Dds化合物及其制备方法
专利名称：Dds化合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及将羧甲基葡聚糖多元醇化得到的多糖衍生物与药物化合物结合而形成的药物递送系统化合物(下面称为“DDS化合物”)及其制备方法。
作为这样的一个方法，提议了用多糖衍生物作为药物载体，使抗肿瘤剂与该多糖衍生物结合，延迟抗肿瘤剂在血中的消失，同时提高对癌组织的选择性的方法。公开了使药物通过肽链与具有羧基的多糖的羧基相结合而形成的物质(国际公开WO 94/19376号)；将药物经席夫碱或酰胺键引进经羧甲基化的甘露葡聚糖衍生物而形成的物质(特公平7-84481号)；用多元醇化多糖衍生物作为药物载体，通过肽链并进而通过肽链和对氨基苄氧基羰基与药物结合而得的物质(国际公开WO 99/61061号)等。
在用多糖衍生物作为药物载体的DDS化合物中，用羧甲基葡聚糖经多元醇化后得到的多糖衍生物作为药物载体，通过肽链与药物化合物残基结合而成的DDS化合物具有特别优异的肿瘤选择性，可望开发作为抗肿瘤剂。其中，与药物化合物残基(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3’，4’6，7]吲哚嗪并(indolizino)[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮结合形成的该DDS化合物能发挥优异的肿瘤选择性和抗肿瘤活性，是有望可临床使用的DDS化合物。
根据本发明者们的研究，已知药物化合物残基(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3’，4’6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮通过肽间隔区与羧甲基葡聚糖经多元醇化后得到的多糖衍生物结合形成的上述DDS化合物，其安全性和药效范围随作为药物载体的大分子载体部分的分子量、羧甲基化度以及上述药物化合物残基的导入量的变化而发生较大变动。因此，希望在上述DDS化合物中选择具有高安全性和宽药效范围的特定DDS化合物。
本发明者们在制造羧甲基葡聚糖多元醇时，遇到了下述问题即制造葡聚糖多元醇时由于放热而发生大分子载体分子量的降低，而且在使葡聚糖多元醇羧甲基化时由于放热而不能充分控制羧甲基化度，无法制造具有一定品质的大分子载体。另外，在使上述药物化合物与肽间隔区结合的步骤、以及使药物化合物经由肽间隔区与大分子载体结合的步骤中，由于使用现有方法就必需进行目标物质的分离、提纯，操作烦杂，因而存在目标物质的收率低，无法提供具有良好品质的产品的问题，迫切需要解决这些问题。
本发明者们为解决上述课题进行了深入的研究，从上述DDS化合物中成功地选择了具有高安全性和宽药效范围的化合物。更具体地说，通过使作为药物载体的大分子载体部分的分子量、羧甲基化度以及上述药物化合物残基的导入量最佳化，发现了满足特定条件的化合物具有高安全性和宽药效范围。另外，发现在制造上述特定DDS化合物时，通过选择用于控制反应温度的手段、用于监测反应进行的手段以及反应试剂等，能够以一定品质并且有效地制造目标DDS化合物。本发明在上述基础上得以完成。
即，本发明提供具有下述特征的DDS化合物在(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3’，4’6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮的1-位氨基与羧甲基葡聚糖多元醇的羧基通过含1个氨基酸或2-8个由肽键连接的氨基酸的间隔区结合形成的DDS化合物中，(1)(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3’，4’6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮的残基导入量相对于DDS化合物总重量为3.2-8.4％重量，(2)上述羧甲基葡聚糖多元醇的普鲁兰标准重均分子量为240,000-480,000，并且(3)上述羧甲基葡聚糖多元醇的羧甲基化度为0.23-0.47。
另外，本发明还可提供具有下述特征的DDS化合物在(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3’，4’6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮的1-位氨基与羧甲基葡聚糖多元醇的羧基通过含1个氨基酸或2-8个由肽键连接的氨基酸的间隔区结合形成的DDS化合物中，(1)(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3’，4’6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮的残基导入量相对于DDS化合物总重量为3.2-8.4％重量，(2)上述羧甲基葡聚糖多元醇的普鲁兰标准重均分子量为240,000-480,000，并且(3)上述羧甲基葡聚糖多元醇的羧甲基化度为0.14-0.47。本发明还提供这样的上述DDS化合物即对于这些DDS化合物，用经分解法或NMR法测定标准物质得到的校准曲线，通过毛细管电泳法测定了上述羧甲基葡聚糖多元醇的羧甲基化度。
进而，本发明提供含有上述DDS化合物的药物和含有上述DDS化合物的抗肿瘤剂，以及上述DDS化合物用于制造上述药物的应用和恶性肿瘤治疗方法，该方法包含将治疗有效量的上述DDS化合物给予包括人在内的哺乳动物的步骤。
从其它角度出发，本发明可提供上述DDS化合物的制造方法。本发明的方法为上述DDS化合物的制造方法，包含1个或1个以上选自下列的步骤(A)在4℃±2℃的温度，向含有葡聚糖的水溶液中添加含有高碘酸钠的水溶液，以氧化葡聚糖，然后在不超过15℃的温度下，将所得反应溶液加入到含有硼氢化钠的水溶液中，得到葡聚糖多元醇的步骤；(B)使一氯乙酸钠与葡聚糖多元醇反应制造羧甲基葡聚糖多元醇的步骤，其特征在于通过毛细管电泳法确定羧甲基化的反应终点；(C)(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3’，4’6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮的1-位氨基与其中α-氨基被叔丁氧基羰基保护的1个氨基酸的α-羧基或者其中N末端被叔丁氧基羰基保护的2-8个氨基酸所构成的寡肽的C末端羧基缩合的步骤，其特征在于用1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺或其盐作缩合剂；以及(D)羧甲基葡聚糖多元醇与下述脱保护化合物缩合的步骤(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3’，4’6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮的1-位氨基与其中α-氨基被叔丁氧基羰基保护的1个氨基酸的α-羧基或者其中N末端被叔丁氧基羰基保护的2-8个氨基酸所构成的寡肽的C末端羧基缩合形成缩合物，从该缩合物中除去叔丁氧基羰基得到所述脱保护化合物，本步骤的特征在于用1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺或其盐作缩合剂。
本发明的优选方法包含选自上述(A)-(D)步骤的至少2个步骤，更优选的方法包含选自上述(A)-(D)步骤的至少3个步骤，特别优选的方法包含选自上述(A)-(D)步骤的所有步骤。另外，提供下述操作作为优选方式即通过高效液相色谱法确定步骤(D)中缩合反应的终点。
另外，本发明提供用于制造上述DDS化合物的羧甲基葡聚糖多元醇，其普鲁兰标准重均分子量为240,000-480,000、羧甲基化度为0.23-0.47；用于制造上述DDS化合物的羧甲基葡聚糖多元醇，其普鲁兰标准重均分子量为240,000-480,000、羧甲基化度为0.14-0.47；以及上述羧甲基葡聚糖多元醇，其羧甲基化度是用经分解法或NMR法得到的校准曲线通过毛细管电泳法测定的羧甲基化度。
另外，本发明提供上述羧甲基葡聚糖多元醇用于制造上述DDS化合物的应用方法。
进而，提供上述羧甲基葡聚糖多元醇的制造方法，该方法包括下述步骤(A)在4℃±2℃的温度，向含有葡聚糖的水溶液中添加含有高碘酸钠的水溶液，以氧化葡聚糖，然后在不超过15℃的温度下，将所得反应溶液加入到含有硼氢化钠的水溶液中，得到葡聚糖多元醇的步骤；和
(B)使一氯乙酸钠与上述步骤(A)中所得的葡聚糖多元醇反应制造羧甲基葡聚糖多元醇的步骤，其特征在于通过毛细管电泳法确定羧甲基化的反应终点。
本发明的DDS化合物的特征在于在(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3’，4’6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮(以下，在本说明书中有时称为“药物化合物”)的1-位氨基与羧甲基葡聚糖多元醇的羧基通过含1个氨基酸或2-8个经肽键连接的氨基酸的间隔区结合形成的DDS化合物中，(1)上述药物化合物的残基导入量相对于DDS化合物总重量为3.2-8.4％重量，优选为5.6-7.6％重量，(2)上述羧甲基葡聚糖多元醇的普鲁兰标准重均分子量为240,000-480,000，并且(3)上述羧甲基葡聚糖多元醇的羧甲基化度为0.23-0.47。
另外，本发明提供的其它DDS化合物的特征在于在(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3’，4’6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮(以下，在本说明书中有时称为“药物化合物”)的1-位氨基与羧甲基葡聚糖多元醇的羧基通过含1个氨基酸或2-8个经肽键连接的氨基酸的间隔区结合形成的DDS化合物中，(1)上述药物化合物的残基导入量相对于DDS化合物总重量为3.2-8.4％重量，优选为5.6-7.6％重量，(2)上述羧甲基葡聚糖多元醇的普鲁兰标准重均分子量为240,000-480,000，并且
(3)上述羧甲基葡聚糖多元醇的羧甲基化度为0.14-0.47。
本说明书中，用“-”表示的数值范围包括上限和下限的数值。
国际公开WO 97/46260中公开了(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3’，4’6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮的1-位氨基与羧甲基葡聚糖多元醇的羧基通过含1个氨基酸或2-8个经肽键连接的氨基酸的间隔区结合形成的药物复合体，但是并未公开上述的特定DDS化合物。
本发明的DDS化合物中，作为药物载体发挥作用的羧甲基葡聚糖多元醇的重均分子量为240,000-480,000。羧甲基葡聚糖多元醇的普鲁兰标准重均分子量可以通过本领域技术人员众所周知的方法进行测定，例如可以按照凝胶过滤色谱法以普鲁兰作标准进行测定。作为标准的普鲁兰可以从Shodex社等公司购得。此外，羧甲基葡聚糖多元醇的羧甲基化度范围为0.14-0.47或0.23-0.47。
羧甲基葡聚糖多元醇的羧甲基化度可以根据本领域人员众所周知的方法进行测定，例如可以通过毛细管电泳法进行测定。用毛细管电泳法测定羧甲基葡聚糖多元醇的羧甲基化度时，可以使用用标准物质得到的校准曲线。可以配制羧甲基导入量不同的多种羧甲基葡聚糖多元醇用作标准物质。校准曲线可以通过例如分解法或NMR法中的任一种方法获得，但是有时对于相同的标准物质用分解法和NMR法会得到不同的羧甲基化度测定值。一般而言，由NMR法得到的羧甲基化度的测定值有比由分解法得到的测定值低0.09左右的倾向。因而，当使用由NMR法制作的校准曲线时，羧甲基化度最好为0.14-0.38。
在分解法中，对由羧甲基葡聚糖多元醇的酸解而分别定量生成的甘油(Glr)、乙醇醛(GA)、羧甲基甘油(CM-Glr)和羧甲基乙醇醛(CM-GA)进行定量。水解物中的甘油可以在碱性条件下通过高效液相色谱法直接进行定量；乙醇醛可以在与作为醛标记试剂的丹磺酰肼反应后，反应生成物通过高效液相色谱法定量。而关于羧甲基甘油和羧甲基乙醇醛，则是在使羧甲基乙醇醛的醛还原转换为羧甲基乙二醇(CM-EG)后，分别与羧酸的荧光标记试剂9-蒽基重氮甲烷反应，反应生成物通过高效液相色谱法定量。羧甲基化度可以通过下式进行计算CM-Glr/(Glr+CM-Glr)+CM-EG/(GA+CM-EG)。
NMR法中，用羧甲基导入量不同的多种羧甲基葡聚糖多元醇作标准物质，测定其13C-NMR。算出各标准物质的羧甲基葡聚糖多元醇的C-1位和C-5位、以及羧甲基结合于侧链部分的C-1位和C-5位这4种信号的面积强度，通过羧甲基结合于侧链部分的C-1位和C-5位的面积强度在C-1位和C-5位的面积强度总和中所占的比例求出各羧甲基葡聚糖多元醇的羧甲基化度。
构成本发明DDS化合物的间隔区可以用包含1个氨基酸残基的间隔区或者包含寡肽残基的间隔区，其中所述寡肽含有经肽键连接的2-8个氨基酸残基。该间隔区有1个氨基酸残基(意指从氨基酸的氨基和羧基分别除去1个氢原子和1个羟基后的残基)、或者含有经肽键连接的2-8个氨基酸残基的寡肽残基(意指从N末端的氨基和C末端的羧基分别除去1个氢原子和1个羟基后的残基)的形态，由C末端(在包含1个氨基酸的间隔区的情况下为α-羧基)与(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3’，4’6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮的1位氨基通过肽键结合。
优选的间隔区为包含由2-6个氨基酸残基构成的寡肽残基的间隔区。对构成间隔区的氨基酸种类没有特别限制，可以使用例如L-或D-氨基酸，优选L-氨基酸，除α-氨基酸外，还可以使用β-丙氨酸、ε-氨基己酸、γ-氨基丁酸等。优选将这些α-氨基酸以外的氨基酸配置在间隔区中接近药物载体的位置。
当使用包含寡肽残基的间隔区时，对氨基酸序列没有特别限制，例如间隔区可以是由-X-Z-表示的二肽残基(X表示疏水性氨基酸残基，Z表示亲水性氨基酸残基，-X-Z-表示从二肽的N末端氨基和C末端羧基分别除去1个氢原子和1个羟基后的残基，所述二肽由疏水性氨基酸(X)和亲水性氨基酸(Z)各自的N末端侧和C末端侧经肽键结合形成)，或者可以适当使用包含该二肽残基作为部分肽序列的间隔区。疏水性氨基酸可以用例如苯基丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸等，亲水性氨基酸可以使用甘氨酸、丙氨酸等。间隔区可以具有这样的二肽残基的重复序列(例如-X-Z-X-Z-、-X-Z-X-Z-X-Z-等)。
如果使用含有这种二肽结构的间隔区，则间隔区可在被认为具有丰富肽酶的肿瘤部位、炎症部位水解，在该部位短时间内释放出高浓度的药物化合物，因而由含有上述二肽的间隔区与药物化合物结合形成的部分构造是本发明DDS化合物的优选部分构造。
可用作间隔区的寡肽残基的具体例子表示在下表中，但可用于本发明DDS化合物的间隔区并不限于这些物质，不言而喻，本领域技术人员可适当选择间隔区的种类，以使药物化合物具有最佳的释放速度(肽序列的左侧为N末端，C末端(在包含1个氨基酸的间隔区的情况下为α-羧基)经肽键与(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3’，4’6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮的1-位氨基结合)。D-Phe表示D-苯基丙氨酸残基，其它氨基酸表示L-氨基酸。释放速度的大小根据结合了多柔比星的DDS化合物对于Walker 256带癌大鼠的药效显示程度、或者在Walker 256带癌大鼠的肿瘤部位释放的多柔比星浓度进行判定。)。其中，特别优选用-Gly-Gly-Phe-Gly-作为本发明的DDS化合物的间隔区。
(a)释放速度大的间隔区-Leu-Gly--Tyr-Gly--Phe-Gly--Gly-Phe-Gly--Gly-Gly-Phe-Gly--Gly-Phe-Gly-Gly--Phe-Gly-Gly-Gly--Phe-Phe-Gly-Gly--Gly-Gly-Gly-Phe-Gly-(b)释放速度比较大的间隔区-Gly-Gly-Phe-Phe--Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-(c)释放速度比较小的间隔区-Phe-Phe--Ala-Gly--Pro-Gly--Gly-Gly-Gly-Phe-
(d)释放速度小的间隔区-Gly--D-Phe-Gly--Gly-Phe--Ser-Gly--Gly-Gly--Gly-Gly-Gly--Gly-Gly-Gly-Gly-(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3’，4’6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮可以通过特开平5-59061号公报中记载的方法合成。本发明DDS化合物中上述药物化合物的残基导入量相对于DDS化合物重量为3.2-8.4％重量，优选5.6-7.6％重量。本领域人员可以通过例如吸光度分析容易地确定上述药物化合物的导入量。
本发明的DDS化合物可以用作在肿瘤部位特定显示所需抗肿瘤活性，并且具有高安全性的抗肿瘤剂。含有本发明DDS化合物的药物通常可以以冷冻干燥品的形态填充到管形瓶中，作为用时溶解型的注射用或点滴用制剂等非经口给药制剂用于临床应用，本发明药物的剂型不限于上述剂型。制造上述制剂时，可以使用例如助溶剂、pH调节剂、稳定剂等可在本领域使用的制剂用添加剂。对本发明药物的给药量没有特别限定，但1日1m2体表面积以大约1-500mg左右，优选以约10-100mg的范围1日给药1次，优选每3-4周重复。
对本发明DDS化合物的制造方法没有特别限定，可以通过本发明所提供的上述制造方法适当进行制造。本发明的方法包含上述步骤(a)到(D)中的任何1个步骤或至少2个步骤相结合，最优选包含(A)到(D)的所有步骤。下面对本发明的最优选方式，即包含(A)到(D)的所有步骤的方法进行说明，但本发明范围并不限于这一优选方式。
本发明的优选方法包含下述步骤(A)在4℃±2℃的温度，向含有葡聚糖的水溶液中添加含有高碘酸钠的水溶液，以氧化葡聚糖，然后在不超过15℃的温度下，将所得反应溶液加入到含有硼氢化钠的水溶液中，得到葡聚糖多元醇的步骤；(B)使一氯乙酸钠与上述步骤(A)中所得的葡聚糖多元醇反应制造羧甲基葡聚糖多元醇的步骤，其特征在于通过毛细管电泳法确定羧甲基化的反应终点；(C)(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3’，4’6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮的1-位氨基与其中α-氨基被叔丁氧基羰基保护的1个氨基酸的α-羧基或者其中N末端被叔丁氧基羰基保护的2-8个氨基酸所构成的寡肽的C末端羧基缩合的步骤，其特征在于用1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺或其盐作缩合剂；以及(D)从上述步骤(C)所得的缩合物中除去叔丁氧基羰基而得到的脱保护化合物与上述步骤(B)所得的羧甲基葡聚糖多元醇进行缩合的步骤，其特征在于用1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺或其盐作缩合剂。
步骤(A)是由葡聚糖得到葡聚糖多元醇的步骤。对原料葡聚糖的种类没有特别限定，可以任意含有α-D-1，6-键。例如，可以使用α-D-1，6-键的比例为等于或大于85％、等于或大于90％、或者等于或大于95％的葡聚糖等。用作原料的葡聚糖优选葡聚糖T500(Pharmacia公司制造)等分子量为500,000左右的物质。对所得葡聚糖多元醇的多元醇化度没有特别限定，优选在实质上可以完全多元醇化的条件下处理葡聚糖。
上述使用高碘酸钠的氧化反应，有时由于反应时的温度上升会使葡聚糖多元醇的分子量降低，而本发明方法的特征就在于为了抑制所述分子量降低，是在4℃±2℃的温度，向含有葡聚糖的水溶液中添加含有高碘酸钠的水溶液。含有葡聚糖的水溶液可以含有例如缓冲剂。添加含高碘酸钠的水溶液时，最好控制添加速度，使反应温度不上升，为了避免部分温度上升，最好进行适当搅拌。反应从几天到20天左右，通常10天左右完成。反应溶液中的葡聚糖浓度为例如几克至100克左右/升反应溶液，优选10克左右/升反应溶液。
反应结束后，根据需要向所得反应溶液中加入乙二醇等，以消耗掉过量的过酸，再根据需要将反应溶液的pH调节至中性附近(例如pH6.5左右)，然后在不超过15℃的温度下，将该反应溶液添加到含有硼氢化钠的水溶液中进行还原。进行还原反应时，有时由于反应时温度上升会导致葡聚糖多元醇的分子量降低，而本发明的方法，其特征就在于为了抑制所述分子量降低，将上述氧化反应的反应溶液在不超过15℃的温度下添加到含有硼氢化钠的水溶液中。最好控制添加速度，使反应溶液的温度不上升，为了避免部分温度上升，最好进行适当的搅拌。通常在添加后通过将反应混合物维持在冰冷却温度下，使反应在几小时至几天，优选1天左右完成。
最好从所得反应溶液中分离具有所需分子量的葡聚糖多元醇，作为后续步骤(B)的原料使用。例如，最好用超滤膜除去低分子量和高分子量的部分，进而根据需要也可附加实施脱盐和浓缩等步骤。脱盐和浓缩也可以用超滤膜来进行。
步骤(B)是将上述步骤(A)所得的葡聚糖多元醇进行羧甲基化，制造重均分子量(普鲁兰标准)为240,000-480,000的羧甲基葡聚糖多元醇的步骤。葡聚糖多元醇的羧甲基化可以通过例如使氯乙酸、溴乙酸等卤代乙酸或其盐，优选一氯乙酸的钠盐与葡聚糖多元醇的羟基反应，使葡聚糖多元醇的羟基部分羧甲基化来进行。例如，可将葡聚糖多元醇溶解在不参与反应的惰性溶剂(例如水、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜等)中，在碱(例如氢氧化钠、氢氧化钾等)的存在下，添加卤代乙酸或卤代乙酸的盐，使其在冰冷却至100℃的温度范围内，反应几分钟至几天。优选可使其在20℃反应几小时至1天左右。最好在反应后，用超滤膜除去低分子量和高分子量的部分，进而根据需要可以附加使用超滤膜的脱盐和浓缩等步骤。
羧甲基葡聚糖多元醇的羧甲基化度可以通过羧甲基化的反应温度、用作试剂的卤代乙酸或其盐的添加量等在一定程度上进行控制，但在本发明的方法中，为了更严密地将羧甲基化程度控制在0.14-0.47或0.23-0.47的范围内，通过毛细管电泳法确定羧甲基化的反应终点，这是本发明方法的特征所在。
毛细管电泳法(capillary electrophoresis，CE)通常是在内径不超过100μm的熔融石英制造的毛细管内进行电泳的方法(参照例如马场嘉信，ぶんせき(分析)，342，1995等)。毛细管电泳有毛细管区带电泳(CZE)、动电色谱法(EKC)、毛细管凝胶电泳(CGE)等多种分离模式，本发明方法可以使用这些分离模式中的任何一种。优选可以使用毛细管区带电泳，可以在毛细管内装满磷酸、柠檬酸、硼酸等的缓冲液进行分离。通过该方法可以正确测定每单位分子量的电荷，能够在短时间内并且高灵敏地测定上述反应溶液中试料的羧甲基化度。本说明书的实施例具体阐述了该方法的细节，本领域人员能够参照上述出版物的一般说明以及其它出版物，按照本说明书的实施例中所记载的具体方法，通过根据需要对其进行适当修正乃至改变，容易并且正确地确定羧甲基化的反应终点(羧甲基化度为0.14-0.47或0.23-0.47)。
如先前已经说明的那样，当通过毛细管电泳法测定羧甲基葡聚糖多元醇的羧甲基化度时，可以采用由标准物质得到的校准曲线。校准曲线可以由例如分解法或NMR法的任一种方法得到，但是有时对于相同的标准物质用分解法和NMR法会得到不同的羧甲基化度测定值。一般而言，由NMR法得到的羧甲基化度的测定值有比由分解法得到的测定值低0.09左右的倾向。因而，当使用由NMR法制作的校准曲线时，羧甲基化度最好为0.14-0.38。
步骤(C)是使(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3’，4’6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮的1-位氨基与用作间隔区的寡肽的C末端羧基(在用1个氨基酸的情况下为α-羧基)缩合的步骤。用作间隔区的上述寡肽或氨基酸为了供给该反应使用，需要分别将N末端氨基或α-氨基用叔丁氧基羰基保护起来，其方法是本领域人员熟知并通常使用的。
本发明方法在特征在于在进行上述缩合反应时，用1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EPCI)或其盐作缩合剂，优选用1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐作缩合剂。与使用N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)之类的N，N’-二环烷基碳二亚胺类作缩合剂的情况相比，使用上述缩合剂能够简化反应操作，能使反应时间大幅缩短。更具体地说，可以避免除去缩合剂的离心分离和过柱操作，反应时间也可缩短至使用DCC时的大约1/5左右。基质浓度与使用DCC时相比也可增加大约5倍。特别是在工业化的大规模合成体系中，可通过削减试剂、缩短时间而大幅度降低成本。
上述反应除了可以使用EPCI或其盐作缩合剂外，还可以与使用通常的缩合剂来形成肽键的缩合反应一样进行。可以使用相对于上述药物化合物为1-1.5当量左右的叔丁氧基羰基化氨基酸或叔丁氧基羰基化寡肽，在二甲基甲酰胺等惰性溶剂中进行反应。反应通常于室温下进行几小时至1天左右，优选于室温下在3小时左右结束。对反应溶液中的药物化合物浓度没有特别限定，通常为50-200克/升左右，优选为100-150克/升左右。
步骤(D)是从上述步骤(C)所得的缩合物中除去叔丁氧基羰基而得到的脱保护化合物与上述步骤(B)所得的羧甲基葡聚糖多元醇进行缩合的步骤。除去叔丁氧基羰基的方法是本领域人员众所周知并且惯常使用的，优选例如用三氟乙酸进行处理的方法。提纯脱保护化合物时，可以通过例如用异丙醚等洗涤来进行。
本发明方法的特征在于在使结合了药物化合物的间隔区的N末端氨基(在将1个氨基酸用作间隔区的情况下为α-氨基酸)与羧甲基葡聚糖多元醇的羧基结合时，用1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EPCI)或其盐作缩合剂，优选用1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐作缩合剂。与使用N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)之类的N，N’-二环烷基碳二亚胺类作缩合剂的情况相比，使用上述缩合剂能够避免除去缩合剂的离心分离和柱操作，可大幅缩短反应时间，在工业化的大规模合成体系中，可大幅度降低成本。上述反应的终点可以通过HPLC确定。
上述反应除了可以使用EPCI作缩合剂外，还可以与使用通常的缩合剂来形成肽键的缩合反应一样进行。相对于1重量份羧甲基葡聚糖多元醇，可以使用0.1-0.2重量份左右的结合了药物化合物的氨基酸或寡肽，在含水甲醇等惰性溶剂中进行反应。反应通常于室温下在几小时至1天左右，优选于室温下在2-3小时左右完成。
本说明书中的实施例给出了本发明方法的具体例子，本领域人员能够参照上述的一般说明和实施例的具体说明，根据需要进行适当修正乃至改变，实施本发明的方法。另外，不言而喻，本领域人员可以在本发明范围内适当选择反应温度、反应时间、试剂浓度等。
含有本发明DDS化合物的药物通常可以以冷冻干燥品的形态填充到小瓶中，以用时溶解型的注射用或点滴用制剂等非经口给药制剂形态，作为治疗肿瘤的药物应用于临床应用。关于本发明的DDS化合物作为肿瘤治疗药物的应用，国际公开WO 97/46260号的公开作为参照包含在本说明书的公开中。但本发明药物的剂型不限于上述剂型，制造上述制剂时，可以使用例如助溶剂、pH调节剂、稳定剂等可在本领域使用的制剂用添加剂。对上述药物的给药量没有特别限定，通常1日1m2体表面积以大约0.1-100mg左右，优选以约1-30mg的范围非经口1次给药，优选每3-4周重复给药。实施例下面，通过实施例对本发明进行更具体的说明，但本发明的范围并不限于下述实施例。另外，实施例中，有时将(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3’，4’6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮称作“药物化合物”，“Gly-Gly-Phe-Gly”表示甘氨酰基-甘氨酰基-苯基丙氨酰基-甘氨酸或其残基。试验例中所用的DDS化合物为上述药物化合物与羧甲基葡聚糖多元醇通过四肽间隔区(Gly-Gly-Phe-Gly)结合形成的DDS化合物，并且经过配制使其具有羧甲基化度和分子量不同的不同大分子载体。实施例1葡聚糖多元醇(Dex-PA)的合成 将葡聚糖-T500(Pharmacia公司制造，300g)溶解在pH调节至5.5的0.2M乙酸缓冲液(15l)中，将NaIO4(990g)溶解在纯水(15l)中，在低温室(约4℃)放置一夜。次日，将NaIO4溶液(3.5℃)缓缓注入葡聚糖-T500的溶液(3.5℃)中，使温度不致上升(不超过7.0℃)，注入后不经其它处理即在低温室内搅拌(100rpm)。搅拌10天后，加入乙二醇(210ml)，搅拌2小时，用Peroxid试纸确认过酸消失后，用10％NaOH将反应溶液调节至pH6.5。接着将该反应溶液在冰冷却下滴加到NaBH4溶液(420g，12l)中。此时，使体系内温度不超过15℃，在3小时内滴加。之后将反应混合物在低温室搅拌一夜，次日用乙酸将pH调节至5.5后，再搅拌1小时，用10％NaOH将pH调节至7.0。将所得反应溶液用Paul Filtron的超滤膜(1000k)进行处理，除去微粒和大分子部分。再用Millipore超滤膜(50k)进行脱盐(使用90-100l左右纯水)和浓缩，在用HPLC进行监测的同时浓缩至1997ml。取其中一部分(1ml×3)作为试样，冷冻干燥后为60.1mg，算出产量为120g。实施例2羧甲基葡聚糖多元醇(CM-Dex-PA)的合成 (A)羧甲基葡聚糖多元醇(CM-Dex-PA)的合成将NaOH(193g)溶解在纯水(1537ml)中，将液温保持在25℃，加入葡聚糖多元醇水溶液，将体系内温度保持在25℃同时进行搅拌。向该混合物中缓缓加入一氯乙酸钠，在相同温度下搅拌15小时。通过毛细管电泳法确认反应的终点后，用乙酸将pH值调节至8.0左右，进行超滤。最初用1000k的膜除去大分子，然后用50k的膜除去低分子化合物(试剂和盐)，浓缩。在此期间随时通过HPLC掌握低分子化合物的除去情况，确认低分子化合物大致被除去后，结束超滤。将羧甲基葡聚糖多元醇溶液浓缩至3770ml，其1ml冷冻干燥后为32.1mg，因而算出产量为121g。
(B)通过毛细管电泳法测定羧甲基化度-之1毛细管电泳用光电二极管阵列190nm-300nm(检测195nm)作检测器，用熔融石英制的内径75μm、有效长度500mm、全长670mm的管作毛细管，用20mM四硼酸钠水溶液作电泳液。将试料用0.02％叠氮化钠水溶液配制成2mg/ml。用反应时间19小时、19.5小时和20小时的三批作试料。校准曲线用通过分解法确定羧甲基化度为0.22、0.42和0.62的三种羧甲基葡聚糖多元醇作为标准物质制作而成。各自的保留时间(分钟)为4.496、5.442和6.600。试料的保留时间(分钟)为5.325、5.400和5.446。从该结果可得出各试料的羧甲基化度为0.38、0.40和0.41。实施例3叔丁氧基羰基(Boc)-Gly-Gly-Phe-Gly-药物化合物A的合成 使药物化合物A·甲磺酸盐(80g)与叔丁氧基羰基-Gly-Gly-Phe-Gly-OH(68g)悬浮于N，N-二甲基甲酰胺(1200ml)中。在冰冷却搅拌条件下，加入三乙胺(48ml)、1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EPCI·HCl，29.6g)、羟基苯并三唑(HBT，20.8g)，在室温下搅拌。通过HPLC确认反应的终点后，在冰冷却搅拌条件下，30分钟内，向反应溶液中滴加水(800ml)，使内部温度保持在20℃或20℃以下，析出结晶。之后再滴加水(1200ml)。接下来用乙酸将溶液的pH值调节至7。将析出的固体过滤水洗，将所得结晶减压干燥，得到标题化合物(120.4g，定量)。1H-NMR(DMSO-d6/TMS)δ(ppm)0.97(3H，m)，1.11(2H，d，J＝6.3Hz)，1.41(9H，s)，1.91(2H，m)，2.05(1H，m)，2.33(4H，m)，2.95-3.10(4H，m)，3.58-3.72(2H，m)，3.8(1H，m)，4.03(1H，m)，4.34(1H，m)，4.74(1H，m)，5.13(1H，m)，5.33(1H，m)，5.58(2H，m)，7.18(5H，m)，7.49(2H，m)实施例4H-Gly-Gly-Phe-Gly-药物化合物A·三氟乙酸盐的合成 在冰冷却下，向上述实施例3中得到的叔丁氧基羰基-Gly-Gly-Phe-Gly-药物化合物A(120g)中滴加三氟乙酸(360ml)。叔丁氧基羰基-Gly-Gly-Phe-Gly-药物化合物A完全溶解后，通过HPLC确认脱叔丁氧基羰基反应的完成。向该反应溶液中滴加甲醇(360ml)和异丙醚(720ml)，使内部温度保持在0℃-15℃之间。过滤析出的结晶，用乙酸乙酯(500ml)洗涤3次，将所得结晶在不超过50℃的内部温度下溶解于20％含水甲醇(400ml)中，之后依次加入乙酸乙酯(400ml)和异丙醚(800ml)进行再结晶。将该结晶过滤并溶解于含水甲醇(400ml)中，加入活性炭(4.4g)进行脱色处理。过滤上述溶液，在不超过55℃的温度下，向滤液中加入乙酸乙酯(400ml)，然后加入异丙醚(800ml)，再结晶。将过滤后的结晶减压干燥，得到H-Gly-Gly-Phe-Gly-药物化合物A(111.8g，由药物化合物A换算为90％)。1H-NMR(DMSO-d6/TMS)δ(ppm)0.87(3H，m)，1.87(2H，m)，2.17(2H，m)，2.37(3H，m)，2.74(1H，m)，3.00(1H，m)，3.16(1H，m)，3.58(2H，s)，3.65-3.91(4H，m)，4.48(1H，m)，5.2(2H，s)，5.39(2H，m)，5.58(1H，m)，6.53(1H，s)，7.21(5H，m)，7.75(1H，d，J＝10.9Hz)，8.06(2H，s)，8.28(1H，d，J＝8.2Hz)，8.49(1H，m)，8.52(1H，m)实施例5本发明的DDS化合物的合成 向含有羧甲基葡聚糖多元醇(800g)的水溶液中加入纯水，使其与羧甲基葡聚糖多元醇水溶液部分合并达到32L，再加入甲醇(60L)。向该混合液中加入溶解了实施例4中所得的H-Gly-Gly-Phe-Gly-药物化合物A(133g)和羟基苯并三唑(23.4g)的20％含水甲醇(4l)。加入1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(33.1g)，用1N NaOH将pH值调节至6.8-7.2。使该混合物在室温(23℃±5℃)反应2-3小时。再添加1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(8.1g)，用1N HCl将pH值调节至6.8-7.2，使其继续反应2-3小时左右。再添加1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(5.6g)，用1N HCl将pH值调节至6.8-7.2，使其继续反应1小时左右。反应结束后，用1N NaOH将反应溶液的pH值调节至8.7-9.2，保存在10℃或10℃以下。之后，通过超滤膜(50k)将溶液脱盐和浓缩。接着用膜滤器进行微孔过滤，将所得溶液冷冻干燥，得到本发明的DDS化合物(880g)。实施例6反应温度对葡聚糖多元醇分子量降低的影响(氧化反应)以基质浓度1％、20g的规模按照实施例1进行葡聚糖的氧化反应。反应温度设定为4、8、12、15℃，测定改变反应时间时产物在凝胶过滤色谱法中的保留时间。如表1所示，反应温度为12℃和15℃时，在第六日可确认由分子量降低所引起的明显的保留时间延迟。在8℃时，在第10日可确认明显的保留时间延迟。
表1反应温度/时间 3天6天 10天4℃ 10.46分钟 10.44分钟 10.53分钟8℃ 10.52分钟 10.63分钟 10.83分钟12℃10.45分钟 10.63分钟 -15℃10.59分钟 10.92分钟 -实施例7反应温度对葡聚糖多元醇分子量降低的影响(氧化反应)在实施例6所得结果的基础上，将温度范围进一步详细设定(4℃、1℃、6.5℃)，进行同样的实验。如表2所示，在所有温度范围内，不发生分子量的降低，进行了反应，但是在1℃进行反应时，反应体系中的盐析出变多。从上述结果可判断，该反应温度的安全范围为2-6℃。
表2反应温度/时间 3天 6天10天4℃10.40分钟 10.39分钟 10.49分钟1℃10.42分钟 10.39分钟 10.45分钟6.5℃ 10.40分钟 10.36分钟 10.39分钟实施例8反应温度对葡聚糖多元醇分子量降低的影响(还原反应)按照实施例1，在葡聚糖的氧化反应后接着进行还原反应。反应温度设定为10、15、20、30℃，使其反应12-24小时后，测定产物在凝胶过滤色谱法中的保留时间。如表3所示，当反应温度超过15℃时，可明显确认分子量的降低。
表3反应温度 通过凝胶过滤色谱法进行判定10℃无分子量降低15℃有一些分子量降低20℃分子量降低30℃显著的分子量降低实施例9由羧甲基化度测定方法不同而引起的DDS化合物的羧甲基化度的测定值变动用3种羧甲基葡聚糖多元醇作为标准物质通过分解法和NMR法制作校准曲线。用该校准曲线与实施例2(B)一样测定DDS化合物(3批)的羧甲基化度。结果如下所示。用经NMR得到的校准曲线所得到的任何一批的羧甲基化度测定值都比通过分解法所得到的测定值减少了0.09。
表4标准物质(羧甲基葡聚糖多元醇)的羧甲基化度
表5 DDS化合物的羧甲基化度
下面给出试验例，试验例中所示的羧甲基化度是通过分解法得到的值。试验例1(A)方法使6周龄的雄性BALB/c小鼠(日本SLC株式会社)自由摄取市售的饲料和水，经过1周驯养后用作试验用动物。肿瘤细胞是用小鼠肿瘤细胞Meth A纤维肉瘤在同系小鼠BALB/c的腹腔内每周进行继代培养。用内毒素浓度不超过50pg/ml的Hanks’培养基(HBSS，Gibco-BRL)从小鼠的腹腔内采集肿瘤细胞，经几次离心操作(约600rpm，5-10分钟，4℃)进行洗涤后，悬浮于HBSS培养基中，按1×106/0.1ml/小鼠的比例移植于小鼠的腹腔内。
抗肿瘤试验中，以1×106/0.1ml/小鼠的比例将Meth A细胞皮下移植于小鼠的右腹股沟处(0天)，在移植后的第7或12天，用游标卡尺测量肿瘤的长径(L)和短径(W)，算出推定肿瘤重量(ETW＝L×W2/2mg)，将小鼠以6或7只进行分组，使推定肿瘤重量的组平均为100mg，将试样以单次或每四日四次的用法进行静脉内给予。将小鼠在肿瘤移植后的第21或26天通过颈椎脱臼杀死，取出肿瘤，测定其重量。用公式IR＝(1-TWt/TWc)×100(％)(TWt、TWc分别为试样给予组和对照组的平均肿瘤重量)由肿瘤重量值算出肿瘤增殖抑制效果(IR)。IR等于或大于58％时判断为具有抗肿瘤效果。通过Dunnet法进行对照组与试样给予组之间的肿瘤重量的显著性检验。
进而，为了评价试样的副作用，将体重减少率(BWL)和因毒性而死的小鼠数与所用小鼠数的比(D/U)设定为毒性参数。通过公式BWL＝(1-BWn/BWs)×100(％)由开始给予时的小鼠平均体重(BWs)和第n天的小鼠平均体重(BWn)算出BWL。该BWL的最大值设为BWLmax。只是，当与开始给予日比较无法确认体重减少时，将BWLmax表示为0以下(＜0)。另外，将试样溶解于日本药典注射用生理盐水，以10或20ml/kg的给予溶液量进行静脉内给予。
(B)结果将羧甲基葡聚糖多元醇分子量为48,000-457,000的DDS化合物(羧甲基化度0.37-0.46、药物导入量4.6-6.4％重量)经单次给予进行试验，当羧甲基葡聚糖多元醇的分子量为200,000-300,000时，以低用量可确认稳定的不低于58％的有效抗肿瘤效果，而分子量不到200,000时，最小有效量则增大了。分子量不到50,000时，毒性和抗肿瘤效果减弱了，推测这是由于存在尿排泄。因此可得结论为如果羧甲基葡聚糖多元醇的分子量等于或大于200,000，则即使是低用量亦可获得稳定的抗肿瘤效果。另一方面，如果羧甲基葡聚糖多元醇的分子量超过500,000，则会因为粘性而发生对物理损坏的稳定性变差等问题。从上述结果可知DDS化合物中羧甲基葡聚糖多元醇的分子量需要在50,000-500,000的范围内，为了达到所需的抗肿瘤效果，并且制造稳定的产品，羧甲基葡聚糖多元醇的普鲁兰标准重均分子量最好在240,000-480,000范围内。试验例2将69只7周龄的BALB/c系雄性小鼠(日本SLC株式会社)驯养1周，1组5只，给予羧甲基化度不同的DDS化合物(药物导入量5.3-6.3％重量、分子量270,000-330,000)。给予时的平均体重为21.1-25.4g。将动物在设定为室温(23±2℃)、湿度(55±20％)、照明时间12小时(800-2000)的房间内关在铝制的笼子中，每只笼子关5只，使其自由摄取市售的固体饲料(F2、船桥农场制造)和含氯自来水进行饲养。将DDS化合物溶解于日本药典生理盐水中，在1.02-1.36mg/ml的浓度以1ml/kg的溶液量进行尾静脉内给予。
对动物的症状1日1次，包括给予日在内观察15日，在给予前以及给予后的第3、7、10和14日测定体重。死亡例是在发现死亡后立即解剖，而存活例则是在给予后第14日在乙醚麻醉下通过切断腹大动脉将其放血杀死，肉眼观察全身各器官。以组平均值±标准偏差算出体重数据，之后以显著水平5％进行统计学分析。结果羧甲基化度为0.38、0.43和0.47的DDS化合物的最大耐受剂量(MTD)分别为11.7、11.7和10.3mg/Kg，这表明羧甲基化度超过0.43时有毒性增强的趋势。另外，用羧甲基化度为0.53的DDS化合物进行了同样的毒性评价，在10mg/kg给予组中，6只中有3只死亡，体重减少和致死毒性显著增强。另一方面，羧甲基化度为0.23的DDS化合物的MTD与羧甲基化度为0.38的DDS化合物相同。从而可得出结论从安全性的方面考虑，优选DDS化合物的羧甲基化度在0.23-0.47范围内。试验例3与上述试验例2一样操作，用药物化合物残基导入量为3.2-15％重量的DDS化合物(羧甲基化度0.37-0.40、分子量260,000-320,000)进行了抗肿瘤试验。结果，在1.25mg/Kg给予组中，当导入量为3.2-7.3％重量时，可确认IR等于或大于80％的药效，但是当导入量超过8.4％重量(到15％重量)时，可确认药效与上述试验相比具有明显降低的趋势。另外，当导入量超过8.4％重量时，在2.5或5mg/kg给予组中，显示出了与其它复体相同的药效，但是在10mg/kg给予组中可确认致死毒性增强了。从上述结果可得出结论为了达到所需的抗肿瘤效果，提供安全性高的DDS化合物，药物化合物残基的导入量最好在3.2-8.4％重量范围内。
产业上的可利用性本发明的DDS化合物具有高安全性和宽药效范围，是临床上极为有用的抗肿瘤剂。本发明的方法能够以高品质并且有效地高收率制造上述DDS化合物，适于工业应用。
权利要求
1.DDS化合物，其中(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3’，4’6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮的1-位氨基通过含1个氨基酸或2-8个由肽键连接的氨基酸的间隔区与羧甲基葡聚糖多元醇的羧基相结合，其特征在于(1)(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3’，4’6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮的残基导入量相对于DDS化合物总重量为3.2-8.4％重量，(2)上述羧甲基葡聚糖多元醇的普鲁兰标准重均分子量为240,000-480,000，并且(3)上述羧甲基葡聚糖多元醇的羧甲基化度为0.23-0.47。
2.DDS化合物，其中(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3’，4’6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮的1-位氨基通过含1个氨基酸或2-8个由肽键连接的氨基酸的间隔区与羧甲基葡聚糖多元醇的羧基相结合，其特征在于(1)(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3’，4’6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮的残基导入量相对于DDS化合物总重量为3.2-8.4％重量，(2)上述羧甲基葡聚糖多元醇的普鲁兰标准重均分子量为240,000-480,000，并且(3)上述羧甲基葡聚糖多元醇的羧甲基化度为0.14-0.47。
3.DDS化合物，其中(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3’，4’6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮的1-位氨基通过含1个氨基酸或2-8个由肽键连接的氨基酸的间隔区与羧甲基葡聚糖多元醇的羧基相结合，其特征在于(1)(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3’，4’6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮的残基导入量相对于DDS化合物总重量为3.2-8.4％重量，(2)上述羧甲基葡聚糖多元醇的普鲁兰标准重均分子量为240,000-480,000，并且(3)上述羧甲基葡聚糖多元醇的羧甲基化度为0.14-0.38。
4.权利要求1-3中任一项的DDS化合物，其中所述(3)中的羧甲基化度是用经分解法或NMR法测定标准物质羧甲基葡聚糖多元醇得到的校准曲线，通过毛细管电泳法测定的羧甲基化度。
5.权利要求1的DDS化合物，其中所述(3)中的羧甲基化度是用经分解法测定标准物质羧甲基葡聚糖多元醇得到的校准曲线，通过毛细管电泳法测定的羧甲基化度。
6.权利要求3的DDS化合物，其中所述(3)中的羧甲基化度是用经NMR法测定标准物质羧甲基葡聚糖多元醇得到的校准曲线，通过毛细管电泳法测定的羧甲基化度。
7.含有权利要求1-6中任一项的DDS化合物的抗肿瘤剂。
8.权利要求1-6中任一项的DDS化合物的制造方法，该方法包含1个或1个以上选自下列的步骤(A)在4℃±2℃的温度，向含有葡聚糖的水溶液中添加含有高碘酸钠的水溶液，以氧化葡聚糖，然后在不超过15℃的温度下，将所得反应溶液加入到含有硼氢化钠的水溶液中，得到葡聚糖多元醇的步骤；(B)使一氯乙酸钠与葡聚糖多元醇反应制造羧甲基葡聚糖多元醇的步骤，其特征在于通过毛细管电泳法确定羧甲基化的反应终点；(C)(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3’，4’6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮的1-位氨基与其中α-氨基被叔丁氧基羰基保护的1个氨基酸的α-羧基或者其中N末端被叔丁氧基羰基保护的2-8个氨基酸所构成的寡肽的C末端羧基缩合的步骤，其特征在于用1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺或其盐作缩合剂；以及(D)羧甲基葡聚糖多元醇与下述脱保护化合物缩合的步骤(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3’，4’6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮的1-位氨基与其中α-氨基被叔丁氧基羰基保护的1个氨基酸的α-羧基或者其中N末端被叔丁氧基羰基保护的2-8个氨基酸所构成的寡肽的C末端羧基缩合形成缩合物，从该缩合物中除去叔丁氧基羰基得到所述脱保护化合物，本步骤的特征在于用1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺或其盐作缩合剂。
9.权利要求1-6中任一项的DDS化合物的制造方法，该方法包含下列步骤(A在4℃±2℃的温度，向含有葡聚糖的水溶液中添加含有高碘酸钠的水溶液，以氧化葡聚糖，然后在不超过15℃的温度下，将所得反应溶液加入到含有硼氢化钠的水溶液中，得到葡聚糖多元醇的步骤；(B)使一氯乙酸钠与上述步骤(A中所得的葡聚糖多元醇反应制造羧甲基葡聚糖多元醇的步骤，其特征在于通过毛细管电泳法确定羧甲基化的反应终点；(C)(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3’，4’6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮的1-位氨基与其中α-氨基被叔丁氧基羰基保护的1个氨基酸的α-羧基或者其中N末端被叔丁氧基羰基保护的2-8个氨基酸所构成的寡肽的C末端羧基缩合的步骤，其特征在于用1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺或其盐作缩合剂；以及(D)从上述步骤(C)所得的缩合物中除去叔丁氧基羰基而得到的脱保护化合物与羧甲基葡聚糖多元醇缩合的步骤，其特征在于用1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺或其盐作缩合剂。
10.用于制造权利要求1-6中任一项的DDS化合物的羧甲基葡聚糖多元醇，其普鲁兰标准重均分子量为240,000-480,000、羧甲基化度为0.23-0.47。
11.用于制造权利要求1-6中任一项的DDS化合物的羧甲基葡聚糖多元醇，其普鲁兰标准重均分子量为240,000-480,000、羧甲基化度为0.14-0.47。
12.用于制造权利要求1-6中任一项的DDS化合物的羧甲基葡聚糖多元醇，其普鲁兰标准重均分子量为240,000-480,000、羧甲基化度为0.14-0.38。
13.权利要求10-12中任一项的羧甲基葡聚糖多元醇，其中所述羧甲基化度是用经分解法或NMR法测定标准物质羧甲基葡聚糖多元醇得到的校准曲线，通过毛细管电泳测定的羧甲基化度。
14.权利要求10的羧甲基葡聚糖多元醇，其中所述羧甲基化度是用经分解法测定标准物质羧甲基葡聚糖多元醇得到的校准曲线，通过毛细管电泳测定的羧甲基化度。
15.权利要求12的羧甲基葡聚糖多元醇，其中所述羧甲基化度是用经NMR法测定标准物质羧甲基葡聚糖多元醇得到的校准曲线，通过毛细管电泳测定的羧甲基化度。
16.权利要求10-15中任一项的羧甲基葡聚糖多元醇的制造方法，该方法包含下列步骤(A)在4℃±2℃的温度，向含有葡聚糖的水溶液中添加含有高碘酸钠的水溶液，以氧化葡聚糖，然后在不超过15℃的温度下，将所得反应溶液加入到含有硼氢化钠的水溶液中，得到葡聚糖多元醇的步骤；和(B)使一氯乙酸钠与上述步骤(A)中所得的葡聚糖多元醇反应制造羧甲基葡聚糖多元醇的步骤，其特征在于通过毛细管电泳法确定羧甲基化的反应终点。
全文摘要
DDS化合物，其中药物化合物(1S，9S)－1－氨基－9－乙基－5－氟－2，3－二氢－9－羟基－4－甲基－1H，12H－苯并[de]吡喃并[3’，4’∶6，7]吲哚嗪并[1，2－b]喹啉－10，13(9H，15H)－二酮的1－位氨基与羧甲基葡聚糖多元醇的羧基通过含1个氨基酸或2－8个由肽键连接的氨基酸的间隔区相结合，其特征在于药物化合物残基的导入量为3.2－8.4％重量，羧甲基葡聚糖多元醇的平均分子量为240,000－480,000，羧甲基化度为0.14－0.47。所述DDS化合物的制造方法，该方法包括下述步骤在4℃±2℃的温度，向含有葡聚糖的水溶液中添加含有高碘酸钠的水溶液，以氧化葡聚糖，然后在不超过15℃的温度下，将所得反应溶液加入到含有硼氢化钠的水溶液中，得到葡聚糖多元醇。
文档编号A61P35/00GK1449412SQ01814617
公开日2003年10月15日 申请日期2001年6月27日 优先权日2000年6月29日
发明者井村明弘, 野口滋, 山口达也, 八木努, 川边武史 申请人:第一制药株式会社
技术领域：
本发明涉及将羧甲基葡聚糖多元醇化得到的多糖衍生物与药物化合物结合而形成的药物递送系统化合物(下面称为“DDS化合物”)及其制备方法。
作为这样的一个方法，提议了用多糖衍生物作为药物载体，使抗肿瘤剂与该多糖衍生物结合，延迟抗肿瘤剂在血中的消失，同时提高对癌组织的选择性的方法。公开了使药物通过肽链与具有羧基的多糖的羧基相结合而形成的物质(国际公开WO 94/19376号)；将药物经席夫碱或酰胺键引进经羧甲基化的甘露葡聚糖衍生物而形成的物质(特公平7-84481号)；用多元醇化多糖衍生物作为药物载体，通过肽链并进而通过肽链和对氨基苄氧基羰基与药物结合而得的物质(国际公开WO 99/61061号)等。
在用多糖衍生物作为药物载体的DDS化合物中，用羧甲基葡聚糖经多元醇化后得到的多糖衍生物作为药物载体，通过肽链与药物化合物残基结合而成的DDS化合物具有特别优异的肿瘤选择性，可望开发作为抗肿瘤剂。其中，与药物化合物残基(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3’，4’6，7]吲哚嗪并(indolizino)[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮结合形成的该DDS化合物能发挥优异的肿瘤选择性和抗肿瘤活性，是有望可临床使用的DDS化合物。
根据本发明者们的研究，已知药物化合物残基(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3’，4’6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮通过肽间隔区与羧甲基葡聚糖经多元醇化后得到的多糖衍生物结合形成的上述DDS化合物，其安全性和药效范围随作为药物载体的大分子载体部分的分子量、羧甲基化度以及上述药物化合物残基的导入量的变化而发生较大变动。因此，希望在上述DDS化合物中选择具有高安全性和宽药效范围的特定DDS化合物。
本发明者们在制造羧甲基葡聚糖多元醇时，遇到了下述问题即制造葡聚糖多元醇时由于放热而发生大分子载体分子量的降低，而且在使葡聚糖多元醇羧甲基化时由于放热而不能充分控制羧甲基化度，无法制造具有一定品质的大分子载体。另外，在使上述药物化合物与肽间隔区结合的步骤、以及使药物化合物经由肽间隔区与大分子载体结合的步骤中，由于使用现有方法就必需进行目标物质的分离、提纯，操作烦杂，因而存在目标物质的收率低，无法提供具有良好品质的产品的问题，迫切需要解决这些问题。
本发明者们为解决上述课题进行了深入的研究，从上述DDS化合物中成功地选择了具有高安全性和宽药效范围的化合物。更具体地说，通过使作为药物载体的大分子载体部分的分子量、羧甲基化度以及上述药物化合物残基的导入量最佳化，发现了满足特定条件的化合物具有高安全性和宽药效范围。另外，发现在制造上述特定DDS化合物时，通过选择用于控制反应温度的手段、用于监测反应进行的手段以及反应试剂等，能够以一定品质并且有效地制造目标DDS化合物。本发明在上述基础上得以完成。
即，本发明提供具有下述特征的DDS化合物在(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3’，4’6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮的1-位氨基与羧甲基葡聚糖多元醇的羧基通过含1个氨基酸或2-8个由肽键连接的氨基酸的间隔区结合形成的DDS化合物中，(1)(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3’，4’6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮的残基导入量相对于DDS化合物总重量为3.2-8.4％重量，(2)上述羧甲基葡聚糖多元醇的普鲁兰标准重均分子量为240,000-480,000，并且(3)上述羧甲基葡聚糖多元醇的羧甲基化度为0.23-0.47。
另外，本发明还可提供具有下述特征的DDS化合物在(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3’，4’6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮的1-位氨基与羧甲基葡聚糖多元醇的羧基通过含1个氨基酸或2-8个由肽键连接的氨基酸的间隔区结合形成的DDS化合物中，(1)(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3’，4’6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮的残基导入量相对于DDS化合物总重量为3.2-8.4％重量，(2)上述羧甲基葡聚糖多元醇的普鲁兰标准重均分子量为240,000-480,000，并且(3)上述羧甲基葡聚糖多元醇的羧甲基化度为0.14-0.47。本发明还提供这样的上述DDS化合物即对于这些DDS化合物，用经分解法或NMR法测定标准物质得到的校准曲线，通过毛细管电泳法测定了上述羧甲基葡聚糖多元醇的羧甲基化度。
进而，本发明提供含有上述DDS化合物的药物和含有上述DDS化合物的抗肿瘤剂，以及上述DDS化合物用于制造上述药物的应用和恶性肿瘤治疗方法，该方法包含将治疗有效量的上述DDS化合物给予包括人在内的哺乳动物的步骤。
从其它角度出发，本发明可提供上述DDS化合物的制造方法。本发明的方法为上述DDS化合物的制造方法，包含1个或1个以上选自下列的步骤(A)在4℃±2℃的温度，向含有葡聚糖的水溶液中添加含有高碘酸钠的水溶液，以氧化葡聚糖，然后在不超过15℃的温度下，将所得反应溶液加入到含有硼氢化钠的水溶液中，得到葡聚糖多元醇的步骤；(B)使一氯乙酸钠与葡聚糖多元醇反应制造羧甲基葡聚糖多元醇的步骤，其特征在于通过毛细管电泳法确定羧甲基化的反应终点；(C)(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3’，4’6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮的1-位氨基与其中α-氨基被叔丁氧基羰基保护的1个氨基酸的α-羧基或者其中N末端被叔丁氧基羰基保护的2-8个氨基酸所构成的寡肽的C末端羧基缩合的步骤，其特征在于用1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺或其盐作缩合剂；以及(D)羧甲基葡聚糖多元醇与下述脱保护化合物缩合的步骤(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3’，4’6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮的1-位氨基与其中α-氨基被叔丁氧基羰基保护的1个氨基酸的α-羧基或者其中N末端被叔丁氧基羰基保护的2-8个氨基酸所构成的寡肽的C末端羧基缩合形成缩合物，从该缩合物中除去叔丁氧基羰基得到所述脱保护化合物，本步骤的特征在于用1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺或其盐作缩合剂。
本发明的优选方法包含选自上述(A)-(D)步骤的至少2个步骤，更优选的方法包含选自上述(A)-(D)步骤的至少3个步骤，特别优选的方法包含选自上述(A)-(D)步骤的所有步骤。另外，提供下述操作作为优选方式即通过高效液相色谱法确定步骤(D)中缩合反应的终点。
另外，本发明提供用于制造上述DDS化合物的羧甲基葡聚糖多元醇，其普鲁兰标准重均分子量为240,000-480,000、羧甲基化度为0.23-0.47；用于制造上述DDS化合物的羧甲基葡聚糖多元醇，其普鲁兰标准重均分子量为240,000-480,000、羧甲基化度为0.14-0.47；以及上述羧甲基葡聚糖多元醇，其羧甲基化度是用经分解法或NMR法得到的校准曲线通过毛细管电泳法测定的羧甲基化度。
另外，本发明提供上述羧甲基葡聚糖多元醇用于制造上述DDS化合物的应用方法。
进而，提供上述羧甲基葡聚糖多元醇的制造方法，该方法包括下述步骤(A)在4℃±2℃的温度，向含有葡聚糖的水溶液中添加含有高碘酸钠的水溶液，以氧化葡聚糖，然后在不超过15℃的温度下，将所得反应溶液加入到含有硼氢化钠的水溶液中，得到葡聚糖多元醇的步骤；和
(B)使一氯乙酸钠与上述步骤(A)中所得的葡聚糖多元醇反应制造羧甲基葡聚糖多元醇的步骤，其特征在于通过毛细管电泳法确定羧甲基化的反应终点。
本发明的DDS化合物的特征在于在(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3’，4’6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮(以下，在本说明书中有时称为“药物化合物”)的1-位氨基与羧甲基葡聚糖多元醇的羧基通过含1个氨基酸或2-8个经肽键连接的氨基酸的间隔区结合形成的DDS化合物中，(1)上述药物化合物的残基导入量相对于DDS化合物总重量为3.2-8.4％重量，优选为5.6-7.6％重量，(2)上述羧甲基葡聚糖多元醇的普鲁兰标准重均分子量为240,000-480,000，并且(3)上述羧甲基葡聚糖多元醇的羧甲基化度为0.23-0.47。
另外，本发明提供的其它DDS化合物的特征在于在(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3’，4’6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮(以下，在本说明书中有时称为“药物化合物”)的1-位氨基与羧甲基葡聚糖多元醇的羧基通过含1个氨基酸或2-8个经肽键连接的氨基酸的间隔区结合形成的DDS化合物中，(1)上述药物化合物的残基导入量相对于DDS化合物总重量为3.2-8.4％重量，优选为5.6-7.6％重量，(2)上述羧甲基葡聚糖多元醇的普鲁兰标准重均分子量为240,000-480,000，并且
(3)上述羧甲基葡聚糖多元醇的羧甲基化度为0.14-0.47。
本说明书中，用“-”表示的数值范围包括上限和下限的数值。
国际公开WO 97/46260中公开了(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3’，4’6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮的1-位氨基与羧甲基葡聚糖多元醇的羧基通过含1个氨基酸或2-8个经肽键连接的氨基酸的间隔区结合形成的药物复合体，但是并未公开上述的特定DDS化合物。
本发明的DDS化合物中，作为药物载体发挥作用的羧甲基葡聚糖多元醇的重均分子量为240,000-480,000。羧甲基葡聚糖多元醇的普鲁兰标准重均分子量可以通过本领域技术人员众所周知的方法进行测定，例如可以按照凝胶过滤色谱法以普鲁兰作标准进行测定。作为标准的普鲁兰可以从Shodex社等公司购得。此外，羧甲基葡聚糖多元醇的羧甲基化度范围为0.14-0.47或0.23-0.47。
羧甲基葡聚糖多元醇的羧甲基化度可以根据本领域人员众所周知的方法进行测定，例如可以通过毛细管电泳法进行测定。用毛细管电泳法测定羧甲基葡聚糖多元醇的羧甲基化度时，可以使用用标准物质得到的校准曲线。可以配制羧甲基导入量不同的多种羧甲基葡聚糖多元醇用作标准物质。校准曲线可以通过例如分解法或NMR法中的任一种方法获得，但是有时对于相同的标准物质用分解法和NMR法会得到不同的羧甲基化度测定值。一般而言，由NMR法得到的羧甲基化度的测定值有比由分解法得到的测定值低0.09左右的倾向。因而，当使用由NMR法制作的校准曲线时，羧甲基化度最好为0.14-0.38。
在分解法中，对由羧甲基葡聚糖多元醇的酸解而分别定量生成的甘油(Glr)、乙醇醛(GA)、羧甲基甘油(CM-Glr)和羧甲基乙醇醛(CM-GA)进行定量。水解物中的甘油可以在碱性条件下通过高效液相色谱法直接进行定量；乙醇醛可以在与作为醛标记试剂的丹磺酰肼反应后，反应生成物通过高效液相色谱法定量。而关于羧甲基甘油和羧甲基乙醇醛，则是在使羧甲基乙醇醛的醛还原转换为羧甲基乙二醇(CM-EG)后，分别与羧酸的荧光标记试剂9-蒽基重氮甲烷反应，反应生成物通过高效液相色谱法定量。羧甲基化度可以通过下式进行计算CM-Glr/(Glr+CM-Glr)+CM-EG/(GA+CM-EG)。
NMR法中，用羧甲基导入量不同的多种羧甲基葡聚糖多元醇作标准物质，测定其13C-NMR。算出各标准物质的羧甲基葡聚糖多元醇的C-1位和C-5位、以及羧甲基结合于侧链部分的C-1位和C-5位这4种信号的面积强度，通过羧甲基结合于侧链部分的C-1位和C-5位的面积强度在C-1位和C-5位的面积强度总和中所占的比例求出各羧甲基葡聚糖多元醇的羧甲基化度。
构成本发明DDS化合物的间隔区可以用包含1个氨基酸残基的间隔区或者包含寡肽残基的间隔区，其中所述寡肽含有经肽键连接的2-8个氨基酸残基。该间隔区有1个氨基酸残基(意指从氨基酸的氨基和羧基分别除去1个氢原子和1个羟基后的残基)、或者含有经肽键连接的2-8个氨基酸残基的寡肽残基(意指从N末端的氨基和C末端的羧基分别除去1个氢原子和1个羟基后的残基)的形态，由C末端(在包含1个氨基酸的间隔区的情况下为α-羧基)与(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3’，4’6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮的1位氨基通过肽键结合。
优选的间隔区为包含由2-6个氨基酸残基构成的寡肽残基的间隔区。对构成间隔区的氨基酸种类没有特别限制，可以使用例如L-或D-氨基酸，优选L-氨基酸，除α-氨基酸外，还可以使用β-丙氨酸、ε-氨基己酸、γ-氨基丁酸等。优选将这些α-氨基酸以外的氨基酸配置在间隔区中接近药物载体的位置。
当使用包含寡肽残基的间隔区时，对氨基酸序列没有特别限制，例如间隔区可以是由-X-Z-表示的二肽残基(X表示疏水性氨基酸残基，Z表示亲水性氨基酸残基，-X-Z-表示从二肽的N末端氨基和C末端羧基分别除去1个氢原子和1个羟基后的残基，所述二肽由疏水性氨基酸(X)和亲水性氨基酸(Z)各自的N末端侧和C末端侧经肽键结合形成)，或者可以适当使用包含该二肽残基作为部分肽序列的间隔区。疏水性氨基酸可以用例如苯基丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸等，亲水性氨基酸可以使用甘氨酸、丙氨酸等。间隔区可以具有这样的二肽残基的重复序列(例如-X-Z-X-Z-、-X-Z-X-Z-X-Z-等)。
如果使用含有这种二肽结构的间隔区，则间隔区可在被认为具有丰富肽酶的肿瘤部位、炎症部位水解，在该部位短时间内释放出高浓度的药物化合物，因而由含有上述二肽的间隔区与药物化合物结合形成的部分构造是本发明DDS化合物的优选部分构造。
可用作间隔区的寡肽残基的具体例子表示在下表中，但可用于本发明DDS化合物的间隔区并不限于这些物质，不言而喻，本领域技术人员可适当选择间隔区的种类，以使药物化合物具有最佳的释放速度(肽序列的左侧为N末端，C末端(在包含1个氨基酸的间隔区的情况下为α-羧基)经肽键与(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3’，4’6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮的1-位氨基结合)。D-Phe表示D-苯基丙氨酸残基，其它氨基酸表示L-氨基酸。释放速度的大小根据结合了多柔比星的DDS化合物对于Walker 256带癌大鼠的药效显示程度、或者在Walker 256带癌大鼠的肿瘤部位释放的多柔比星浓度进行判定。)。其中，特别优选用-Gly-Gly-Phe-Gly-作为本发明的DDS化合物的间隔区。
(a)释放速度大的间隔区-Leu-Gly--Tyr-Gly--Phe-Gly--Gly-Phe-Gly--Gly-Gly-Phe-Gly--Gly-Phe-Gly-Gly--Phe-Gly-Gly-Gly--Phe-Phe-Gly-Gly--Gly-Gly-Gly-Phe-Gly-(b)释放速度比较大的间隔区-Gly-Gly-Phe-Phe--Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-(c)释放速度比较小的间隔区-Phe-Phe--Ala-Gly--Pro-Gly--Gly-Gly-Gly-Phe-
(d)释放速度小的间隔区-Gly--D-Phe-Gly--Gly-Phe--Ser-Gly--Gly-Gly--Gly-Gly-Gly--Gly-Gly-Gly-Gly-(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3’，4’6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮可以通过特开平5-59061号公报中记载的方法合成。本发明DDS化合物中上述药物化合物的残基导入量相对于DDS化合物重量为3.2-8.4％重量，优选5.6-7.6％重量。本领域人员可以通过例如吸光度分析容易地确定上述药物化合物的导入量。
本发明的DDS化合物可以用作在肿瘤部位特定显示所需抗肿瘤活性，并且具有高安全性的抗肿瘤剂。含有本发明DDS化合物的药物通常可以以冷冻干燥品的形态填充到管形瓶中，作为用时溶解型的注射用或点滴用制剂等非经口给药制剂用于临床应用，本发明药物的剂型不限于上述剂型。制造上述制剂时，可以使用例如助溶剂、pH调节剂、稳定剂等可在本领域使用的制剂用添加剂。对本发明药物的给药量没有特别限定，但1日1m2体表面积以大约1-500mg左右，优选以约10-100mg的范围1日给药1次，优选每3-4周重复。
对本发明DDS化合物的制造方法没有特别限定，可以通过本发明所提供的上述制造方法适当进行制造。本发明的方法包含上述步骤(a)到(D)中的任何1个步骤或至少2个步骤相结合，最优选包含(A)到(D)的所有步骤。下面对本发明的最优选方式，即包含(A)到(D)的所有步骤的方法进行说明，但本发明范围并不限于这一优选方式。
本发明的优选方法包含下述步骤(A)在4℃±2℃的温度，向含有葡聚糖的水溶液中添加含有高碘酸钠的水溶液，以氧化葡聚糖，然后在不超过15℃的温度下，将所得反应溶液加入到含有硼氢化钠的水溶液中，得到葡聚糖多元醇的步骤；(B)使一氯乙酸钠与上述步骤(A)中所得的葡聚糖多元醇反应制造羧甲基葡聚糖多元醇的步骤，其特征在于通过毛细管电泳法确定羧甲基化的反应终点；(C)(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3’，4’6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮的1-位氨基与其中α-氨基被叔丁氧基羰基保护的1个氨基酸的α-羧基或者其中N末端被叔丁氧基羰基保护的2-8个氨基酸所构成的寡肽的C末端羧基缩合的步骤，其特征在于用1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺或其盐作缩合剂；以及(D)从上述步骤(C)所得的缩合物中除去叔丁氧基羰基而得到的脱保护化合物与上述步骤(B)所得的羧甲基葡聚糖多元醇进行缩合的步骤，其特征在于用1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺或其盐作缩合剂。
步骤(A)是由葡聚糖得到葡聚糖多元醇的步骤。对原料葡聚糖的种类没有特别限定，可以任意含有α-D-1，6-键。例如，可以使用α-D-1，6-键的比例为等于或大于85％、等于或大于90％、或者等于或大于95％的葡聚糖等。用作原料的葡聚糖优选葡聚糖T500(Pharmacia公司制造)等分子量为500,000左右的物质。对所得葡聚糖多元醇的多元醇化度没有特别限定，优选在实质上可以完全多元醇化的条件下处理葡聚糖。
上述使用高碘酸钠的氧化反应，有时由于反应时的温度上升会使葡聚糖多元醇的分子量降低，而本发明方法的特征就在于为了抑制所述分子量降低，是在4℃±2℃的温度，向含有葡聚糖的水溶液中添加含有高碘酸钠的水溶液。含有葡聚糖的水溶液可以含有例如缓冲剂。添加含高碘酸钠的水溶液时，最好控制添加速度，使反应温度不上升，为了避免部分温度上升，最好进行适当搅拌。反应从几天到20天左右，通常10天左右完成。反应溶液中的葡聚糖浓度为例如几克至100克左右/升反应溶液，优选10克左右/升反应溶液。
反应结束后，根据需要向所得反应溶液中加入乙二醇等，以消耗掉过量的过酸，再根据需要将反应溶液的pH调节至中性附近(例如pH6.5左右)，然后在不超过15℃的温度下，将该反应溶液添加到含有硼氢化钠的水溶液中进行还原。进行还原反应时，有时由于反应时温度上升会导致葡聚糖多元醇的分子量降低，而本发明的方法，其特征就在于为了抑制所述分子量降低，将上述氧化反应的反应溶液在不超过15℃的温度下添加到含有硼氢化钠的水溶液中。最好控制添加速度，使反应溶液的温度不上升，为了避免部分温度上升，最好进行适当的搅拌。通常在添加后通过将反应混合物维持在冰冷却温度下，使反应在几小时至几天，优选1天左右完成。
最好从所得反应溶液中分离具有所需分子量的葡聚糖多元醇，作为后续步骤(B)的原料使用。例如，最好用超滤膜除去低分子量和高分子量的部分，进而根据需要也可附加实施脱盐和浓缩等步骤。脱盐和浓缩也可以用超滤膜来进行。
步骤(B)是将上述步骤(A)所得的葡聚糖多元醇进行羧甲基化，制造重均分子量(普鲁兰标准)为240,000-480,000的羧甲基葡聚糖多元醇的步骤。葡聚糖多元醇的羧甲基化可以通过例如使氯乙酸、溴乙酸等卤代乙酸或其盐，优选一氯乙酸的钠盐与葡聚糖多元醇的羟基反应，使葡聚糖多元醇的羟基部分羧甲基化来进行。例如，可将葡聚糖多元醇溶解在不参与反应的惰性溶剂(例如水、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜等)中，在碱(例如氢氧化钠、氢氧化钾等)的存在下，添加卤代乙酸或卤代乙酸的盐，使其在冰冷却至100℃的温度范围内，反应几分钟至几天。优选可使其在20℃反应几小时至1天左右。最好在反应后，用超滤膜除去低分子量和高分子量的部分，进而根据需要可以附加使用超滤膜的脱盐和浓缩等步骤。
羧甲基葡聚糖多元醇的羧甲基化度可以通过羧甲基化的反应温度、用作试剂的卤代乙酸或其盐的添加量等在一定程度上进行控制，但在本发明的方法中，为了更严密地将羧甲基化程度控制在0.14-0.47或0.23-0.47的范围内，通过毛细管电泳法确定羧甲基化的反应终点，这是本发明方法的特征所在。
毛细管电泳法(capillary electrophoresis，CE)通常是在内径不超过100μm的熔融石英制造的毛细管内进行电泳的方法(参照例如马场嘉信，ぶんせき(分析)，342，1995等)。毛细管电泳有毛细管区带电泳(CZE)、动电色谱法(EKC)、毛细管凝胶电泳(CGE)等多种分离模式，本发明方法可以使用这些分离模式中的任何一种。优选可以使用毛细管区带电泳，可以在毛细管内装满磷酸、柠檬酸、硼酸等的缓冲液进行分离。通过该方法可以正确测定每单位分子量的电荷，能够在短时间内并且高灵敏地测定上述反应溶液中试料的羧甲基化度。本说明书的实施例具体阐述了该方法的细节，本领域人员能够参照上述出版物的一般说明以及其它出版物，按照本说明书的实施例中所记载的具体方法，通过根据需要对其进行适当修正乃至改变，容易并且正确地确定羧甲基化的反应终点(羧甲基化度为0.14-0.47或0.23-0.47)。
如先前已经说明的那样，当通过毛细管电泳法测定羧甲基葡聚糖多元醇的羧甲基化度时，可以采用由标准物质得到的校准曲线。校准曲线可以由例如分解法或NMR法的任一种方法得到，但是有时对于相同的标准物质用分解法和NMR法会得到不同的羧甲基化度测定值。一般而言，由NMR法得到的羧甲基化度的测定值有比由分解法得到的测定值低0.09左右的倾向。因而，当使用由NMR法制作的校准曲线时，羧甲基化度最好为0.14-0.38。
步骤(C)是使(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3’，4’6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮的1-位氨基与用作间隔区的寡肽的C末端羧基(在用1个氨基酸的情况下为α-羧基)缩合的步骤。用作间隔区的上述寡肽或氨基酸为了供给该反应使用，需要分别将N末端氨基或α-氨基用叔丁氧基羰基保护起来，其方法是本领域人员熟知并通常使用的。
本发明方法在特征在于在进行上述缩合反应时，用1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EPCI)或其盐作缩合剂，优选用1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐作缩合剂。与使用N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)之类的N，N’-二环烷基碳二亚胺类作缩合剂的情况相比，使用上述缩合剂能够简化反应操作，能使反应时间大幅缩短。更具体地说，可以避免除去缩合剂的离心分离和过柱操作，反应时间也可缩短至使用DCC时的大约1/5左右。基质浓度与使用DCC时相比也可增加大约5倍。特别是在工业化的大规模合成体系中，可通过削减试剂、缩短时间而大幅度降低成本。
上述反应除了可以使用EPCI或其盐作缩合剂外，还可以与使用通常的缩合剂来形成肽键的缩合反应一样进行。可以使用相对于上述药物化合物为1-1.5当量左右的叔丁氧基羰基化氨基酸或叔丁氧基羰基化寡肽，在二甲基甲酰胺等惰性溶剂中进行反应。反应通常于室温下进行几小时至1天左右，优选于室温下在3小时左右结束。对反应溶液中的药物化合物浓度没有特别限定，通常为50-200克/升左右，优选为100-150克/升左右。
步骤(D)是从上述步骤(C)所得的缩合物中除去叔丁氧基羰基而得到的脱保护化合物与上述步骤(B)所得的羧甲基葡聚糖多元醇进行缩合的步骤。除去叔丁氧基羰基的方法是本领域人员众所周知并且惯常使用的，优选例如用三氟乙酸进行处理的方法。提纯脱保护化合物时，可以通过例如用异丙醚等洗涤来进行。
本发明方法的特征在于在使结合了药物化合物的间隔区的N末端氨基(在将1个氨基酸用作间隔区的情况下为α-氨基酸)与羧甲基葡聚糖多元醇的羧基结合时，用1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EPCI)或其盐作缩合剂，优选用1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐作缩合剂。与使用N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)之类的N，N’-二环烷基碳二亚胺类作缩合剂的情况相比，使用上述缩合剂能够避免除去缩合剂的离心分离和柱操作，可大幅缩短反应时间，在工业化的大规模合成体系中，可大幅度降低成本。上述反应的终点可以通过HPLC确定。
上述反应除了可以使用EPCI作缩合剂外，还可以与使用通常的缩合剂来形成肽键的缩合反应一样进行。相对于1重量份羧甲基葡聚糖多元醇，可以使用0.1-0.2重量份左右的结合了药物化合物的氨基酸或寡肽，在含水甲醇等惰性溶剂中进行反应。反应通常于室温下在几小时至1天左右，优选于室温下在2-3小时左右完成。
本说明书中的实施例给出了本发明方法的具体例子，本领域人员能够参照上述的一般说明和实施例的具体说明，根据需要进行适当修正乃至改变，实施本发明的方法。另外，不言而喻，本领域人员可以在本发明范围内适当选择反应温度、反应时间、试剂浓度等。
含有本发明DDS化合物的药物通常可以以冷冻干燥品的形态填充到小瓶中，以用时溶解型的注射用或点滴用制剂等非经口给药制剂形态，作为治疗肿瘤的药物应用于临床应用。关于本发明的DDS化合物作为肿瘤治疗药物的应用，国际公开WO 97/46260号的公开作为参照包含在本说明书的公开中。但本发明药物的剂型不限于上述剂型，制造上述制剂时，可以使用例如助溶剂、pH调节剂、稳定剂等可在本领域使用的制剂用添加剂。对上述药物的给药量没有特别限定，通常1日1m2体表面积以大约0.1-100mg左右，优选以约1-30mg的范围非经口1次给药，优选每3-4周重复给药。实施例下面，通过实施例对本发明进行更具体的说明，但本发明的范围并不限于下述实施例。另外，实施例中，有时将(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3’，4’6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮称作“药物化合物”，“Gly-Gly-Phe-Gly”表示甘氨酰基-甘氨酰基-苯基丙氨酰基-甘氨酸或其残基。试验例中所用的DDS化合物为上述药物化合物与羧甲基葡聚糖多元醇通过四肽间隔区(Gly-Gly-Phe-Gly)结合形成的DDS化合物，并且经过配制使其具有羧甲基化度和分子量不同的不同大分子载体。实施例1葡聚糖多元醇(Dex-PA)的合成 将葡聚糖-T500(Pharmacia公司制造，300g)溶解在pH调节至5.5的0.2M乙酸缓冲液(15l)中，将NaIO4(990g)溶解在纯水(15l)中，在低温室(约4℃)放置一夜。次日，将NaIO4溶液(3.5℃)缓缓注入葡聚糖-T500的溶液(3.5℃)中，使温度不致上升(不超过7.0℃)，注入后不经其它处理即在低温室内搅拌(100rpm)。搅拌10天后，加入乙二醇(210ml)，搅拌2小时，用Peroxid试纸确认过酸消失后，用10％NaOH将反应溶液调节至pH6.5。接着将该反应溶液在冰冷却下滴加到NaBH4溶液(420g，12l)中。此时，使体系内温度不超过15℃，在3小时内滴加。之后将反应混合物在低温室搅拌一夜，次日用乙酸将pH调节至5.5后，再搅拌1小时，用10％NaOH将pH调节至7.0。将所得反应溶液用Paul Filtron的超滤膜(1000k)进行处理，除去微粒和大分子部分。再用Millipore超滤膜(50k)进行脱盐(使用90-100l左右纯水)和浓缩，在用HPLC进行监测的同时浓缩至1997ml。取其中一部分(1ml×3)作为试样，冷冻干燥后为60.1mg，算出产量为120g。实施例2羧甲基葡聚糖多元醇(CM-Dex-PA)的合成 (A)羧甲基葡聚糖多元醇(CM-Dex-PA)的合成将NaOH(193g)溶解在纯水(1537ml)中，将液温保持在25℃，加入葡聚糖多元醇水溶液，将体系内温度保持在25℃同时进行搅拌。向该混合物中缓缓加入一氯乙酸钠，在相同温度下搅拌15小时。通过毛细管电泳法确认反应的终点后，用乙酸将pH值调节至8.0左右，进行超滤。最初用1000k的膜除去大分子，然后用50k的膜除去低分子化合物(试剂和盐)，浓缩。在此期间随时通过HPLC掌握低分子化合物的除去情况，确认低分子化合物大致被除去后，结束超滤。将羧甲基葡聚糖多元醇溶液浓缩至3770ml，其1ml冷冻干燥后为32.1mg，因而算出产量为121g。
(B)通过毛细管电泳法测定羧甲基化度-之1毛细管电泳用光电二极管阵列190nm-300nm(检测195nm)作检测器，用熔融石英制的内径75μm、有效长度500mm、全长670mm的管作毛细管，用20mM四硼酸钠水溶液作电泳液。将试料用0.02％叠氮化钠水溶液配制成2mg/ml。用反应时间19小时、19.5小时和20小时的三批作试料。校准曲线用通过分解法确定羧甲基化度为0.22、0.42和0.62的三种羧甲基葡聚糖多元醇作为标准物质制作而成。各自的保留时间(分钟)为4.496、5.442和6.600。试料的保留时间(分钟)为5.325、5.400和5.446。从该结果可得出各试料的羧甲基化度为0.38、0.40和0.41。实施例3叔丁氧基羰基(Boc)-Gly-Gly-Phe-Gly-药物化合物A的合成 使药物化合物A·甲磺酸盐(80g)与叔丁氧基羰基-Gly-Gly-Phe-Gly-OH(68g)悬浮于N，N-二甲基甲酰胺(1200ml)中。在冰冷却搅拌条件下，加入三乙胺(48ml)、1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EPCI·HCl，29.6g)、羟基苯并三唑(HBT，20.8g)，在室温下搅拌。通过HPLC确认反应的终点后，在冰冷却搅拌条件下，30分钟内，向反应溶液中滴加水(800ml)，使内部温度保持在20℃或20℃以下，析出结晶。之后再滴加水(1200ml)。接下来用乙酸将溶液的pH值调节至7。将析出的固体过滤水洗，将所得结晶减压干燥，得到标题化合物(120.4g，定量)。1H-NMR(DMSO-d6/TMS)δ(ppm)0.97(3H，m)，1.11(2H，d，J＝6.3Hz)，1.41(9H，s)，1.91(2H，m)，2.05(1H，m)，2.33(4H，m)，2.95-3.10(4H，m)，3.58-3.72(2H，m)，3.8(1H，m)，4.03(1H，m)，4.34(1H，m)，4.74(1H，m)，5.13(1H，m)，5.33(1H，m)，5.58(2H，m)，7.18(5H，m)，7.49(2H，m)实施例4H-Gly-Gly-Phe-Gly-药物化合物A·三氟乙酸盐的合成 在冰冷却下，向上述实施例3中得到的叔丁氧基羰基-Gly-Gly-Phe-Gly-药物化合物A(120g)中滴加三氟乙酸(360ml)。叔丁氧基羰基-Gly-Gly-Phe-Gly-药物化合物A完全溶解后，通过HPLC确认脱叔丁氧基羰基反应的完成。向该反应溶液中滴加甲醇(360ml)和异丙醚(720ml)，使内部温度保持在0℃-15℃之间。过滤析出的结晶，用乙酸乙酯(500ml)洗涤3次，将所得结晶在不超过50℃的内部温度下溶解于20％含水甲醇(400ml)中，之后依次加入乙酸乙酯(400ml)和异丙醚(800ml)进行再结晶。将该结晶过滤并溶解于含水甲醇(400ml)中，加入活性炭(4.4g)进行脱色处理。过滤上述溶液，在不超过55℃的温度下，向滤液中加入乙酸乙酯(400ml)，然后加入异丙醚(800ml)，再结晶。将过滤后的结晶减压干燥，得到H-Gly-Gly-Phe-Gly-药物化合物A(111.8g，由药物化合物A换算为90％)。1H-NMR(DMSO-d6/TMS)δ(ppm)0.87(3H，m)，1.87(2H，m)，2.17(2H，m)，2.37(3H，m)，2.74(1H，m)，3.00(1H，m)，3.16(1H，m)，3.58(2H，s)，3.65-3.91(4H，m)，4.48(1H，m)，5.2(2H，s)，5.39(2H，m)，5.58(1H，m)，6.53(1H，s)，7.21(5H，m)，7.75(1H，d，J＝10.9Hz)，8.06(2H，s)，8.28(1H，d，J＝8.2Hz)，8.49(1H，m)，8.52(1H，m)实施例5本发明的DDS化合物的合成 向含有羧甲基葡聚糖多元醇(800g)的水溶液中加入纯水，使其与羧甲基葡聚糖多元醇水溶液部分合并达到32L，再加入甲醇(60L)。向该混合液中加入溶解了实施例4中所得的H-Gly-Gly-Phe-Gly-药物化合物A(133g)和羟基苯并三唑(23.4g)的20％含水甲醇(4l)。加入1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(33.1g)，用1N NaOH将pH值调节至6.8-7.2。使该混合物在室温(23℃±5℃)反应2-3小时。再添加1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(8.1g)，用1N HCl将pH值调节至6.8-7.2，使其继续反应2-3小时左右。再添加1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(5.6g)，用1N HCl将pH值调节至6.8-7.2，使其继续反应1小时左右。反应结束后，用1N NaOH将反应溶液的pH值调节至8.7-9.2，保存在10℃或10℃以下。之后，通过超滤膜(50k)将溶液脱盐和浓缩。接着用膜滤器进行微孔过滤，将所得溶液冷冻干燥，得到本发明的DDS化合物(880g)。实施例6反应温度对葡聚糖多元醇分子量降低的影响(氧化反应)以基质浓度1％、20g的规模按照实施例1进行葡聚糖的氧化反应。反应温度设定为4、8、12、15℃，测定改变反应时间时产物在凝胶过滤色谱法中的保留时间。如表1所示，反应温度为12℃和15℃时，在第六日可确认由分子量降低所引起的明显的保留时间延迟。在8℃时，在第10日可确认明显的保留时间延迟。
表1反应温度/时间 3天6天 10天4℃ 10.46分钟 10.44分钟 10.53分钟8℃ 10.52分钟 10.63分钟 10.83分钟12℃10.45分钟 10.63分钟 -15℃10.59分钟 10.92分钟 -实施例7反应温度对葡聚糖多元醇分子量降低的影响(氧化反应)在实施例6所得结果的基础上，将温度范围进一步详细设定(4℃、1℃、6.5℃)，进行同样的实验。如表2所示，在所有温度范围内，不发生分子量的降低，进行了反应，但是在1℃进行反应时，反应体系中的盐析出变多。从上述结果可判断，该反应温度的安全范围为2-6℃。
表2反应温度/时间 3天 6天10天4℃10.40分钟 10.39分钟 10.49分钟1℃10.42分钟 10.39分钟 10.45分钟6.5℃ 10.40分钟 10.36分钟 10.39分钟实施例8反应温度对葡聚糖多元醇分子量降低的影响(还原反应)按照实施例1，在葡聚糖的氧化反应后接着进行还原反应。反应温度设定为10、15、20、30℃，使其反应12-24小时后，测定产物在凝胶过滤色谱法中的保留时间。如表3所示，当反应温度超过15℃时，可明显确认分子量的降低。
表3反应温度 通过凝胶过滤色谱法进行判定10℃无分子量降低15℃有一些分子量降低20℃分子量降低30℃显著的分子量降低实施例9由羧甲基化度测定方法不同而引起的DDS化合物的羧甲基化度的测定值变动用3种羧甲基葡聚糖多元醇作为标准物质通过分解法和NMR法制作校准曲线。用该校准曲线与实施例2(B)一样测定DDS化合物(3批)的羧甲基化度。结果如下所示。用经NMR得到的校准曲线所得到的任何一批的羧甲基化度测定值都比通过分解法所得到的测定值减少了0.09。
表4标准物质(羧甲基葡聚糖多元醇)的羧甲基化度
表5 DDS化合物的羧甲基化度
下面给出试验例，试验例中所示的羧甲基化度是通过分解法得到的值。试验例1(A)方法使6周龄的雄性BALB/c小鼠(日本SLC株式会社)自由摄取市售的饲料和水，经过1周驯养后用作试验用动物。肿瘤细胞是用小鼠肿瘤细胞Meth A纤维肉瘤在同系小鼠BALB/c的腹腔内每周进行继代培养。用内毒素浓度不超过50pg/ml的Hanks’培养基(HBSS，Gibco-BRL)从小鼠的腹腔内采集肿瘤细胞，经几次离心操作(约600rpm，5-10分钟，4℃)进行洗涤后，悬浮于HBSS培养基中，按1×106/0.1ml/小鼠的比例移植于小鼠的腹腔内。
抗肿瘤试验中，以1×106/0.1ml/小鼠的比例将Meth A细胞皮下移植于小鼠的右腹股沟处(0天)，在移植后的第7或12天，用游标卡尺测量肿瘤的长径(L)和短径(W)，算出推定肿瘤重量(ETW＝L×W2/2mg)，将小鼠以6或7只进行分组，使推定肿瘤重量的组平均为100mg，将试样以单次或每四日四次的用法进行静脉内给予。将小鼠在肿瘤移植后的第21或26天通过颈椎脱臼杀死，取出肿瘤，测定其重量。用公式IR＝(1-TWt/TWc)×100(％)(TWt、TWc分别为试样给予组和对照组的平均肿瘤重量)由肿瘤重量值算出肿瘤增殖抑制效果(IR)。IR等于或大于58％时判断为具有抗肿瘤效果。通过Dunnet法进行对照组与试样给予组之间的肿瘤重量的显著性检验。
进而，为了评价试样的副作用，将体重减少率(BWL)和因毒性而死的小鼠数与所用小鼠数的比(D/U)设定为毒性参数。通过公式BWL＝(1-BWn/BWs)×100(％)由开始给予时的小鼠平均体重(BWs)和第n天的小鼠平均体重(BWn)算出BWL。该BWL的最大值设为BWLmax。只是，当与开始给予日比较无法确认体重减少时，将BWLmax表示为0以下(＜0)。另外，将试样溶解于日本药典注射用生理盐水，以10或20ml/kg的给予溶液量进行静脉内给予。
(B)结果将羧甲基葡聚糖多元醇分子量为48,000-457,000的DDS化合物(羧甲基化度0.37-0.46、药物导入量4.6-6.4％重量)经单次给予进行试验，当羧甲基葡聚糖多元醇的分子量为200,000-300,000时，以低用量可确认稳定的不低于58％的有效抗肿瘤效果，而分子量不到200,000时，最小有效量则增大了。分子量不到50,000时，毒性和抗肿瘤效果减弱了，推测这是由于存在尿排泄。因此可得结论为如果羧甲基葡聚糖多元醇的分子量等于或大于200,000，则即使是低用量亦可获得稳定的抗肿瘤效果。另一方面，如果羧甲基葡聚糖多元醇的分子量超过500,000，则会因为粘性而发生对物理损坏的稳定性变差等问题。从上述结果可知DDS化合物中羧甲基葡聚糖多元醇的分子量需要在50,000-500,000的范围内，为了达到所需的抗肿瘤效果，并且制造稳定的产品，羧甲基葡聚糖多元醇的普鲁兰标准重均分子量最好在240,000-480,000范围内。试验例2将69只7周龄的BALB/c系雄性小鼠(日本SLC株式会社)驯养1周，1组5只，给予羧甲基化度不同的DDS化合物(药物导入量5.3-6.3％重量、分子量270,000-330,000)。给予时的平均体重为21.1-25.4g。将动物在设定为室温(23±2℃)、湿度(55±20％)、照明时间12小时(800-2000)的房间内关在铝制的笼子中，每只笼子关5只，使其自由摄取市售的固体饲料(F2、船桥农场制造)和含氯自来水进行饲养。将DDS化合物溶解于日本药典生理盐水中，在1.02-1.36mg/ml的浓度以1ml/kg的溶液量进行尾静脉内给予。
对动物的症状1日1次，包括给予日在内观察15日，在给予前以及给予后的第3、7、10和14日测定体重。死亡例是在发现死亡后立即解剖，而存活例则是在给予后第14日在乙醚麻醉下通过切断腹大动脉将其放血杀死，肉眼观察全身各器官。以组平均值±标准偏差算出体重数据，之后以显著水平5％进行统计学分析。结果羧甲基化度为0.38、0.43和0.47的DDS化合物的最大耐受剂量(MTD)分别为11.7、11.7和10.3mg/Kg，这表明羧甲基化度超过0.43时有毒性增强的趋势。另外，用羧甲基化度为0.53的DDS化合物进行了同样的毒性评价，在10mg/kg给予组中，6只中有3只死亡，体重减少和致死毒性显著增强。另一方面，羧甲基化度为0.23的DDS化合物的MTD与羧甲基化度为0.38的DDS化合物相同。从而可得出结论从安全性的方面考虑，优选DDS化合物的羧甲基化度在0.23-0.47范围内。试验例3与上述试验例2一样操作，用药物化合物残基导入量为3.2-15％重量的DDS化合物(羧甲基化度0.37-0.40、分子量260,000-320,000)进行了抗肿瘤试验。结果，在1.25mg/Kg给予组中，当导入量为3.2-7.3％重量时，可确认IR等于或大于80％的药效，但是当导入量超过8.4％重量(到15％重量)时，可确认药效与上述试验相比具有明显降低的趋势。另外，当导入量超过8.4％重量时，在2.5或5mg/kg给予组中，显示出了与其它复体相同的药效，但是在10mg/kg给予组中可确认致死毒性增强了。从上述结果可得出结论为了达到所需的抗肿瘤效果，提供安全性高的DDS化合物，药物化合物残基的导入量最好在3.2-8.4％重量范围内。
产业上的可利用性本发明的DDS化合物具有高安全性和宽药效范围，是临床上极为有用的抗肿瘤剂。本发明的方法能够以高品质并且有效地高收率制造上述DDS化合物，适于工业应用。
权利要求
1.DDS化合物，其中(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3’，4’6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮的1-位氨基通过含1个氨基酸或2-8个由肽键连接的氨基酸的间隔区与羧甲基葡聚糖多元醇的羧基相结合，其特征在于(1)(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3’，4’6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮的残基导入量相对于DDS化合物总重量为3.2-8.4％重量，(2)上述羧甲基葡聚糖多元醇的普鲁兰标准重均分子量为240,000-480,000，并且(3)上述羧甲基葡聚糖多元醇的羧甲基化度为0.23-0.47。
2.DDS化合物，其中(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3’，4’6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮的1-位氨基通过含1个氨基酸或2-8个由肽键连接的氨基酸的间隔区与羧甲基葡聚糖多元醇的羧基相结合，其特征在于(1)(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3’，4’6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮的残基导入量相对于DDS化合物总重量为3.2-8.4％重量，(2)上述羧甲基葡聚糖多元醇的普鲁兰标准重均分子量为240,000-480,000，并且(3)上述羧甲基葡聚糖多元醇的羧甲基化度为0.14-0.47。
3.DDS化合物，其中(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3’，4’6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮的1-位氨基通过含1个氨基酸或2-8个由肽键连接的氨基酸的间隔区与羧甲基葡聚糖多元醇的羧基相结合，其特征在于(1)(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3’，4’6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮的残基导入量相对于DDS化合物总重量为3.2-8.4％重量，(2)上述羧甲基葡聚糖多元醇的普鲁兰标准重均分子量为240,000-480,000，并且(3)上述羧甲基葡聚糖多元醇的羧甲基化度为0.14-0.38。
4.权利要求1-3中任一项的DDS化合物，其中所述(3)中的羧甲基化度是用经分解法或NMR法测定标准物质羧甲基葡聚糖多元醇得到的校准曲线，通过毛细管电泳法测定的羧甲基化度。
5.权利要求1的DDS化合物，其中所述(3)中的羧甲基化度是用经分解法测定标准物质羧甲基葡聚糖多元醇得到的校准曲线，通过毛细管电泳法测定的羧甲基化度。
6.权利要求3的DDS化合物，其中所述(3)中的羧甲基化度是用经NMR法测定标准物质羧甲基葡聚糖多元醇得到的校准曲线，通过毛细管电泳法测定的羧甲基化度。
7.含有权利要求1-6中任一项的DDS化合物的抗肿瘤剂。
8.权利要求1-6中任一项的DDS化合物的制造方法，该方法包含1个或1个以上选自下列的步骤(A)在4℃±2℃的温度，向含有葡聚糖的水溶液中添加含有高碘酸钠的水溶液，以氧化葡聚糖，然后在不超过15℃的温度下，将所得反应溶液加入到含有硼氢化钠的水溶液中，得到葡聚糖多元醇的步骤；(B)使一氯乙酸钠与葡聚糖多元醇反应制造羧甲基葡聚糖多元醇的步骤，其特征在于通过毛细管电泳法确定羧甲基化的反应终点；(C)(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3’，4’6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮的1-位氨基与其中α-氨基被叔丁氧基羰基保护的1个氨基酸的α-羧基或者其中N末端被叔丁氧基羰基保护的2-8个氨基酸所构成的寡肽的C末端羧基缩合的步骤，其特征在于用1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺或其盐作缩合剂；以及(D)羧甲基葡聚糖多元醇与下述脱保护化合物缩合的步骤(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3’，4’6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮的1-位氨基与其中α-氨基被叔丁氧基羰基保护的1个氨基酸的α-羧基或者其中N末端被叔丁氧基羰基保护的2-8个氨基酸所构成的寡肽的C末端羧基缩合形成缩合物，从该缩合物中除去叔丁氧基羰基得到所述脱保护化合物，本步骤的特征在于用1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺或其盐作缩合剂。
9.权利要求1-6中任一项的DDS化合物的制造方法，该方法包含下列步骤(A在4℃±2℃的温度，向含有葡聚糖的水溶液中添加含有高碘酸钠的水溶液，以氧化葡聚糖，然后在不超过15℃的温度下，将所得反应溶液加入到含有硼氢化钠的水溶液中，得到葡聚糖多元醇的步骤；(B)使一氯乙酸钠与上述步骤(A中所得的葡聚糖多元醇反应制造羧甲基葡聚糖多元醇的步骤，其特征在于通过毛细管电泳法确定羧甲基化的反应终点；(C)(1S，9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2，3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H，12H-苯并[de]吡喃并[3’，4’6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-10，13(9H，15H)-二酮的1-位氨基与其中α-氨基被叔丁氧基羰基保护的1个氨基酸的α-羧基或者其中N末端被叔丁氧基羰基保护的2-8个氨基酸所构成的寡肽的C末端羧基缩合的步骤，其特征在于用1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺或其盐作缩合剂；以及(D)从上述步骤(C)所得的缩合物中除去叔丁氧基羰基而得到的脱保护化合物与羧甲基葡聚糖多元醇缩合的步骤，其特征在于用1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺或其盐作缩合剂。
10.用于制造权利要求1-6中任一项的DDS化合物的羧甲基葡聚糖多元醇，其普鲁兰标准重均分子量为240,000-480,000、羧甲基化度为0.23-0.47。
11.用于制造权利要求1-6中任一项的DDS化合物的羧甲基葡聚糖多元醇，其普鲁兰标准重均分子量为240,000-480,000、羧甲基化度为0.14-0.47。
12.用于制造权利要求1-6中任一项的DDS化合物的羧甲基葡聚糖多元醇，其普鲁兰标准重均分子量为240,000-480,000、羧甲基化度为0.14-0.38。
13.权利要求10-12中任一项的羧甲基葡聚糖多元醇，其中所述羧甲基化度是用经分解法或NMR法测定标准物质羧甲基葡聚糖多元醇得到的校准曲线，通过毛细管电泳测定的羧甲基化度。
14.权利要求10的羧甲基葡聚糖多元醇，其中所述羧甲基化度是用经分解法测定标准物质羧甲基葡聚糖多元醇得到的校准曲线，通过毛细管电泳测定的羧甲基化度。
15.权利要求12的羧甲基葡聚糖多元醇，其中所述羧甲基化度是用经NMR法测定标准物质羧甲基葡聚糖多元醇得到的校准曲线，通过毛细管电泳测定的羧甲基化度。
16.权利要求10-15中任一项的羧甲基葡聚糖多元醇的制造方法，该方法包含下列步骤(A)在4℃±2℃的温度，向含有葡聚糖的水溶液中添加含有高碘酸钠的水溶液，以氧化葡聚糖，然后在不超过15℃的温度下，将所得反应溶液加入到含有硼氢化钠的水溶液中，得到葡聚糖多元醇的步骤；和(B)使一氯乙酸钠与上述步骤(A)中所得的葡聚糖多元醇反应制造羧甲基葡聚糖多元醇的步骤，其特征在于通过毛细管电泳法确定羧甲基化的反应终点。
全文摘要
DDS化合物，其中药物化合物(1S，9S)－1－氨基－9－乙基－5－氟－2，3－二氢－9－羟基－4－甲基－1H，12H－苯并[de]吡喃并[3’，4’∶6，7]吲哚嗪并[1，2－b]喹啉－10，13(9H，15H)－二酮的1－位氨基与羧甲基葡聚糖多元醇的羧基通过含1个氨基酸或2－8个由肽键连接的氨基酸的间隔区相结合，其特征在于药物化合物残基的导入量为3.2－8.4％重量，羧甲基葡聚糖多元醇的平均分子量为240,000－480,000，羧甲基化度为0.14－0.47。所述DDS化合物的制造方法，该方法包括下述步骤在4℃±2℃的温度，向含有葡聚糖的水溶液中添加含有高碘酸钠的水溶液，以氧化葡聚糖，然后在不超过15℃的温度下，将所得反应溶液加入到含有硼氢化钠的水溶液中，得到葡聚糖多元醇。
文档编号A61P35/00GK1449412SQ01814617
公开日2003年10月15日 申请日期2001年6月27日 优先权日2000年6月29日
发明者井村明弘, 野口滋, 山口达也, 八木努, 川边武史 申请人:第一制药株式会社
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