形成组合物，其中包括一种治疗剂；以及一种疏水核，该核被一种亲水外壳所包围，并且其中所述亲水外壳是PVP，其中所述治疗剂包含于上述胶束中。
本发明还提供一些方法，用以将至少一种适当的治疗剂装入聚合胶束。
本发明还提供一种聚合胶束组合物，其中包含一种治疗剂，该治疗剂通过被包含在上述胶束的疏水核或亲水外壳中，从而避免了发生化学相互作用，如水解作用。
通过阅读以下详细描述，本领域的一般技术人员将更容易理解本发明的这些和其他特性及优点。
4.发明详述本发明提供一种胶体组合物，该组合物由聚合胶束组成，其中的聚合胶束可用于递送具有弱水溶性的治疗剂和/或与亲水外壳具有特异性亲和力的治疗剂。该聚合胶束的特征在于具有一种核壳式结构，其中的疏水核被亲水外壳所包围。该亲水外壳包括一种亲水聚合物或共聚物。
本发明的亲水聚合物是聚(N-乙烯基-2-吡咯烷酮)(PVP)的聚合物或共聚物。
疏水部分构成了胶束的核。疏水部分可选自聚酯，如聚(乙醇酸)、聚(乳酸)、聚(D-乳酸)、聚(D，L-乳酸)、丙交酯/乙交酯共聚物、聚己内酯及其衍生物；聚原酸酯及其衍生物；聚酐及其衍生物；来自酪氨酸的假性-聚(氨基酸)及其衍生物；聚磷腈及其衍生物；聚(丙烯酸烷基酯)及其衍生物；聚(β-苄基-L-天冬氨酸)及其衍生物，以及它们的组合。优选的疏水部分是聚(D，L-丙交酯)(PDLLA)。PDLLA的浓度可以为约10％-50％(w/w)。
4.1胶束的形成胶束形成是两种力作用的结果。一种是导致分子缔合的吸引力，另一种是防止胶束无限生长至肉眼可见状态的排斥力。当两亲共聚物被置于一种对亲水聚合物或疏水聚合物具有选择性的溶剂中时，就会发生自缔合。
两亲共聚物的胶束化过程与低分子量的表面活性剂类似。在浓度非常低的条件下，聚合物仅以单链形式存在。当浓度增加至临界值即被称为临界缔合浓度(“CAC”)时，聚合物链开始缔合以形成胶束，其方式是，共聚物的疏水部分将避免与将其稀释的水性介质接触。在CAC条件下，在胶束的核内部可发现大量溶剂，由此可以将胶束描述成松散的聚集体，这些聚集体的尺寸比在高浓度条件下形成的胶束更大。在上述浓度条件下，平衡将偏向胶束形成，这些胶束会采用其低能状态的构型，并且残余溶剂将逐渐从疏水核中释放出来，从而使胶束的尺寸缩小。两亲共聚物通常表现出比低分子量表面活性剂低得多的CAC。举例来说，PEO-PBLA和PNIPA-PSt的CAC介于0.0005-0.002％之间。然而，某些两亲共聚物却表现出高得多的CAC，如泊洛沙姆的CAC就高达0.01-10％。具有高CAC的两亲共聚物可能不适合作为药物定向载体，因为它们在水性环境中不稳定，并且在稀释时易于解聚。
两亲共聚物的胶束化可产生两种不同类型的胶束，这取决于疏水链是与亲水聚合物无规结合还是与亲水链的一个末端接枝。由无规改性聚合物形成的胶束一般比末端改性聚合物形成的胶束小。决定胶束尺寸的主要因素有，将疏水链掩蔽在胶束核内的疏水力，以及限制其大小的链间占有体积排斥力。上述两种力在无规改性共聚物和末端改性共聚物中平衡的差异是造成它们大小不同的原因。当末端疏水基团相互缔合以形成胶束时，固定在疏水片段周围的水簇被排除到核外，从而在核与亲水外壳间没有直接的相互作用，该亲水外壳在上述胶束结构中仍保持可动的线性链形式。而无规改性聚合物的缔合方式是聚合物的疏水部分和亲水部分相互缠绕，从而可以使核和水性介质接触。这是一个重要事件，因为暴露的疏水核可能导致聚合胶束的次级聚集。此外，还认为次级聚集是用以解释在结合了阿霉素(DOX)的PEO-P(Asp)胶束体系中存在大颗粒(＞100nm)的一种假说。
4.2临界缔合浓度(CAC)的确定光散射被广泛用于确定胶束的分子量和聚集数。但是，只有当CAC下降到散射法的灵敏度范围内时，才可能对胶束化的起始进行检测。在水中对于聚合物来说这种情况是非常少见的。由于单链和共聚物的胶束组分的洗脱体积不同，所以在水性条件下可以使用凝胶渗透层析法(GPC)。此外，利用GPC还可以同时确定胶束的分子量和聚集数。在经大小排阻柱洗脱过程中，保持聚合胶束的完整性是非常重要的。聚合物吸附在柱子上也可能带来难题，尤其是当浓度接近CAC时，因为该条件下的胶束由大量松散的聚集体构成。
一种优选的确定CAC的方法涉及荧光探针的使用，其中普遍使用的是芘。芘是一种缩合的芳香烃，它具有高度的疏水性和对周围环境的极性高度的灵敏性。当低于CAC时，芘可溶解在水中，水是一种高极性的介质。当胶束形成时，芘倾向于分配到胶束核所提供的疏水区域中，因而处于一种非极性环境中。所以，可发现大量的变化，如荧光强度增加、发射光谱的振动性精细结构的变化，以及激发光谱中(0，0)带的红移。表观CAC可以由芘的荧光对浓度曲线获得，I1/I3比可由对浓度的发射光谱获得，以及I338/I333比可由对浓度的激发光谱获得。斜率上显著的变化表明胶束化的起始。I1/I3比是第一和第三最高能量发射峰的强度比，并且在恒定的激发波长以及对应于I1和I3的可变的发射波长条件下进行测定。运用荧光技术确定CAC需要仔细地解释，原因有两个。第一，芘的浓度应该保持极低(10-7M)，这样才能在发生胶束化时，精确地检测斜率的变化。第二，疏水杂质的存在或探针与各个聚合链或胶束化前聚集体缔合有时会导致荧光光谱的逐渐变化。荧光探针的各向异性变化也与胶束化的起始有关。
诸如本发明组合物的那些聚合胶束的特征在于它们具有小尺寸(10-100nm)。除了载体物质外渗的需要外，这种小尺寸还使得组合物的灭菌可以简单地利用过滤来实现，并且尽可能地减少阻塞毛细血管的危险。而使用较大的药物载体不能实现这些目的。胶束的尺寸取决于多种因素，包括共聚物的分子量、亲水链和疏水链的相对比例以及聚集数。利用透析法制备的胶束的尺寸会受到用以溶解聚合物的有机溶剂的影响。
胶束的直径和粒度多分散性可以用动态光散射(DLS)在水中或一种等渗缓冲液中直接获得。DLS还能提供关于聚合胶束的圆球度的信息。
此外，还可利用一些方法来估计胶束的大小，如原子力显微镜(AFM)、透射电镜(TEM)和扫描电镜(SEM)。这些方法可用于检测胶束的形状和粒度分散性。有时还可以进行超速离心速率研究以评定聚合胶束的多分散性。
4.3将治疗剂掺入聚合胶束中根据本领域的技术人员所熟知的技术可实现将治疗剂装填入胶束。举例来说，通过水包油方法或透析法，将化合物溶解在含有所要操作的胶束的溶液中可实现治疗剂的加载。
可使用的治疗剂可以包括以下列举的任何一种化合物，这些化合物能以一种稳定方式被聚合胶束所截留，并且能以治疗有效剂量被给药。根据本发明，为了有效地加载到胶束中，优选使用的治疗剂是疏水性的治疗剂。然而，离子型胶束和电荷相反的亲水化合物，如反义寡核苷酸，可能形成稳定的复合物。适合的药物包括抗肿瘤化含物，如酞菁类(例如，氯化铝酞菁)、蒽环素类(anthracycline)(例如，阿霉素(DOX))、弱溶解性的抗代谢药(例如，氨甲蝶呤、丝裂霉素、5-氟尿嘧啶)和烷化剂(例如，亚硝基脲氮芥)。此外，胶束还可以含有紫杉烷类，如紫杉醇。
胶束中可含有的其它药物通常是一些疏水的抗生素和抗真菌剂，如两性霉素B、弱水溶性的免疫调节剂，如环孢霉素、弱水溶性的抗病毒药，如HIV蛋白酶抑制剂、弱水溶性的甾体类抗炎药(例如，地塞米松)和非甾体类抗炎药(例如，吲哆美辛)，以及基因组片段。
另外，将药物掺入到本发明的聚合胶束组合物中的方法有，化学结合、通过透析而物理地截留、乳化技术、药物和胶束在水性介质中简单地平衡，以及将药物/聚合物的固态分散体溶解于水中。
诸如蛋白质等的亲水化合物也可以被掺入到本发明的聚合胶束组合物中。但是，掺入这种亲水类型时，需要对分子进行化学疏水化处理，或要求分子与亲水外壳具有特定的亲和性。聚离子型化合物可通过形成聚离子型复合胶束而掺入其中。
通常使用透析法或水包油乳剂法来进行药物的物理截留。透析法就是将溶解在乙醇或N，N-二甲基甲酰胺等溶剂中的药物和共聚物加入到一种仅溶解聚合物的亲水部分的选择性的溶剂中，如水。由于良溶剂被选择性的溶剂所取代，聚合物的疏水部分发生缔合从而形成了胶束的核，该核在胶束形成过程中掺入了不可溶的药物。通过把透析时间延长数天以上可完全地去除有机溶剂。在水包油乳剂法中，将药物在氯仿等不溶于水的挥发溶剂中形成的溶液加入到共聚物的水性溶液中，从而形成一种水包油乳剂。当溶剂蒸发时，胶束-药物结合物便形成了。与水包油乳剂法相比，透析法主要的优点是避免了强毒性溶剂的使用，如含氯的溶剂。
药物的加载过程可能会影响药物在胶束内部的分布。例如，Cao etal.(Macromolecules 24(1991)6300-6305)研究表明，在胶束形成过程中掺入其中的芘和在胶束形成后掺入其中的芘都没有与水性环境隔离，尽管前一种方法所得药物加载量比后一种方法得到的药物加载量高三倍。
本发明的聚合胶束的截留效率取决于起始的药物添加量。超出最大的加载能力会导致治疗剂的沉淀，并且因此而得到低产量。此外，治疗剂的加载效率依赖于共聚物的聚集数。表现出较高聚集数的胶束能允许更多的药物溶解在其内部核中。
4.4加载有治疗剂的聚合胶束的实例表1中给出了加载至聚合胶束的化合物的实例和相应的药物加载方法。本发明的聚合胶束组合物被认为适用于作为很多治疗剂的递送系统，这些治疗剂包括，但不局限于，抗癌药、质粒DNA、反义寡核苷酸，或适用于将诊断剂递送到身体的特定器官。
表1
可利用GPC或DLS这两种检测胶束大小变化的方法来获得药物掺入的证据。药物的存在通常引起胶束尺寸的增加。药物在胶束核内部的定位可以通过淬灭实验来演示。例如，碘化物(I)，它是DOX的一种水溶性淬灭剂，不会影响掺入胶束的药物的荧光，但是能淬灭游离药物的荧光。这类实验表明，在冷冻干燥和重构于水中后，DOX仍保留在PEO-PBLA中。对DOX来说，胶束中药物的自缔合也导致药物的荧光强度降低。最近，研究发现两性霉素B在掺入PEO-PBLA胶束后其溶血活性的测定值下降，这间接地确定了胶束可以滞留和缓慢释放两性霉素B。
4.5药学应用本发明的聚合胶束组合物适用于各种药学领域，如口服递送、缓释和位点专一性药物定向。优选的是将本发明的胶束作为水不溶性药物的运送工具。
5.实施例以下实施例仅作为说明，并不意味着限制本发明的范围。
材料商品化的溶剂购自Moquin Scientific(Terrebonne，Quebec)，各种试剂则购自Aldrich(Milwaukee，WI)。N-乙烯基-2-吡咯烷酮(VP)、2-异丙氧基乙醇、以35wt.％的浓度溶解在矿物油中的氢化钾(KH)和18-冠醚-6不经过进一步纯化直接使用。D，L-丙交酯在无水乙酸乙酯中60℃重结晶三次，然后在减压条件下，于P2O5中室温干燥24小时。使用四氢呋喃(THF)前，将其在干氩气氛下从钠和二苯甲酮中回流和蒸馏出来。纯化1，1’-偶氮双(环己烷腈)(ACCN)的方法是，通过将其从乙醇溶液中沉淀于水中，然后真空干燥4天。Sepharose 2B购自Sigma(Saint Louis，MO)，并在使用前用水平衡。胶束制备过程中使用的透析袋是Spectra/Por Membranes(Rancho Dominguez，CA)，MWCO 6000-8000。在干氩气氛下，所有反应都是在预先用火烤过的圆底烧瓶中进行，并且这些烧瓶都被安装上橡胶隔板。
通过凝胶渗透层析(GPC，Waters Model 600，Milford，MA)，利用Millenium软件程序来确定分子量。此外，还使用了三种Styragel柱(Waters，HR1、HR3、HR4，4.6×300mm)和差示折射仪探测器(Waters 2410)。流动相为CHCl3(30℃，1mL/min)。用标准聚苯乙烯(Aldrich，Milwaukee，WI)来进行柱的校准。分别在Varian 300和Brucker AMX 600光谱仪上记录氘化氯仿中1H和13C的NMR谱。
利用稳态芘荧光法来确定临界缔合浓度(CAC)。上文已表明，当芘的水性溶液中两亲聚合物的浓度增加时，芘的激发光谱中的(0，0)带从333移动至338.5nm。由I338/I333强度比所检测到的这种变化伴随着芘分子从水环境转移到疏水的胶束核中而发生，并且可用于估计表观CAC。制备一些都含有10-7M芘的不同聚合物浓度的聚合物水溶液，并在4℃避光搅拌过夜。在20℃搅拌5分钟后，用Serie 2 AmincoBowman荧光计(Spectronics Instruments Inc.，Rochester，NY)检测稳态荧光光谱(λem＝390nm)。通过动态激光散射(DLS)，利用单峰和示差尺寸分布处理器(SDP)强度分析(N4Plus，CoulterElectronics，Hialeah，FL)来确定20℃条件下胶束在水和PBS中的尺寸。
PVP-OH的制备通过自由基聚合反应，使用2-异丙氧基乙醇作为链转移剂来制备以羟基为末端的PVP(PVP-OH)。将VP(5mL，47mmol)和ACCN(0.11g，0.45mmol)溶于60-300mL2-异丙氧基乙醇中。这些溶液用氩脱气。80℃条件下，在干氩气氛中搅拌24小时以进行聚合反应。2-异丙氧基乙醇挥发后，聚合物在过量的二乙醚中沉淀。通过将所得的白色粉末溶解在尽可能少量的CH2Cl2中，并使其从二乙醚中重沉淀，重复三次以纯化聚合物，最后真空干燥。PVP-OH的表征1H NMR δ(ppm)1.15(m，CH3)，3.5-4(宽信号，CH PVP)13C NMR δ(ppm)175(C＝O PVP)，63.05(CH2OH)。
表1PVP的平均分子量
表1中给出了PVP-OH的平均分子量。可以看出，当溶剂/VP体积比增加时，分子量减小。
PVP-PDLLA嵌段共聚物的制备用阴离子开环聚合反应来获得嵌段共聚物。
在氩气吹洗下，将KH(0.567g，14mmol)放入圆底烧瓶中。经由一种双尖针头加入无水THF，短暂地搅拌所得的分散体，然后再去除THF。往烧瓶中加入30mL的THF，并将分散体冷却至0℃。将在P2O5中60℃真空干燥24小时后的PVP-OH(1.5g)溶解在30mL60℃的THF中。用双尖针头将该溶液加入到搅拌的分散体中，并将所得分散体在0℃保持1小时。在加热至室温后，持续搅拌4小时。将上述分散体转移到另一个烧瓶中，并在室温下加入18-冠醚-6(0.085g，0.32mmol)，搅拌30分钟。通过快速加入溶解在20mL THF中的D，L-丙交酯(1.5g，10mmol)来起始D，L-丙交酯的聚合反应。16小时后，通过加入1mL醋酸和5mL水来终止上述聚合反应。4℃条件下，将该聚合物溶液在水中透析24小时以形成胶束。透析后，将上述溶液以40790xg的转速离心30分钟，以去除所有的聚(D，L-丙交酯)(PDLLA)均聚物。在冷冻干燥系统(Labconco，77535型，Kansas City，Missouri)中将上清冻结并冻干。冷冻干燥后的粉末再溶解在水中，并使其通过Sepharose 2B柱(Pharmacia，1×40cm)以除去游离的PVP-OH。将胶束溶液冻结，并冷冻干燥2天，在使用之前都贮存在-20℃。PVP-PDLLA的表征1H NMR δ(ppm)5.2(m，CH PDLLA)，3.5-4(宽信号，CH PVP)13C NMR δ(ppm)175(C＝O PVP)，169(C＝O PDLLA)，69.8(CH-CH3PDLLA)，17.2(CH-CH3PDLLA)。
表2PVP-PDLLA和聚合胶束的表征
a用GPC确定b来自单峰分析现已合成了多种含有不同组合物的PVP-PDLLA嵌段共聚物。如表2所示，胶束的平均尺寸在约44-168nm之间，并且具有低CAC。含有最短的PLA片段的样品3a具有最高的CAC。但是，利用SDP分析显示尺寸分布不是单峰式(见表3)。
表3PVP-PDLLA的尺寸分布，SDP强度分析
如表3所示，所以的胶束样品都是双峰式分布，小颗粒的尺寸在26-124nm之间，大聚集体的尺寸则在106-419nm之间。
用PVP-PDLLA和PEG-PDLLA胶束对吲哚美辛进行截留以研究药物的截留效率，如表4所示。
表4将吲哚美辛掺入聚合胶束中。
PEG-PDLLA(63∶37wt％)Mn＝7900，平均直径(单峰分析)＝110±42nmPVP-PDLLA(60∶40wt％)Mn＝6600，平均直径(单峰分析)＝106±45nm
在此引用的数据是三次测量值的平均值±标准差将药物和共聚物溶解在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，并在水中避光透析24小时。上述溶液经孔径为0.22μm的滤器过滤后冷冻干燥。用Hewlett Packard 8452A二极管阵列分光光度计(Boise，ID)检测胶束的DMF溶液在320nm处的UV吸收，从而确定吲哚美辛的加载量。
在低药物水平时，吲哚美辛在PVP-PDLLA和PEG-PDLLA胶束中的截留效率相近。随着药物加载量的增加，PVP-PDLLA胶束的截留效率比PEG-PDLLA胶束高(就具有相同分子量的共聚物而言)。在不希望受理论约束的条件下，本发明认为，在低药物比率时，药物首先掺入到胶束的核内，然后在高药物比率时，药物才掺入PVP的亲水外壳中。
权利要求
1.一种胶束形成组合物，包含一种疏水核，该核被一种亲水外壳所包围，并且其中所述亲水外壳是聚(N-乙烯基-2-吡咯烷酮)。
2.权利要求1的组合物，其中的胶束形成组合物还包含一种治疗剂，并且其中所述治疗剂被包含在所述胶束内。
3.权利要求1的组合物，其中的疏水核是聚(D，L-乳酸)。
4.权利要求1的组合物，其中的疏水核选自聚酯、聚原酸酯；聚酐；来自酪氨酸的假性-聚(氨基酸)；聚磷腈；聚(丙烯酸烷基酯)；聚(β-苄基-L-天冬氨酸)及其组合。
5.权利要求4的组合物，其中的聚酯选自聚(乙醇酸)、聚(乳酸)、聚(D-乳酸)、聚(D，L-乳酸)、丙交酯/乙交酯共聚物、聚己内酯及其衍生物。
6.权利要求2的组合物，其中的疏水核是聚(D，L-乳酸)。
7.权利要求2的组合物，其中的疏水核选自聚酯、聚原酸酯；聚酐；来自酪氨酸的假性-聚(氨基酸)；聚磷腈；聚(丙烯酸烷基酯)；聚(β-苄基-L-天冬氨酸)及其组合。
8.权利要求7的组合物，其中的聚酯选自聚(乙醇酸)、聚(乳酸)、聚(D-乳酸)、聚(D，L-乳酸)、丙交酯/乙交酯共聚物、聚己内酯及其衍生物。
9.权利要求2的组合物，其中的治疗剂是一种抗肿瘤化合物。
10.权利要求9的组合物，其中的抗肿瘤化合物选自至少一种酞菁化合物、蒽环素化合物、抗代谢药、烷化剂和紫杉烷。
11.权利要求10的组合物，其中的酞菁化合物是氯化铝酞菁。
12.权利要求10的组合物，其中的蒽环素化合物是阿霉素。
13.权利要求10的组合物，其中的抗代谢药选自氨甲蝶呤、丝裂霉素和5-氟尿嘧啶。
14.权利要求10的组合物，其中的烷化剂是亚硝基脲氮芥。
15.权利要求10的组合物，其中的紫杉烷是紫杉醇。
16.权利要求10的组合物，其中的抗代谢药选自氨甲蝶呤、丝裂霉素和5-氟尿嘧啶。
17.权利要求2的组合物，其中的治疗剂选自疏水的抗生素、疏水的抗真菌剂、免疫调节剂、抗病毒药，以及甾体类或非甾体类抗炎药。
18.权利要求2的组合物，其中的治疗剂包括一种基因组片段。
19.一种药物组合物，其中的有效量的治疗剂被截留在聚合胶束内。
20.权利要求19的组合物，其中的治疗剂是以下列方法被截留在聚合胶束内透析、水包油法、将药物/聚合物的固态分散体溶解于水，或将药物和胶束简单平衡。
21.一种用于给予治疗剂的方法，该方法包括提供一种权利要求2的胶束形成组合物，并且将该胶束形成组合物给药于需要这些组合物的对象。
22.一种用以保护治疗剂的方法，该方法包括将所述治疗剂封装于胶束形成组合物中。
全文摘要
用于递送包括抗肿瘤药物在内的治疗剂的新型聚合胶束。
文档编号A61K48/00GK1447683SQ01814444
公开日2003年10月8日 申请日期2001年6月28日 优先权日2000年6月29日
发明者J·C·勒罗克斯, A·S·贝纳梅德 申请人:制药实验室有限公司
1.发明领域本发明涉及含有用于递送治疗剂的聚合胶束的组合物，其中的治疗剂包括抗肿瘤药物，但不局限于此。
2.发明背景与化学治疗剂的应用相关的主要障碍是对癌细胞缺乏选择性。这种选择性的缺乏与使用这些制剂所带来的有害副作用有关，因为它们既可以被递送到异常细胞中，也可以被递送到正常细胞中。在对除癌症外的各种疾病进行治疗的过程中，药物对靶细胞缺乏选择性同样是个难题。大部分的研究工作集中于开发一些能够将药物选择性地递送到靶细胞的药物载体。例如，为了提高低治疗指数药物的递送选择性，现已对多种药物载体进行了研究，如脂质体、微颗粒、超微联合体以及药物-聚合物结合体。
将脂质体(磷脂泡)作为定向装置的研究吸引了广泛的关注。但是，由于脂质体可被肝脏和脾脏中网状内皮(RE)细胞快速地清除，并且它在血浆中不稳定，所以这些脂质体的定向效率受到限制，此外由于尺寸引起的外渗、制备脂质体的技术难题和易于受到氧化作用，这些脂质体的能力也受到限制。已经找到针对单个问题的解决方法，但是很少有某个单独的组合物能同时解决一个以上的问题。举例来说，如果降低RE细胞的识别率和提高脂质体的稳定性，那么获得直径小于50nm的稳定脂质体就很困难了。
将聚合胶束作为药物载体是1984年由Bader，H.et al.，Angew.Makromol.Chem.123/124(1984)457-485首先提出的。聚合胶束越来越成为科学界的研究热点，并且成为有潜力的弱水溶性药物的载体，因为这些聚合胶束能将那些药物溶解在其内部核中，并且提供一些优良特性，如普遍小的尺寸(＜100nm)和能避免被网状内皮系统(RES)清除的性质。
经常将胶束与病毒或脂蛋白等天然载体比较。这三种载体都表现出一种相似的核-壳式结构，不管是病毒所含的DNA，还是脂蛋白和胶束所含的不溶于水的药物，这一结构都可以在向靶细胞运送的过程中保护其内含物。
由于肿瘤表现出对低密度脂蛋白的需求增加，所以建议将脂蛋白作为载体，用以将抗肿瘤化合物定向于癌细胞。然而，脂蛋白载体的效率受到了置疑，主要是因为掺入脂蛋白的药物也可能被健康细胞识别，并且还因为它们必须与天然脂蛋白竞争肿瘤细胞上的受体位点。而病毒载体主要用于递送遗传物质，并且由于它们可能引发免疫应答，所以在不需要反复使用递送载体的应用领域中非常适用。
聚合胶束可能是递送不溶于水的药物的最有效的载体之一。聚合胶束的特征在于具有一种核-壳式结构。关于聚合胶束的药学研究主要集中于具有A-B双嵌段结构的共聚物，其中A和B分别是亲水壳部分和疏水核合聚物。多嵌段共聚物如聚(环氧乙烷)-聚(环氧丙烷)-聚(环氧乙烷)(PEO-PPO-PEO)(A-B-A)能够自组装以形成胶束，并且被认为是有潜力的药物载体。Kabanov，A.V.et al.，FEBS Lett.258(1989)343-345。通常由可生物降解的聚合物组成的疏水核起着不溶性药物的贮存器的作用，保护药物免与水性环境接触，这些可生物降解的聚合物如聚(β-苯甲基-L-天冬氨酸)(PBLA)、聚(DL-乳酸)(PDLLA)以及聚(ε-己内酯)(PCL)。上述核还可以由一种水溶性聚合物组成，如聚(天冬氨酸)(P(Asp))，该聚合物通过与疏水药物的化学结合而被赋予疏水性，或者通过两种所带电荷相反的聚离子结合而形成(聚离子复合胶束)。在一些研究中描述了作为内核构成成分的非生物降解性聚合物或弱生物降解性聚合物，如聚苯乙烯(Pst)或聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)的应用。参阅，例如，Zhao，C.L.et al.，Langmuir 6(1990)514-516；Zhang，L.et al.，Science268(1995)1728-1731以及Inoue，T.et ar.，J.ControlledRelease51(1998)211-229。非生物降解聚合物必须是无毒的，并且具有足够低的分子量以便能经肾脏途径排泄，才能成为临床有关的药物载体。此外，上述疏水内核还可以由一种高疏水的短链组成，如烃链，或一种二酰基脂类，如二硬脂酰磷酯酰乙醇胺(DSPE)。该疏水链既可以与聚合物的一个末端结合，也可以随机分布在聚合结构中。
上述外壳负责胶束的稳定性以及胶束与血浆蛋白和细胞膜之间的相互作用。该外壳通常由PEO等亲水性、非生物降解性、生物相容性聚合物构成的一些链所组成。该载体的生物分布主要取决于亲水外壳的性质。诸如聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPA)和聚(烷基丙烯酸)等其他聚合物则赋予上述胶束温度敏感性或pH敏感性，并且可最终用于使胶束具有生物粘附特性。此外还了解在胶束表面具有能与定向部分结合的官能团。参阅，例如，Scholz，C.et al.，Macromolecules28(1995)7295-7297。
聚(N-乙烯基-2-吡咯烷酮)(PVP)是一种众所周知的具有高度极性的内酰胺基团的水溶性、生物相容性、两亲性聚合物，其中的内酰胺基团在骨架上被非极性的亚甲基所包围，在环上被非极性的次甲基所包围。通常将PVP用作为聚苯乙烯乳胶合成中的空间稳定剂。参阅，例如Gabaston，L.I.et al.，Macromolecules 31(1998)2883-2888；Rutt，J.S.et al.，J.Polym.Sci.Part APolym.Chem.，32(1994)2505-2515。此外，PVP还可以用作冷冻保护剂和冻干保护剂。参阅，例如，Skaer，H.B.et al.，J.Microsc.110(1997)257-270；Townsend，M.W.et ar.，J.Prenter.Sci.Technol.，42(1998)190-199。
与PEG相比，PVP对非离子型和离子型共溶质都表现出显著的相互作用多样性。参阅，Molyneux，P.，Proc.Int.Symp.Povidone(1983)1-19。具有长烷基链或芳香族部分的分子会最明显地发生结合作用。与PEG相似，PVP也能增加胶质载体和肽/蛋白在体内的循环时间。参阅，例如，kamada，H.et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.257(1999)448-453；Torchilin，V.P.，J.Microencapsulation15(1998)1-19。此外还有研究表明，含有聚(D，L-乳酸)和聚(乙二醇)(PEG)的双嵌段共聚物的超微颗粒经冷冻干燥后会发生聚集。参阅，De Jaeghere，F.et al.，Pharm.Res.16(1999)859-866.这个问题可以通过使用冻干保护剂加以避免。由于PVP本身是一种冻干保护剂，所以使用PVP就可以解决该问题。
N-乙烯基吡咯烷酮(VP)能与多种乙烯基单体发生共聚反应。它与负电性单体聚合后形成交替型共聚物，而与丙烯酸酯则形成无规共聚物。举例来说，可以制备由聚(L-丙交酯)(PLLA)和PVP组成的接枝共聚物。参阅，Eguiburu，J.L.，J.San Roman，Polymer37(1996)3615-3622。在该研究中，PLLA巨单体与VP共聚，但是聚合胶束的形成过程还没有确定。
到目前为止，大部分关于制备生物可降解聚合胶束的研究工作都集中于如何利用PEG形成亲水外壳。参阅，例如，X.Zhang，X.，etal.，Inter.J.Pharm.132(1996)195-206；Yokoyama，M.，et al.，J.Control.Release55(1998)219-229，以及Allen，C.，et al.，J.Control.Release63(2000)275-286。
因此，仍然需要一些新的生物相容性-生物可降解性的聚合胶束体系，这些体系不含有PEG，但也能表现出良好的溶解性质，并且这些系统还提供一些供多种药物结合的位点。此外，在其冻干形式中加入水后，这些体系还必须容易地再分散或再溶解。本发明的这种体系由双嵌段PVP-聚(D，L-丙交酯)(PLLA)构成。
3.发明概述本发明提供一种胶束形成组合物，其中包括一种疏水核，该核被一种亲水外壳所包围，并且其中所述亲水外壳是PVP。
本发明还提供一种胶束形成组合物，其中包括一种治疗剂；以及一种疏水核，该核被一种亲水外壳所包围，并且其中所述亲水外壳是PVP，其中所述治疗剂包含于上述胶束中。
本发明还提供一些方法，用以将至少一种适当的治疗剂装入聚合胶束。
本发明还提供一种聚合胶束组合物，其中包含一种治疗剂，该治疗剂通过被包含在上述胶束的疏水核或亲水外壳中，从而避免了发生化学相互作用，如水解作用。
通过阅读以下详细描述，本领域的一般技术人员将更容易理解本发明的这些和其他特性及优点。
4.发明详述本发明提供一种胶体组合物，该组合物由聚合胶束组成，其中的聚合胶束可用于递送具有弱水溶性的治疗剂和/或与亲水外壳具有特异性亲和力的治疗剂。该聚合胶束的特征在于具有一种核壳式结构，其中的疏水核被亲水外壳所包围。该亲水外壳包括一种亲水聚合物或共聚物。
本发明的亲水聚合物是聚(N-乙烯基-2-吡咯烷酮)(PVP)的聚合物或共聚物。
疏水部分构成了胶束的核。疏水部分可选自聚酯，如聚(乙醇酸)、聚(乳酸)、聚(D-乳酸)、聚(D，L-乳酸)、丙交酯/乙交酯共聚物、聚己内酯及其衍生物；聚原酸酯及其衍生物；聚酐及其衍生物；来自酪氨酸的假性-聚(氨基酸)及其衍生物；聚磷腈及其衍生物；聚(丙烯酸烷基酯)及其衍生物；聚(β-苄基-L-天冬氨酸)及其衍生物，以及它们的组合。优选的疏水部分是聚(D，L-丙交酯)(PDLLA)。PDLLA的浓度可以为约10％-50％(w/w)。
4.1胶束的形成胶束形成是两种力作用的结果。一种是导致分子缔合的吸引力，另一种是防止胶束无限生长至肉眼可见状态的排斥力。当两亲共聚物被置于一种对亲水聚合物或疏水聚合物具有选择性的溶剂中时，就会发生自缔合。
两亲共聚物的胶束化过程与低分子量的表面活性剂类似。在浓度非常低的条件下，聚合物仅以单链形式存在。当浓度增加至临界值即被称为临界缔合浓度(“CAC”)时，聚合物链开始缔合以形成胶束，其方式是，共聚物的疏水部分将避免与将其稀释的水性介质接触。在CAC条件下，在胶束的核内部可发现大量溶剂，由此可以将胶束描述成松散的聚集体，这些聚集体的尺寸比在高浓度条件下形成的胶束更大。在上述浓度条件下，平衡将偏向胶束形成，这些胶束会采用其低能状态的构型，并且残余溶剂将逐渐从疏水核中释放出来，从而使胶束的尺寸缩小。两亲共聚物通常表现出比低分子量表面活性剂低得多的CAC。举例来说，PEO-PBLA和PNIPA-PSt的CAC介于0.0005-0.002％之间。然而，某些两亲共聚物却表现出高得多的CAC，如泊洛沙姆的CAC就高达0.01-10％。具有高CAC的两亲共聚物可能不适合作为药物定向载体，因为它们在水性环境中不稳定，并且在稀释时易于解聚。
两亲共聚物的胶束化可产生两种不同类型的胶束，这取决于疏水链是与亲水聚合物无规结合还是与亲水链的一个末端接枝。由无规改性聚合物形成的胶束一般比末端改性聚合物形成的胶束小。决定胶束尺寸的主要因素有，将疏水链掩蔽在胶束核内的疏水力，以及限制其大小的链间占有体积排斥力。上述两种力在无规改性共聚物和末端改性共聚物中平衡的差异是造成它们大小不同的原因。当末端疏水基团相互缔合以形成胶束时，固定在疏水片段周围的水簇被排除到核外，从而在核与亲水外壳间没有直接的相互作用，该亲水外壳在上述胶束结构中仍保持可动的线性链形式。而无规改性聚合物的缔合方式是聚合物的疏水部分和亲水部分相互缠绕，从而可以使核和水性介质接触。这是一个重要事件，因为暴露的疏水核可能导致聚合胶束的次级聚集。此外，还认为次级聚集是用以解释在结合了阿霉素(DOX)的PEO-P(Asp)胶束体系中存在大颗粒(＞100nm)的一种假说。
4.2临界缔合浓度(CAC)的确定光散射被广泛用于确定胶束的分子量和聚集数。但是，只有当CAC下降到散射法的灵敏度范围内时，才可能对胶束化的起始进行检测。在水中对于聚合物来说这种情况是非常少见的。由于单链和共聚物的胶束组分的洗脱体积不同，所以在水性条件下可以使用凝胶渗透层析法(GPC)。此外，利用GPC还可以同时确定胶束的分子量和聚集数。在经大小排阻柱洗脱过程中，保持聚合胶束的完整性是非常重要的。聚合物吸附在柱子上也可能带来难题，尤其是当浓度接近CAC时，因为该条件下的胶束由大量松散的聚集体构成。
一种优选的确定CAC的方法涉及荧光探针的使用，其中普遍使用的是芘。芘是一种缩合的芳香烃，它具有高度的疏水性和对周围环境的极性高度的灵敏性。当低于CAC时，芘可溶解在水中，水是一种高极性的介质。当胶束形成时，芘倾向于分配到胶束核所提供的疏水区域中，因而处于一种非极性环境中。所以，可发现大量的变化，如荧光强度增加、发射光谱的振动性精细结构的变化，以及激发光谱中(0，0)带的红移。表观CAC可以由芘的荧光对浓度曲线获得，I1/I3比可由对浓度的发射光谱获得，以及I338/I333比可由对浓度的激发光谱获得。斜率上显著的变化表明胶束化的起始。I1/I3比是第一和第三最高能量发射峰的强度比，并且在恒定的激发波长以及对应于I1和I3的可变的发射波长条件下进行测定。运用荧光技术确定CAC需要仔细地解释，原因有两个。第一，芘的浓度应该保持极低(10-7M)，这样才能在发生胶束化时，精确地检测斜率的变化。第二，疏水杂质的存在或探针与各个聚合链或胶束化前聚集体缔合有时会导致荧光光谱的逐渐变化。荧光探针的各向异性变化也与胶束化的起始有关。
诸如本发明组合物的那些聚合胶束的特征在于它们具有小尺寸(10-100nm)。除了载体物质外渗的需要外，这种小尺寸还使得组合物的灭菌可以简单地利用过滤来实现，并且尽可能地减少阻塞毛细血管的危险。而使用较大的药物载体不能实现这些目的。胶束的尺寸取决于多种因素，包括共聚物的分子量、亲水链和疏水链的相对比例以及聚集数。利用透析法制备的胶束的尺寸会受到用以溶解聚合物的有机溶剂的影响。
胶束的直径和粒度多分散性可以用动态光散射(DLS)在水中或一种等渗缓冲液中直接获得。DLS还能提供关于聚合胶束的圆球度的信息。
此外，还可利用一些方法来估计胶束的大小，如原子力显微镜(AFM)、透射电镜(TEM)和扫描电镜(SEM)。这些方法可用于检测胶束的形状和粒度分散性。有时还可以进行超速离心速率研究以评定聚合胶束的多分散性。
4.3将治疗剂掺入聚合胶束中根据本领域的技术人员所熟知的技术可实现将治疗剂装填入胶束。举例来说，通过水包油方法或透析法，将化合物溶解在含有所要操作的胶束的溶液中可实现治疗剂的加载。
可使用的治疗剂可以包括以下列举的任何一种化合物，这些化合物能以一种稳定方式被聚合胶束所截留，并且能以治疗有效剂量被给药。根据本发明，为了有效地加载到胶束中，优选使用的治疗剂是疏水性的治疗剂。然而，离子型胶束和电荷相反的亲水化合物，如反义寡核苷酸，可能形成稳定的复合物。适合的药物包括抗肿瘤化含物，如酞菁类(例如，氯化铝酞菁)、蒽环素类(anthracycline)(例如，阿霉素(DOX))、弱溶解性的抗代谢药(例如，氨甲蝶呤、丝裂霉素、5-氟尿嘧啶)和烷化剂(例如，亚硝基脲氮芥)。此外，胶束还可以含有紫杉烷类，如紫杉醇。
胶束中可含有的其它药物通常是一些疏水的抗生素和抗真菌剂，如两性霉素B、弱水溶性的免疫调节剂，如环孢霉素、弱水溶性的抗病毒药，如HIV蛋白酶抑制剂、弱水溶性的甾体类抗炎药(例如，地塞米松)和非甾体类抗炎药(例如，吲哆美辛)，以及基因组片段。
另外，将药物掺入到本发明的聚合胶束组合物中的方法有，化学结合、通过透析而物理地截留、乳化技术、药物和胶束在水性介质中简单地平衡，以及将药物/聚合物的固态分散体溶解于水中。
诸如蛋白质等的亲水化合物也可以被掺入到本发明的聚合胶束组合物中。但是，掺入这种亲水类型时，需要对分子进行化学疏水化处理，或要求分子与亲水外壳具有特定的亲和性。聚离子型化合物可通过形成聚离子型复合胶束而掺入其中。
通常使用透析法或水包油乳剂法来进行药物的物理截留。透析法就是将溶解在乙醇或N，N-二甲基甲酰胺等溶剂中的药物和共聚物加入到一种仅溶解聚合物的亲水部分的选择性的溶剂中，如水。由于良溶剂被选择性的溶剂所取代，聚合物的疏水部分发生缔合从而形成了胶束的核，该核在胶束形成过程中掺入了不可溶的药物。通过把透析时间延长数天以上可完全地去除有机溶剂。在水包油乳剂法中，将药物在氯仿等不溶于水的挥发溶剂中形成的溶液加入到共聚物的水性溶液中，从而形成一种水包油乳剂。当溶剂蒸发时，胶束-药物结合物便形成了。与水包油乳剂法相比，透析法主要的优点是避免了强毒性溶剂的使用，如含氯的溶剂。
药物的加载过程可能会影响药物在胶束内部的分布。例如，Cao etal.(Macromolecules 24(1991)6300-6305)研究表明，在胶束形成过程中掺入其中的芘和在胶束形成后掺入其中的芘都没有与水性环境隔离，尽管前一种方法所得药物加载量比后一种方法得到的药物加载量高三倍。
本发明的聚合胶束的截留效率取决于起始的药物添加量。超出最大的加载能力会导致治疗剂的沉淀，并且因此而得到低产量。此外，治疗剂的加载效率依赖于共聚物的聚集数。表现出较高聚集数的胶束能允许更多的药物溶解在其内部核中。
4.4加载有治疗剂的聚合胶束的实例表1中给出了加载至聚合胶束的化合物的实例和相应的药物加载方法。本发明的聚合胶束组合物被认为适用于作为很多治疗剂的递送系统，这些治疗剂包括，但不局限于，抗癌药、质粒DNA、反义寡核苷酸，或适用于将诊断剂递送到身体的特定器官。
表1
可利用GPC或DLS这两种检测胶束大小变化的方法来获得药物掺入的证据。药物的存在通常引起胶束尺寸的增加。药物在胶束核内部的定位可以通过淬灭实验来演示。例如，碘化物(I)，它是DOX的一种水溶性淬灭剂，不会影响掺入胶束的药物的荧光，但是能淬灭游离药物的荧光。这类实验表明，在冷冻干燥和重构于水中后，DOX仍保留在PEO-PBLA中。对DOX来说，胶束中药物的自缔合也导致药物的荧光强度降低。最近，研究发现两性霉素B在掺入PEO-PBLA胶束后其溶血活性的测定值下降，这间接地确定了胶束可以滞留和缓慢释放两性霉素B。
4.5药学应用本发明的聚合胶束组合物适用于各种药学领域，如口服递送、缓释和位点专一性药物定向。优选的是将本发明的胶束作为水不溶性药物的运送工具。
5.实施例以下实施例仅作为说明，并不意味着限制本发明的范围。
材料商品化的溶剂购自Moquin Scientific(Terrebonne，Quebec)，各种试剂则购自Aldrich(Milwaukee，WI)。N-乙烯基-2-吡咯烷酮(VP)、2-异丙氧基乙醇、以35wt.％的浓度溶解在矿物油中的氢化钾(KH)和18-冠醚-6不经过进一步纯化直接使用。D，L-丙交酯在无水乙酸乙酯中60℃重结晶三次，然后在减压条件下，于P2O5中室温干燥24小时。使用四氢呋喃(THF)前，将其在干氩气氛下从钠和二苯甲酮中回流和蒸馏出来。纯化1，1’-偶氮双(环己烷腈)(ACCN)的方法是，通过将其从乙醇溶液中沉淀于水中，然后真空干燥4天。Sepharose 2B购自Sigma(Saint Louis，MO)，并在使用前用水平衡。胶束制备过程中使用的透析袋是Spectra/Por Membranes(Rancho Dominguez，CA)，MWCO 6000-8000。在干氩气氛下，所有反应都是在预先用火烤过的圆底烧瓶中进行，并且这些烧瓶都被安装上橡胶隔板。
通过凝胶渗透层析(GPC，Waters Model 600，Milford，MA)，利用Millenium软件程序来确定分子量。此外，还使用了三种Styragel柱(Waters，HR1、HR3、HR4，4.6×300mm)和差示折射仪探测器(Waters 2410)。流动相为CHCl3(30℃，1mL/min)。用标准聚苯乙烯(Aldrich，Milwaukee，WI)来进行柱的校准。分别在Varian 300和Brucker AMX 600光谱仪上记录氘化氯仿中1H和13C的NMR谱。
利用稳态芘荧光法来确定临界缔合浓度(CAC)。上文已表明，当芘的水性溶液中两亲聚合物的浓度增加时，芘的激发光谱中的(0，0)带从333移动至338.5nm。由I338/I333强度比所检测到的这种变化伴随着芘分子从水环境转移到疏水的胶束核中而发生，并且可用于估计表观CAC。制备一些都含有10-7M芘的不同聚合物浓度的聚合物水溶液，并在4℃避光搅拌过夜。在20℃搅拌5分钟后，用Serie 2 AmincoBowman荧光计(Spectronics Instruments Inc.，Rochester，NY)检测稳态荧光光谱(λem＝390nm)。通过动态激光散射(DLS)，利用单峰和示差尺寸分布处理器(SDP)强度分析(N4Plus，CoulterElectronics，Hialeah，FL)来确定20℃条件下胶束在水和PBS中的尺寸。
PVP-OH的制备通过自由基聚合反应，使用2-异丙氧基乙醇作为链转移剂来制备以羟基为末端的PVP(PVP-OH)。将VP(5mL，47mmol)和ACCN(0.11g，0.45mmol)溶于60-300mL2-异丙氧基乙醇中。这些溶液用氩脱气。80℃条件下，在干氩气氛中搅拌24小时以进行聚合反应。2-异丙氧基乙醇挥发后，聚合物在过量的二乙醚中沉淀。通过将所得的白色粉末溶解在尽可能少量的CH2Cl2中，并使其从二乙醚中重沉淀，重复三次以纯化聚合物，最后真空干燥。PVP-OH的表征1H NMR δ(ppm)1.15(m，CH3)，3.5-4(宽信号，CH PVP)13C NMR δ(ppm)175(C＝O PVP)，63.05(CH2OH)。
表1PVP的平均分子量
表1中给出了PVP-OH的平均分子量。可以看出，当溶剂/VP体积比增加时，分子量减小。
PVP-PDLLA嵌段共聚物的制备用阴离子开环聚合反应来获得嵌段共聚物。
在氩气吹洗下，将KH(0.567g，14mmol)放入圆底烧瓶中。经由一种双尖针头加入无水THF，短暂地搅拌所得的分散体，然后再去除THF。往烧瓶中加入30mL的THF，并将分散体冷却至0℃。将在P2O5中60℃真空干燥24小时后的PVP-OH(1.5g)溶解在30mL60℃的THF中。用双尖针头将该溶液加入到搅拌的分散体中，并将所得分散体在0℃保持1小时。在加热至室温后，持续搅拌4小时。将上述分散体转移到另一个烧瓶中，并在室温下加入18-冠醚-6(0.085g，0.32mmol)，搅拌30分钟。通过快速加入溶解在20mL THF中的D，L-丙交酯(1.5g，10mmol)来起始D，L-丙交酯的聚合反应。16小时后，通过加入1mL醋酸和5mL水来终止上述聚合反应。4℃条件下，将该聚合物溶液在水中透析24小时以形成胶束。透析后，将上述溶液以40790xg的转速离心30分钟，以去除所有的聚(D，L-丙交酯)(PDLLA)均聚物。在冷冻干燥系统(Labconco，77535型，Kansas City，Missouri)中将上清冻结并冻干。冷冻干燥后的粉末再溶解在水中，并使其通过Sepharose 2B柱(Pharmacia，1×40cm)以除去游离的PVP-OH。将胶束溶液冻结，并冷冻干燥2天，在使用之前都贮存在-20℃。PVP-PDLLA的表征1H NMR δ(ppm)5.2(m，CH PDLLA)，3.5-4(宽信号，CH PVP)13C NMR δ(ppm)175(C＝O PVP)，169(C＝O PDLLA)，69.8(CH-CH3PDLLA)，17.2(CH-CH3PDLLA)。
表2PVP-PDLLA和聚合胶束的表征
a用GPC确定b来自单峰分析现已合成了多种含有不同组合物的PVP-PDLLA嵌段共聚物。如表2所示，胶束的平均尺寸在约44-168nm之间，并且具有低CAC。含有最短的PLA片段的样品3a具有最高的CAC。但是，利用SDP分析显示尺寸分布不是单峰式(见表3)。
表3PVP-PDLLA的尺寸分布，SDP强度分析
如表3所示，所以的胶束样品都是双峰式分布，小颗粒的尺寸在26-124nm之间，大聚集体的尺寸则在106-419nm之间。
用PVP-PDLLA和PEG-PDLLA胶束对吲哚美辛进行截留以研究药物的截留效率，如表4所示。
表4将吲哚美辛掺入聚合胶束中。
PEG-PDLLA(63∶37wt％)Mn＝7900，平均直径(单峰分析)＝110±42nmPVP-PDLLA(60∶40wt％)Mn＝6600，平均直径(单峰分析)＝106±45nm
在此引用的数据是三次测量值的平均值±标准差将药物和共聚物溶解在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，并在水中避光透析24小时。上述溶液经孔径为0.22μm的滤器过滤后冷冻干燥。用Hewlett Packard 8452A二极管阵列分光光度计(Boise，ID)检测胶束的DMF溶液在320nm处的UV吸收，从而确定吲哚美辛的加载量。
在低药物水平时，吲哚美辛在PVP-PDLLA和PEG-PDLLA胶束中的截留效率相近。随着药物加载量的增加，PVP-PDLLA胶束的截留效率比PEG-PDLLA胶束高(就具有相同分子量的共聚物而言)。在不希望受理论约束的条件下，本发明认为，在低药物比率时，药物首先掺入到胶束的核内，然后在高药物比率时，药物才掺入PVP的亲水外壳中。
权利要求
1.一种胶束形成组合物，包含一种疏水核，该核被一种亲水外壳所包围，并且其中所述亲水外壳是聚(N-乙烯基-2-吡咯烷酮)。
2.权利要求1的组合物，其中的胶束形成组合物还包含一种治疗剂，并且其中所述治疗剂被包含在所述胶束内。
3.权利要求1的组合物，其中的疏水核是聚(D，L-乳酸)。
4.权利要求1的组合物，其中的疏水核选自聚酯、聚原酸酯；聚酐；来自酪氨酸的假性-聚(氨基酸)；聚磷腈；聚(丙烯酸烷基酯)；聚(β-苄基-L-天冬氨酸)及其组合。
5.权利要求4的组合物，其中的聚酯选自聚(乙醇酸)、聚(乳酸)、聚(D-乳酸)、聚(D，L-乳酸)、丙交酯/乙交酯共聚物、聚己内酯及其衍生物。
6.权利要求2的组合物，其中的疏水核是聚(D，L-乳酸)。
7.权利要求2的组合物，其中的疏水核选自聚酯、聚原酸酯；聚酐；来自酪氨酸的假性-聚(氨基酸)；聚磷腈；聚(丙烯酸烷基酯)；聚(β-苄基-L-天冬氨酸)及其组合。
8.权利要求7的组合物，其中的聚酯选自聚(乙醇酸)、聚(乳酸)、聚(D-乳酸)、聚(D，L-乳酸)、丙交酯/乙交酯共聚物、聚己内酯及其衍生物。
9.权利要求2的组合物，其中的治疗剂是一种抗肿瘤化合物。
10.权利要求9的组合物，其中的抗肿瘤化合物选自至少一种酞菁化合物、蒽环素化合物、抗代谢药、烷化剂和紫杉烷。
11.权利要求10的组合物，其中的酞菁化合物是氯化铝酞菁。
12.权利要求10的组合物，其中的蒽环素化合物是阿霉素。
13.权利要求10的组合物，其中的抗代谢药选自氨甲蝶呤、丝裂霉素和5-氟尿嘧啶。
14.权利要求10的组合物，其中的烷化剂是亚硝基脲氮芥。
15.权利要求10的组合物，其中的紫杉烷是紫杉醇。
16.权利要求10的组合物，其中的抗代谢药选自氨甲蝶呤、丝裂霉素和5-氟尿嘧啶。
17.权利要求2的组合物，其中的治疗剂选自疏水的抗生素、疏水的抗真菌剂、免疫调节剂、抗病毒药，以及甾体类或非甾体类抗炎药。
18.权利要求2的组合物，其中的治疗剂包括一种基因组片段。
19.一种药物组合物，其中的有效量的治疗剂被截留在聚合胶束内。
20.权利要求19的组合物，其中的治疗剂是以下列方法被截留在聚合胶束内透析、水包油法、将药物/聚合物的固态分散体溶解于水，或将药物和胶束简单平衡。
21.一种用于给予治疗剂的方法，该方法包括提供一种权利要求2的胶束形成组合物，并且将该胶束形成组合物给药于需要这些组合物的对象。
22.一种用以保护治疗剂的方法，该方法包括将所述治疗剂封装于胶束形成组合物中。
全文摘要
用于递送包括抗肿瘤药物在内的治疗剂的新型聚合胶束。
文档编号A61K48/00GK1447683SQ01814444
公开日2003年10月8日 申请日期2001年6月28日 优先权日2000年6月29日
发明者J·C·勒罗克斯, A·S·贝纳梅德 申请人:制药实验室有限公司
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