一种珍珠菜提取物及其制备方法
专利名称：一种珍珠菜提取物及其制备方法
技术领域：
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种珍珠菜提取物及其制备方法，该提取物具 有显著的抗肿瘤活性，可以用来制备抗肿瘤或肿瘤辅助治疗的药物。
背景技术：
珍珠菜药材取自报春花科植物虎尾珍珠菜(Lysimachia clethroides Duby)的根或 全草，味苦、辛，性平，具清热利湿、活血散瘀、解毒消痈之功效。据文献报道，珍珠 菜中含紫云英苷、异槲皮苷、山奈酚-3-0-芸香糖苷、豆甾醇、羽扇豆醇等化合物，对 白血病小鼠有较好的生命延长率，证实可能有破坏白血病细胞的作用。
在初歩的临床治疗实践中发现，珍珠菜全草提取物对多种肿瘤具有良好的抑瘤效 果，珍珠菜的总醇提物的体外抗肿瘤试验(人白血病HL-60、 K 562细胞、肝癌SMMC-7721 细胞、人宫颈癌Hela细胞、人结肠癌Caco-2细胞、人乳腺癌MCF-7细胞)及体内抑瘤 试验(小鼠肉瘤S180、肝癌H22、白血病L1210、宫颈癌U14)结果，均表明珍珠菜总 醇提取物具有显著的抗肿瘤活性。
我们经过反复研究发现本发明黄酮组合物是珍珠菜的抗肿瘤活性物质，我们经过了 系统研究，准备开发以该黄酮组合物为主要成分的抗肿瘤药物。
发明内容
本发明涉及一种珍珠菜总黄酮提取物及其制备方法，其中珍珠菜总黄酮提取物(以 芦丁和柚皮素-7-0-葡萄糖苷计)含量为50-100%，总黄酮中的主要成分芦丁的含量为 10-25%，柚皮素-7-0-葡萄糖甙的含量为5-15%，异鼠李素-3-0-芸香糖苷的含量为 3-10%，、槲皮素的含量为3-10%、山奈酚的的含量为3-10%，其它成分小于50%。
本发明所述珍珠菜总黄酮提取物，其提取方法为
将珍珠菜药材粉碎成小段，用50-95%乙醇浸泡0. 5-2h， 6-12倍量加热回流提取2-3 次，每次1-3h，过滤，合并滤液。上述滤液于50-70。C减压浓縮至0. 5-1. 0g生药材/mL， 上大孔吸附树脂柱，上样后依次用6-12倍量蒸馏水、20-40%乙醇洗脱，洗脱流速为 1. 0-2. Oml/min，收集20-40%乙醇洗脱液。上述洗脱液于50-70。C减压浓縮至无乙醇味， 浓縮液用蒸馏水稀释后上大孔吸附树脂柱，上样后用6-12倍量蒸馏水、6-12倍量20-40% 乙醇依次洗脱，收集20-40%乙醇洗脱液。洗脱液于50-70'C减压浓縮，用喷雾干燥法进行千燥，收集喷干粉，即得，其中大孔树脂可以选择各种型号的黄酮类吸附树脂，包括 D4020型、NKA-9型、AB-8型、ZTC型、D101型及ADS-F8型，优选AB-8型和ADS-F8 型大孔树脂。
本发明珍珠菜总黄酮提取物，该提取物可以用于制备抗肿瘤或用于肿瘤辅助治疗的 药物，该提取物可以作为活性成分与药物载体配制成药剂学上的各种制剂，珍珠菜总黄 酮在制剂中的分散状态可以是液体，也可以是固体，该制剂的给药途径可以是口服、注 射和局部给药。
我们经过了系统研究，本发明黄酮组合物是珍珠菜的抗肿瘤活性物质，可以开发成 以该黄酮组合物为主要成分的抗肿瘤药物。
本发明中总黄酮含量的测定方法
1、戸丁对照品溶液的制备
精密称取芦丁对照品10.21 mg于50mL容量瓶中，以95%乙醇溶解，定容，配成 204.2 pg/mL的标准品溶液，冷藏保存备用。
2、 10y。AlCl3溶液的制备
精密称取无水AlCl3固体10g于100 mL容量瓶中，以蒸馏水定容即得。
3、 总黄酮最大吸收波长的确定
取芦丁对照品溶液适量，于10mL容量瓶中，加入1(F。AlCl3溶液lmL，以95%乙醇 定容至刻度，摇匀，分别在200-600 nm波长范围内进行紫外可见扫描，取样品溶液适 量，于10mL容量瓶中，加入10。/。AlCl3溶液lmL，以95%乙醇定容至刻度，摇匀，分别 在200-600 nm波长范围内进行紫外可见扫描，结果卢丁对照品和样品溶液在403 nm 处均有最大吸收，故确定最大吸收波长为403 ran。
4、 标准曲线的制备
精密量取对照品溶液O. 5， 1.0， 1.5， 2.0， 2.5， 3.0， 3.5， 4. OmL于25mL容量瓶 中，用95%乙醇溶解，定容。过滤后取lmL滤液于10mL容量瓶中，加入](F。AlCl3溶液 lmL，用95%乙醇定容至刻度，摇匀，于紫外分光光度计下测定其吸收度，以吸收度A 对浓度C作最小二乘法回归，得标准曲线方程为C=41. 232A-0. 0795， r=0. 999 9 (n=3)，
线性范围为4.084 32. 195吗/mL，质量浓度与吸收度值的线性关系良好。
5、 样品总黄酮含量测定方法
精密量称取珍珠菜有效部位样品5mg于25mL量瓶中，用80%乙醇溶解，定容。过 滤后取lmL滤液于10mL容量瓶中，加入10%三氯化铝溶液lmL显色30min，以95%乙醇稀释至刻度，摇匀。以未加三氯化铝的供试品液作为空白对照，在403nm处测定吸收度， 由标准曲线求得珍珠菜有效部位样品中总黄酮浓度并计算含量。
总黄酮中化学成分的HPLC标定
1、 混合对照品溶液的制备将5种黄酮类成分对照品，精密称定各约2mg，分别 置于25mL容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，作为储备液，再用lml移液管，精密移 取各储备液lmL，分别置于10mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，作为每种对照品溶液； 精密量取各储备液lmL，分别置于10mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，作为5种对照品溶液。
2、 样品液的制备取总黄酮粉末约10mg，置于10mL容量瓶中，甲醇溶解并定容 至刻度，作为储备液，再用lml移液管，精密移取该储备液lml，置于10mL容量瓶中， 甲醇定容至刻度。
3、 色谱条件色谱柱Diamonsil C18色谱柱(4.6國X250 mm， 5um);流动相 乙腈-0. 1%磷酸梯度洗脱(乙腈0 min为17% ， 18 min为20°/。 ， 30 min为14%);检测 波长254 nm， 流速1. 0 mL/min;柱温35。C;进样量20uL。 5种对照品溶液液相 色谱图(图l)和样品液的液相色谱图(图2)其中1、芦丁， 2、异鼠李素-3-0-芸 香糖苷，3、柚皮素-7-O-葡萄糖苷，4、槲皮素，5、山奈酚。
实施例一本发明珍珠菜总黄酮提取方法
将珍珠菜药材粉碎成lcm长的小段，用80%乙醇浸泡0. 5h， 12倍量加热回流提取3 次，每次1. 5h，过滤，合并滤液。上述滤液于7(TC减压浓縮至0. 7g生药材/mL，上AB-8 大孔吸附树脂柱，上样量为40mg总黄酮/g湿树脂，上样液总黄酮浓度10mg/ml、上样 流速1.0ml/min、上样液pH值为5.0，上样后依次用10倍量蒸馏水、40%乙醇洗脱，洗 脱流速为1. 5ml/min，收集40%乙醇洗脱液。上述洗脱液于70。C减压浓缩至无乙醇味， 浓縮液用蒸馏水稀释后上ADS-F8大孔吸附树脂柱，上样量为80mg总黄酮/g湿树脂， 上样液总黄酮浓度为20mg/ml，样品液pH值为5.0，吸附流速为1. Oml/min，上样后用 IO倍量蒸馏水、10倍量40%乙醇依次洗脱，洗脱流速为1. 5ml/min，收集40%乙醇洗脱 液。洗脱液于70。C减压浓縮至相对密度1. 07g/ml (50 60°C )，用喷雾干燥法进行干燥， 进风温度为140。C，出风温度为9(TC，收集喷干粉，即得。
实施例二用本发明实施例一中的方法制备的提取物为原料
1、片剂制备
处方(50片)
成分 重量(g)
本发明提取物 5.0乳糖 4. 8
糊精 9 微晶纤维素 6 硬脂酸镁 0.2
按照常规片剂的操作方法，以上混合均匀，湿法制粒，最后加入硬脂酸镁混合均匀 压制成每片500mg。
2、 胶囊制备
处方(90粒):
成分 重量(g)
本发明提取物 8 乳糖 5 糊精 9 微晶纤维素 5
按照常规片剂的操作方法，以上混合均匀，湿法制粒，灌装成胶囊，每粒300mg。
3、 巴布剂制备
处方 成分
本发明提取物 聚丙烯酸酯 月桂氮卓酮
月桂酸 丙二醇 乙酸乙酯
(g)
2
18
0.6
1.8
5.4
]5
按照通常巴布剂的做作进行，将上述搅拌均匀，涂布于聚酯防粘层上，60度干燥2 分钟后，覆盖聚氨基甲酯膜背衬层，切片即可。
4、粉针剂制备 处方
成分 重量(g)
本发明提取物 0.05
盐酸 适量 甘露醇 50按照常规冻干粉针的操作进行，将本发明提取物加适量注射用水溶解，加入甘露 醇，定容至1000ml，调节PH值至4.0—5.5之间，除菌过滤，冷冻干燥即得。
5、水针剂的制备
珍珠菜总黄酮，溶于适量注射用水中，加入计量的注射用水溶性辅料，加0. 1-0. 5% 的活性炭除去热原，调节ra至6.0-7.5，经微孔滤膜超滤后，补充注射用水至规定量， 灌装于安瓿瓶中或输液瓶中，熔封Z轧盖，经检验合格后，包装即得。
6、滴丸剂制备 处方
成分 重量(g)
本发明提取物 0. lg 聚乙二醇6000 10g 聚乙二醇4000 20g
聚山梨酯80 0.3g 乙醇 lml
制成 1000丸
制法将本发明提取物解于乙醇中充分溶解，成为石杉碱甲分散乙醇液，加入已熔 融的聚乙二醇6000、聚乙二醇4000、聚山梨酯80组成的基质中，充分搅拌至均匀，以 二甲基硅油为冷却剂，15。C下滴制成丸，擦丸，干燥，即得。
实施例三本发明提取物珍珠菜总黄酮药效学研究
1祛邪作用
1. 1对动物移植性肿瘤的抑制作用
采用小鼠肉瘤Sw。、肝癌&2、白血病L，和宫颈癌UH模型，考察ZTF的体内抗肿瘤 作用分别将腹腔接种小鼠S18。肉瘤、肝癌H22、白血病L121。、宫颈癌1114一周后的昆明种 小鼠处死，消毒，在无菌条件下取出腹水，用生理盐水稀释成lX104个细胞/ni1的瘤液。 给每只小鼠腋窝下接种瘤液0.2ml，接种后第二天，将动物随机分为阳性对照组(环磷 酰胺)、溶剂对照组(空白对照)、本发明提取物珍珠菜总黄酮(ZTF)高、中、低三个 剂量组(100,200，400mg/kg)，连续灌胃给药10天，末次给药24小时后，处死动物， 分离腋下肿瘤并称重，计算肿瘤抑制率。按下式计算抑瘤率抑瘤率(％)=[(空白对 照组平均瘤重一给药组平均瘤重)/空白对照组平均瘤重]X 100%。每个瘤株实验三次， 实验结果如下
(1)对S湖荷瘤的影响ZTF (200, 400mg/kg)均能明显抑制S，荷瘤小鼠瘤重，与对照组相比，有显著性差异。三次实验结果表明ZTF(400mg/kg)对小鼠S，肉瘤的抑制率 分别为60.00， 62.09和61.96%。提示，ZTF对小鼠荷瘤S哪有较好的抗肿瘤作用。结 果见表l。
表l珍珠菜总黄酮(ZTF)对小鼠肉瘤S,的影响
组别
剂量 (mg-kg—')
给药前
给药后
(g)
抑瘤率(％)
ZTF40020.0±0.2626.4±3.140.64±0.32林60.00
20020.2±0.3424.9±2.620.89±0.21*44.38
第10019.8±0.4525.8±2.981.21±0.5424.38
1 批环磷酰 胺2519.4±0.3923.9±3.460.52±0.27林67.50
空白对 昭—19.6±0.4525.4±2.071.60±0.57一—
ZTF40018.4±0.3626.0±2.150.58±0.21林62.09
第20018.6±0.4325.6±2.340.78±0.23*49.02
210018.9±0.5427.4±2.671.ll土O.3427.45
批环磷酰 胺2519.0±0.4523.8±2.560.47±0.30林69.28
空白对 照--18.4±0.2526.2±2.341.53±0.36—~
ZTF40020.4±0.4627.2±2.650.54±0.29林61.97
20019.6±0.3626. 3±2.670.76±0.34*46.48
第10019.9±0.6426. 4±2. 881.Ol土O.4528.87
3 批环磷酰 胺2519.8±0.4625. 7土2. 360.40±0.29氺*71.83
空白对 昭 "、 --18.8±0.3426. 9 ±2. 451.42±0.39——
*代0. 05，购^代0. 01与空白对照组相比
实验结果显示ZTF (100，200，400mg/kg)可显著抑制小鼠1肝癌的瘤重，三个剂 量抑制率分别为66. 67、 62. 75和46. 41% (第1批)，均在30%以上。第2批和3批最 大抑制率分别达67.67、 60.16%，结果见表2。
ZTF (100,200，400mg/kg)对小鼠白血病U、。均有一定的抑制作用。200mg/kg组的 抑制率分别为39.00%， 400mg/kg组的抑制率分别为64.54%,与对照组相比，有显著性 差异(第l批)。第2批和第3批结果与第1批类似，结果见表3。第1批实验结果表明ZTF (100，200，400mg/kg)对U"宫颈癌小鼠/J 率分别为33.81%， 48.92%和51.08%，与空白对照组均有显著差异。 批结果与第l批类似，结果见表4。
表2珍珠菜总黄酮(ZTF)小鼠肝癌H22的影响
、鼠瘤重的抑制 第2批和第3
组别
剂量 (mg'kg-l)
体重 给药前/给药后
(g)
抑瘤率(％)
ZTF40020. 25.0±0. 4±3.31 020. 51 ±0. 27**66. 67
第 1 批20019. 24.2±0. 8±2.24 040. 57±0. 29**62. 75
10019. 23.4±0. 4±2.26 070. 82±0. 31*46.41
环磷酰 胺2518. 24.8±0. 8±2.32 540. 44±0. 21**71. 24
空白对 昭 "、、19. 26.5±0. 1±2.36 091. 53±0. 43---
ZTF40018. 27.2±0. 1±2.31 360. 43±0. 22**67. 67
20018.4±0.560. 67±0. 31*49. 62
第 2 批26.8±1.89
10018.8±0.451. 01±0. 2724. 06
26.8±2.56
环磷酰 胺2518. 24.7±0. 9±2.46 150. 37±0. 31**72. 18
空白对——18.2±0.481. 33±0. 32一
昭 "、、26.9±2.56
ZTF40019. 27.8±0. 6±2.56 340. 49±0. 31**60. 16
20019.3±0.450. 52±0. 31*57. 72
第 3 批26.1±2.19
10019.6±0.380. 89 ±0. 3627. 64
26.0±2.38
环磷酰 胺2519. 25.0±0. 0±2.67 360. 32±0. 31**73. 98
空白对—19.1±0.291, 23±0. 21一
昭 "、、25.8±2.17
*P<0. 05， **P<0.01与空白对照组相比表3珍珠菜总黄酮(ZTF)对小鼠白血病L1210的影响
组别
(mg.kg-1)
体重 给药前/给药后
瘤重(g) 抑瘤率(％)
19.2±0.32
ZTF4000. 50±0. 39*64. 54
26.2±2.89
18.7±0.32
2000. 86 ±0. 24*39. 00
26.4±2.01
第19.1±0.26
1001. 20±0. 3414. 89
26.3±1.87
^ 环磷酰19.3±0.31
批250. 50±0. 31**64. 54
胺25.1±2.09
空白对19.0±0.78
-—1. 41±0. 23---
昭 >、、、26.8±1.78
18.0±0.24
ZTF4000. 51±0. 29林60. 46
27.5±2.08
18.2±0.89
2000. 89±0. 32*31. 00
26.9±1.46
第19.0±0.98
1001. 09±0. 2915. 50
226.2±3.10
批 环磷酰19.1±0.72
250. 29±0. 31**77. 52
胺25.9±2.34
空白对18.2±0.48
一1. 29±0. 31-—
照、26.9±2.56
19.0±0.26
ZTF4000. 58±0. 23**62. 09
27.4±2.46
19.2±0.65
2000. 80±0. 35*47. 71
26.6±2.78
第19.0±0.58
1000.98 ±0.2435. 95
325.9±1.69
批 环磷酰19.1±1.35
250. 45±0. 27**70. 59
胺25.7±2.35
空白对19.0±0.46
——1. 53±0. 31——
昭 j 、、、25.9±2.08
*P<0. 05， **P<0. 01与空白对照组相比表4珍珠菜总黄酮(ZTF)对小鼠宫颈癌U14的影响
组别剂量 (mg.kg-1)体重 给药前/给药后瘤重 (g)抑瘤率 (%)
ZTF40019. 1±0. 23 26. 7±2. 450. 68±0. 18**51. 08
20018. 4±0. 34 26. 0±1.910. 71 ±0. 30**48. 92
第10018. 9±0. 34 26. 1±1. 450. 92±0. 2233.81
批环磷酰胺 空白对照2519. 03±0. 45 25. 0±2. 12 18. 7±0. 56 26. 5±1. 450. 45 ±0. 23** 1. 39土0. 3267. 63
ZTF40019. 0±0. 21 27. 4±2. 360. 56 ±0. 19**56. 25
20018. 8±0. 31 27. 2±1. 450. 74±0. 32**41. 19
第 210018. 7±0. 25 26. 6±1. 390. 95±0. 3425. 78
批环磷酰胺 空白对照2519. 23±0. 30 26. 1±2. 09 18. 9±0. 33 26.6±1.810. 37 ±0. 27** 1. 28±0. 3171. 09
ZTF40018. 9±0. 18 26.5±2. 310. 60 ±0. 29林60. 26
20018. 6±0. 24 25. 8±1,310. 67±0. 35**55.63
第 310018. 7±0. 26 26. 9±1. 560. 98±0. 3235.09
批环磷酰胺 空白对照2518. 99±0. 23 25. 7±2. 90 18. 7±0. 19 26. 6土1, 340. 55±0. 41** 1.51±0.3563.58
**P<0.01与空白对照组相比(2)对H22肝癌大鼠的影响
实验结果显示ZTF (100， 200mg/kg)可显著抑制大鼠&2肝癌的瘤重，200mg/kg剂] ZTF三批抑瘤率分别为61.03， 57.71和62.72。均在30%以上，结果见表5。 表5珍珠菜总黄酮(ZTF)大鼠肝癌&2的影响
剂量 ，，工 ， 工
组别 ,，-,、 仏汰二/w汰r ,、 抑瘤率(％)
(mg'kg1) 给药刖/给药后 (g)
*代0. 05， **代0. 01与空白对照组相比
12
ZTF
第 1
批
环磷酰
胺
空白对 昭
八"
ZTF
200
100
50
25
酰 对
200 100 50 25
酰 对
200 100 50 25
187.0±2. 1
217.4±6. 5
190.6±4. 5
226.8±7. 6
192.8±4. 7
Sw-8±5. 9
iss.8±5.3
210.8±7. 5
跳5±8. 36
228.1±8.9
180.2±8. 3
224.1±8. 9
197.4±8. 7
228.8±10. 7
198.8±6. 6
219.8±9.5
200.7±9. 7
212.,9±8.6
191.,2±5. 8
219..9±9.8
199.,8±6. 7
235..6±8.9
187.,3±8.8
243.1±12.3
198.6±13. 2
231.0±13. 1
199..0±7.8
210.0±15. 0
199. ].±13. 29236. 8±10. 81.40±0.78** 61.03
1.90±1.20** 47.08
2. 70±0. 89* 24.79
1.14±0.89** 68.25
3. 59±1. 04
1. 70±0. 89林 57. 71
2. 16±1.24* 46.27
3.21±1.67 20.15
1.49土1.21林 62.94
4. 02±1. 29
1.45士0.89林 62.72
2.32±1。89* 40.36
3.01 ±1.56 22.62
1. 26±1. 23** 67. 61
3. 89±1. 45
磷胺白照
环 空
z
磷胺白昭M
环 空
第3批(3)对S,8。大鼠肉瘤的影响
实验结果显示珍珠菜总黄酮(ZTF) (100, 200mg/kg)可显著抑制大鼠肉瘤S^。的瘤重， 2()0mg/kg剂量ZTF三批抑瘤率分别为59. 27%， 66. 44%和60. 00%。均在30%以上。结果 见表6 (*代0.05， **代0.01与空白对照组相比)。
表6珍珠菜总黄酮(ZTF)对大鼠肉瘤S^。的影响
组别
剂量 (mg-kg一1)
给药前/给药后
(g)
抑瘤率(％)
1
批
2
批
3
批
ZTF
环磷酰
胺
空白对 昭
八、、
ZTF
环磷酰
胺 空白对
照
ZTF
环磷酰
胺
空白对 昭
200 100 50 25
200 100 50 25
200 100 50 25
190. 0±4. 6 237. 4±6.9 199. 7±8. 6 230. 8±7. 9 208. 8 ±4. 9 229. 8±7.9 202. 8±9. 3 225. 8±7. 9 190. 5±8. 36 236. 1±8. 5 180. 9±9. 8 234. 7±9.9 198. 9±9. 8
236. 6±8, 9 196. 7±8. 2 239. 8±9.8 201. 6±9. 5 224. 6±8. 5 190. 8±10. 8 239. 9±9. 4 187. 2 ±5. 9
237. 1±9. 4 189. 1±9. 8
239. 4± 12. 6 198. 9±12. 7
238. 0±11. 4 187. 0±9. 5 232. 0±11. 6 196. 2±10. 4
240. 8±12. 9
1.45土0.98林 59.27
2.00±1.60** 43.82
2.73±1.23* 23.31
1.00±0.98** 71.91
3. 56±1. 34
1. 45±0. 98** 66. 44
2.01±1.23* 53.47
3.02±1.45 30.09
1. 20±1. 18** 72. 22
4. 32±1. 31
1.40±0.78林 60.00
1.92±1.23* 45.14
2. 89 ±1. 23 17. 43
1. 12±1. 34** 68. 00
3. 50±1. 242扶正作用
2. 1珍珠菜总黄酮(ZTF)对荷瘤动物免疫功能的影响
实验结果提示珍珠菜总黄酮(ZTF)可明显升高荷瘤小鼠的脾指数、脾淋巴细胞 转化率和NK细胞的杀伤活性。
建立H22荷瘤小鼠动物模型，珍珠菜总黄酮(ZTF) (100， 200， 400mg/kg)灌胃 给药，连续10天，末次给药24小时后，将动物处死，取荷瘤小鼠胸腺和脾脏，称重， 分别计算胸腺指数[胸腺重(mg),/体重(g)]X10，脾指数[脾重(mg)/体重(g)]X10。 另外—一部分采用MTT法做小鼠脾淋巴细胞转化试验和NK细胞活性的测定实验。
(1)对小鼠胸腺指数和脾指数的影响
与空白对照组相比，ZTF (200,400mg/kg)能明显提高}122荷瘤小鼠的脾指数和胸腺 指数，但环磷酰胺却明显降低脾指数和胸腺指数。提示，环磷酰胺可引起荷瘤小鼠脾和 胸腺萎縮。初步说明ZTF在发挥抗癌作用的同时可能提高小鼠的免疫力，结果见表7。
表7珍珠菜总黄酮(ZTF)对H22荷瘤小鼠免疫系统的影响(x土s)
组别 剂量(mg.kg—M) 脾指数 胸腺指数
ZTF4009. 48±1. 75*3. 80±1. 34*
2009. 11±1.65*3. 25±1.23*
1007.94±2. 492. 78±1. 09
环磷酰胺257. 32±2. 131. 17±0. 30**
空白对照组7. 88±2. 262. 68±1. 27
*P<0. 05， **P<0. 01，与空白对照组相比
(2)对外周血免疫细胞的影响
经计数分析，与空白对照组比较，环磷酰胺组小鼠白细胞总数、淋巴细胞和红细胞 显著降低(/X0.01), ZTF各组小鼠白细胞总数、淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞数 有上升的趋势，但无显著差异。X).05)。提示，环磷酰胺明显抑制小鼠免疫细胞，而 ZTF各组与环磷酰胺的作用明显不同，对小鼠免疫细胞无抑制作用，并有增强免疫功能 的趋势。结果见表8。表8珍珠菜总黄酮(ZTF)对荷瘤小鼠外周血免疫细胞的影响
组别剂量 (mg.kg—')WBC (X109-L)(X109.L)WO (X109.L)GR (X109.L)RBC (X1012.L)
ZTF40012. 36±5. 019. 74±3. 242. 13±1.20. 59 ±0. 347. 56±1. 45
20012. 36±3. 009. 26±2. 312. 06 ±0. 560. 49±0. 217. 06±0. 78
10011. 36±1. 2710, 50±1. 341.29±0. 220. 48 ±0. 236. 97±1. 98
环磷 酰胺253. 78±3. 34*3. 00±1. 96*0. 78±0. 450. 22±0. 215. 06±0. 56*
空白 对照—一10. 29±1.478. 45±1. 011.09±0. 450. 58±0. 137. 42±0. 45
*P<0.05，与空白对照组相比 (3)对脾淋巴细胞转化功能的影响
小鼠脾淋巴细胞经刀豆蛋白刺激后细胞活性显著增高(/XO.Ol),而ZTF与刀豆蛋 白共剌激后细胞活性更高，与刀豆蛋白组比较差异显著(AO.Ol)。实验结果提示，ZTF 在体外可提高脾淋巴细胞转化效率，见表9。
表9珍珠菜总黄酮(ZTF)对H22荷瘤小鼠脾淋巴细胞转化功能的影响(x士s, n=4)
组别浓度(|ag/ml)OD
空白对照组0. 025±0. 005*
ConA102. 620 ±0. 008
5-Fu+ ConA10， 100. 028 ±0. 0065*
ZTF+ ConA100， 104. 678±0. 013*
50， 103. 912土0. 009*
25, 103. 104±0. 011*
^^(0.05与刀豆蛋白组相比 (4)对NK细胞活性的影响
实验结果表明，ZTF(50,100 ng/ml)组NK活性高于正常对照组，提示ZTF显著提 高NK细胞的杀伤能力，其作用呈现一定的量效关系，结果见表IO。
表10ZTF对NK细胞活性的影响(x±s， n=4)
组别浓度(pg/ml)NK细胞活性
空白对照组52. 1±7.0
ZTF]0074. 3±8. 1**
5060. 1±8. 2*
2556. 2 ±6. 8
*^X0. 01， *p<0. 05 与空白对照组相比3增效作用
实验用小鼠，分为空白对照组、ZTF (400 mg/kg)组、环磷酰胺(25mg/kg)组及ZTF (400mg/kg)+CTX(25mg/kg)合用组，重复三批实验。取S180小鼠腹水，接种于小鼠右 侧腋下，接种后随机分组，第2天起灌胃给药，每天1次，共10天，各组给药体积均 为0.2ml/10g体重，对照组给予相同体积的蒸馏水。末次给药24h后处死动物，取瘤称 重。按下式计算抑瘤率抑瘤率(%)=[(对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/对照组平均 瘤重]x1000/0。
两药合用疗效是否增强，按Burgi修正公式q=E(A+B)/[EA+(l_EA)xEB]，算出q 值，其中E(A+B)为两药合用疗效发生率;EA和EB分别为A药和B药单用的疗效发生率； q=0.85~1.15，表示两药作用单纯相加；q>1.15，表示两药有协同作用；q<0.85，表示 两药作用拮抗。实验结果如下
ZTF(400 mg/kg)组单用抑瘤率分别为62. 58%， 59.腦和61. 74%。环磷酰胺单 用抑瘤率分别为67. 48%, 62. 17%和69. 13%，两药和用后抑瘤率为73. 62%, 74. 84% 和74.49%, q值为0.86,提示ZTF和环磷酰胺合用，两药作用单纯相加。结果见表11 和12
表ll两药合用疗效是否增强
ZTF环磷酰胺ZTF +环磷酰胺q
62. 5867. 4873.620. 84
抑制率(%)59. 1062. 1774. 840. 89
61. 7469. 1374. 490. 85
平均61. 1467. 3874. 320. 86表12珍珠菜总黄酮(ZTF)对小鼠肉瘤S180的影响(x土s)No.组别剂量动物体重瘤重抑制
(mg.kg—')给药前
给药后(g)率(％)
19.9±0.3
ZTF4000. 61±0. 39*62. 58
26.8±0.6
第环磷酰胺19.7±0.3
250. 53±0. 36**67.48
24.6±0.8
丄ZTF +环磷酰胺19.3±0.2
批400+250. 43±0. 39**73.62
25.3±0.7
空白对照19.2±0.5
1. 63±0. 56-
26.5±0.5
19.8±0.3
ZTF4000. 59±0. 32林59. 10
27.8±0.9
第环磷酰胺19.1±0.5
250. 42±0. 41**72. 90
25.0±0.5
2
ZTF +环磷酰胺19.1±0.3
批400 + 250. 39±0. 5274. 84
25.4±0.4
空白对照19.4±0.2
—1. 55±0. 36—
26.1±0.4
20.0±0.5
ZTF4000. 57±0. 32*61. 74
27.0±0.9
第环磷酰胺19.5±0.3
250. 46±0. 19林69. 13
25.9±0.6
ZTF+环磷酰胺19.1±0.4
批400 + 250. 38±0. 2074. 49
26.1±0.7
19.1±0.3
空白对照一1.49±0. 34一
26.5±0.8
*代0. 05， **代0. 01， ks空白对照组相比
4减毒作用
4.1 ZTF对环磷酰胺所致小鼠骨髓抑制的保护作用
与空白对照组相比，环鳞酰胺可引起骨髓有核细胞和DNA含量明显减少，呈明显的 骨髓抑制作用(P<0.01)，而ZTF则能有效地保护环磷酰胺所致的骨髓抑制作用，小鼠 骨髓DNA含量及有核细胞数量均可明显升高(P〈0.01)，提示，ZTF对环鳞酰胺所致骨 髓损伤具有一定的保护作用，见表13。表13珍珠菜总黄酮(ZTF)对环磷酰胺所致小鼠骨髓抑制的保护作用(n=8， x±s)
组别剂量 (rag.kg—')有核细胞数 (xlOVFemur)腿(jag/femur)
正常对照组--12. 28±2. 19#310. 58±69. 77 #
空白对照组--11.93±2. 64*285. 25±46. 73 #
环磷酰胺257. 10±1. 79189. 83±22. 45#
ZTF +环磷酰胺400， 2512. 03±2. 47#272. 75±65. 42 #
200， 2511. 20±2. 45245. 93±20. 32
100， 251. 93±2. 64221. 10±20. 01
*P<0.05， **尸<0.01， ra环磷酰胺组比较 5最大耐受量实验
采用珍珠菜活性部位提取物浸膏，用蒸馏水配制成所需浓度的混悬液，采用清洁级 小鼠，由苏州大学实验动物中心提供。预实验表明，在珍珠菜总黄酮(ZTF)最高浓度 下，给小鼠灌胃给药无法测无定LD，因而采用最大耐受剂量实验。小鼠灌胃给药，最 大给药量为14000mg/kg，。相当于临床用药(1000mg/人/日)的70倍，动物无死亡， 提示临床用药安全。结果见表14。
表14.珍珠菜总黄酮(ZTF)对体重增长的影响(n=20， X±SD)
组别对照组给药组
给药前18.70±1.0818.30±1.17
给药后l天19.35±1.0918.55±1.32
2天19.75±1.5219.15±1.60
3天20.45±1.6120.30±1.59
4天20.55±1.6120.60±2.16
5天20.80±1.7021.20±2.31
6天21.05±1.9321.55 ±2.68
7天21.60±2.2822.30±2.77
8天21.95土1.4722.69±1,34
9天22.45±2.3223.11±2.54
10天22.90±1.3623.49±2.10
ll天23.50±1.0923.89±2.01
12天24.Ol土l.5924.47±2.02
13天24.55±1.2225.Ol士l.01
14天25.05±2.1225.,30±2.19
权利要求
1、一种珍珠菜总黄酮提取物及其制备方法，其特征在于珍珠菜总黄酮提取物(以芦丁计)含量为50-100％，总黄酮中的主要成分芦丁的含量为10-25％，柚皮素-7-O-葡萄糖甙的含量为5-15％，异鼠李素-3-O-芸香糖苷的含量为3-10％，、槲皮素的含量为3-10％、山奈酚的的含量为3-10％，其它成分小于50％。
2、 根据权利要求1所述的珍珠菜总黄酮提取物，其提取方法为将珍珠菜药材粉碎成小段， 用50-95%乙醇浸泡0.5-2h， 6-12倍量加热回流提取2-3次，每次l-3h，过滤，合并滤液。 上述滤液于50-70。C减压浓縮至0.5g-L0g生药材/mL，上大孔吸附树脂柱，上样后依次用 6-12倍量蒸馏水、20-40%乙醇洗脱，洗脱流速为1.0-2.0ml/min，收集20-40%乙醇洗脱液。 上述洗脱液于50-7(TC减压浓縮至无乙醇味，浓縮液用蒸馏水稀释后上大孔吸附树脂柱，上 样后用6-12倍量蒸馏水、6-12倍量20-40%乙醇依次洗脱，收集20-40%乙醇洗脱液。洗脱 液于50-7(TC减压浓縮，用喷雾干燥法进行干燥，收集喷干粉，即得。
3、 根据权利要求l-2所述珍珠菜总黄酮提取物，该提取物可以作为活性成分与药物辅料配 制成药剂学上的各种制剂。
4、 根据权利要求3所述的珍珠菜总黄酮提取物制成的制剂，其特征在于珍珠菜总黄酮在 制剂中的分散状态可以是液体，也可以是固体。
5、 根据权利要求1一4所述的珍珠菜总黄酮提取物，其特征在于该制剂的给药途径可以是 口服、注射和局部给药。
6、 根据权利要求1一5所述的珍珠菜总黄酮提取物，其特征在于该提取物可以用于制备抗 肿瘤或肿瘤辅助治疗的药物。
7、 根据权利要求2所述的大孔树脂，选择各种型号的黄酮类吸附树脂，包括D4020型、 NKA-9型、AB-8型、ZTC型、D101型及ADS-F8型中的一种或两种以上。
8、 根据权利要求7所述的黄酮类附树脂，优选AB-8型和ADS-F8型大孔树脂。
全文摘要
一种珍珠菜总黄酮提取物及其制备方法，其特征在于珍珠菜总黄酮提取物(以芦丁计)含量为50-100％，总黄酮中的主要成分芦丁的含量为10-25％，柚皮素-7-O-葡萄糖甙的含量为5-15％，异鼠李素-3-O-芸香糖苷的含量为3-10％，槲皮素的含量为3-10％，山奈酚的含量为3-10％，其它成分小于50％，该提取物作为活性成分可以用于制备抗肿瘤或肿瘤辅助治疗的药物。
文档编号A61K36/185GK101637483SQ200910169559
公开日2010年2月3日 申请日期2009年9月9日 优先权日2009年9月9日
发明者唐丽华, 李笑然, 杨世林, 游本刚, 许琼明 申请人:苏州世林医药技术发展有限公司
技术领域：
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种珍珠菜提取物及其制备方法，该提取物具 有显著的抗肿瘤活性，可以用来制备抗肿瘤或肿瘤辅助治疗的药物。
背景技术：
珍珠菜药材取自报春花科植物虎尾珍珠菜(Lysimachia clethroides Duby)的根或 全草，味苦、辛，性平，具清热利湿、活血散瘀、解毒消痈之功效。据文献报道，珍珠 菜中含紫云英苷、异槲皮苷、山奈酚-3-0-芸香糖苷、豆甾醇、羽扇豆醇等化合物，对 白血病小鼠有较好的生命延长率，证实可能有破坏白血病细胞的作用。
在初歩的临床治疗实践中发现，珍珠菜全草提取物对多种肿瘤具有良好的抑瘤效 果，珍珠菜的总醇提物的体外抗肿瘤试验(人白血病HL-60、 K 562细胞、肝癌SMMC-7721 细胞、人宫颈癌Hela细胞、人结肠癌Caco-2细胞、人乳腺癌MCF-7细胞)及体内抑瘤 试验(小鼠肉瘤S180、肝癌H22、白血病L1210、宫颈癌U14)结果，均表明珍珠菜总 醇提取物具有显著的抗肿瘤活性。
我们经过反复研究发现本发明黄酮组合物是珍珠菜的抗肿瘤活性物质，我们经过了 系统研究，准备开发以该黄酮组合物为主要成分的抗肿瘤药物。
发明内容
本发明涉及一种珍珠菜总黄酮提取物及其制备方法，其中珍珠菜总黄酮提取物(以 芦丁和柚皮素-7-0-葡萄糖苷计)含量为50-100%，总黄酮中的主要成分芦丁的含量为 10-25%，柚皮素-7-0-葡萄糖甙的含量为5-15%，异鼠李素-3-0-芸香糖苷的含量为 3-10%，、槲皮素的含量为3-10%、山奈酚的的含量为3-10%，其它成分小于50%。
本发明所述珍珠菜总黄酮提取物，其提取方法为
将珍珠菜药材粉碎成小段，用50-95%乙醇浸泡0. 5-2h， 6-12倍量加热回流提取2-3 次，每次1-3h，过滤，合并滤液。上述滤液于50-70。C减压浓縮至0. 5-1. 0g生药材/mL， 上大孔吸附树脂柱，上样后依次用6-12倍量蒸馏水、20-40%乙醇洗脱，洗脱流速为 1. 0-2. Oml/min，收集20-40%乙醇洗脱液。上述洗脱液于50-70。C减压浓縮至无乙醇味， 浓縮液用蒸馏水稀释后上大孔吸附树脂柱，上样后用6-12倍量蒸馏水、6-12倍量20-40% 乙醇依次洗脱，收集20-40%乙醇洗脱液。洗脱液于50-70'C减压浓縮，用喷雾干燥法进行千燥，收集喷干粉，即得，其中大孔树脂可以选择各种型号的黄酮类吸附树脂，包括 D4020型、NKA-9型、AB-8型、ZTC型、D101型及ADS-F8型，优选AB-8型和ADS-F8 型大孔树脂。
本发明珍珠菜总黄酮提取物，该提取物可以用于制备抗肿瘤或用于肿瘤辅助治疗的 药物，该提取物可以作为活性成分与药物载体配制成药剂学上的各种制剂，珍珠菜总黄 酮在制剂中的分散状态可以是液体，也可以是固体，该制剂的给药途径可以是口服、注 射和局部给药。
我们经过了系统研究，本发明黄酮组合物是珍珠菜的抗肿瘤活性物质，可以开发成 以该黄酮组合物为主要成分的抗肿瘤药物。
本发明中总黄酮含量的测定方法
1、戸丁对照品溶液的制备
精密称取芦丁对照品10.21 mg于50mL容量瓶中，以95%乙醇溶解，定容，配成 204.2 pg/mL的标准品溶液，冷藏保存备用。
2、 10y。AlCl3溶液的制备
精密称取无水AlCl3固体10g于100 mL容量瓶中，以蒸馏水定容即得。
3、 总黄酮最大吸收波长的确定
取芦丁对照品溶液适量，于10mL容量瓶中，加入1(F。AlCl3溶液lmL，以95%乙醇 定容至刻度，摇匀，分别在200-600 nm波长范围内进行紫外可见扫描，取样品溶液适 量，于10mL容量瓶中，加入10。/。AlCl3溶液lmL，以95%乙醇定容至刻度，摇匀，分别 在200-600 nm波长范围内进行紫外可见扫描，结果卢丁对照品和样品溶液在403 nm 处均有最大吸收，故确定最大吸收波长为403 ran。
4、 标准曲线的制备
精密量取对照品溶液O. 5， 1.0， 1.5， 2.0， 2.5， 3.0， 3.5， 4. OmL于25mL容量瓶 中，用95%乙醇溶解，定容。过滤后取lmL滤液于10mL容量瓶中，加入](F。AlCl3溶液 lmL，用95%乙醇定容至刻度，摇匀，于紫外分光光度计下测定其吸收度，以吸收度A 对浓度C作最小二乘法回归，得标准曲线方程为C=41. 232A-0. 0795， r=0. 999 9 (n=3)，
线性范围为4.084 32. 195吗/mL，质量浓度与吸收度值的线性关系良好。
5、 样品总黄酮含量测定方法
精密量称取珍珠菜有效部位样品5mg于25mL量瓶中，用80%乙醇溶解，定容。过 滤后取lmL滤液于10mL容量瓶中，加入10%三氯化铝溶液lmL显色30min，以95%乙醇稀释至刻度，摇匀。以未加三氯化铝的供试品液作为空白对照，在403nm处测定吸收度， 由标准曲线求得珍珠菜有效部位样品中总黄酮浓度并计算含量。
总黄酮中化学成分的HPLC标定
1、 混合对照品溶液的制备将5种黄酮类成分对照品，精密称定各约2mg，分别 置于25mL容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，作为储备液，再用lml移液管，精密移 取各储备液lmL，分别置于10mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，作为每种对照品溶液； 精密量取各储备液lmL，分别置于10mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，作为5种对照品溶液。
2、 样品液的制备取总黄酮粉末约10mg，置于10mL容量瓶中，甲醇溶解并定容 至刻度，作为储备液，再用lml移液管，精密移取该储备液lml，置于10mL容量瓶中， 甲醇定容至刻度。
3、 色谱条件色谱柱Diamonsil C18色谱柱(4.6國X250 mm， 5um);流动相 乙腈-0. 1%磷酸梯度洗脱(乙腈0 min为17% ， 18 min为20°/。 ， 30 min为14%);检测 波长254 nm， 流速1. 0 mL/min;柱温35。C;进样量20uL。 5种对照品溶液液相 色谱图(图l)和样品液的液相色谱图(图2)其中1、芦丁， 2、异鼠李素-3-0-芸 香糖苷，3、柚皮素-7-O-葡萄糖苷，4、槲皮素，5、山奈酚。
实施例一本发明珍珠菜总黄酮提取方法
将珍珠菜药材粉碎成lcm长的小段，用80%乙醇浸泡0. 5h， 12倍量加热回流提取3 次，每次1. 5h，过滤，合并滤液。上述滤液于7(TC减压浓縮至0. 7g生药材/mL，上AB-8 大孔吸附树脂柱，上样量为40mg总黄酮/g湿树脂，上样液总黄酮浓度10mg/ml、上样 流速1.0ml/min、上样液pH值为5.0，上样后依次用10倍量蒸馏水、40%乙醇洗脱，洗 脱流速为1. 5ml/min，收集40%乙醇洗脱液。上述洗脱液于70。C减压浓缩至无乙醇味， 浓縮液用蒸馏水稀释后上ADS-F8大孔吸附树脂柱，上样量为80mg总黄酮/g湿树脂， 上样液总黄酮浓度为20mg/ml，样品液pH值为5.0，吸附流速为1. Oml/min，上样后用 IO倍量蒸馏水、10倍量40%乙醇依次洗脱，洗脱流速为1. 5ml/min，收集40%乙醇洗脱 液。洗脱液于70。C减压浓縮至相对密度1. 07g/ml (50 60°C )，用喷雾干燥法进行干燥， 进风温度为140。C，出风温度为9(TC，收集喷干粉，即得。
实施例二用本发明实施例一中的方法制备的提取物为原料
1、片剂制备
处方(50片)
成分 重量(g)
本发明提取物 5.0乳糖 4. 8
糊精 9 微晶纤维素 6 硬脂酸镁 0.2
按照常规片剂的操作方法，以上混合均匀，湿法制粒，最后加入硬脂酸镁混合均匀 压制成每片500mg。
2、 胶囊制备
处方(90粒):
成分 重量(g)
本发明提取物 8 乳糖 5 糊精 9 微晶纤维素 5
按照常规片剂的操作方法，以上混合均匀，湿法制粒，灌装成胶囊，每粒300mg。
3、 巴布剂制备
处方 成分
本发明提取物 聚丙烯酸酯 月桂氮卓酮
月桂酸 丙二醇 乙酸乙酯
(g)
2
18
0.6
1.8
5.4
]5
按照通常巴布剂的做作进行，将上述搅拌均匀，涂布于聚酯防粘层上，60度干燥2 分钟后，覆盖聚氨基甲酯膜背衬层，切片即可。
4、粉针剂制备 处方
成分 重量(g)
本发明提取物 0.05
盐酸 适量 甘露醇 50按照常规冻干粉针的操作进行，将本发明提取物加适量注射用水溶解，加入甘露 醇，定容至1000ml，调节PH值至4.0—5.5之间，除菌过滤，冷冻干燥即得。
5、水针剂的制备
珍珠菜总黄酮，溶于适量注射用水中，加入计量的注射用水溶性辅料，加0. 1-0. 5% 的活性炭除去热原，调节ra至6.0-7.5，经微孔滤膜超滤后，补充注射用水至规定量， 灌装于安瓿瓶中或输液瓶中，熔封Z轧盖，经检验合格后，包装即得。
6、滴丸剂制备 处方
成分 重量(g)
本发明提取物 0. lg 聚乙二醇6000 10g 聚乙二醇4000 20g
聚山梨酯80 0.3g 乙醇 lml
制成 1000丸
制法将本发明提取物解于乙醇中充分溶解，成为石杉碱甲分散乙醇液，加入已熔 融的聚乙二醇6000、聚乙二醇4000、聚山梨酯80组成的基质中，充分搅拌至均匀，以 二甲基硅油为冷却剂，15。C下滴制成丸，擦丸，干燥，即得。
实施例三本发明提取物珍珠菜总黄酮药效学研究
1祛邪作用
1. 1对动物移植性肿瘤的抑制作用
采用小鼠肉瘤Sw。、肝癌&2、白血病L，和宫颈癌UH模型，考察ZTF的体内抗肿瘤 作用分别将腹腔接种小鼠S18。肉瘤、肝癌H22、白血病L121。、宫颈癌1114一周后的昆明种 小鼠处死，消毒，在无菌条件下取出腹水，用生理盐水稀释成lX104个细胞/ni1的瘤液。 给每只小鼠腋窝下接种瘤液0.2ml，接种后第二天，将动物随机分为阳性对照组(环磷 酰胺)、溶剂对照组(空白对照)、本发明提取物珍珠菜总黄酮(ZTF)高、中、低三个 剂量组(100,200，400mg/kg)，连续灌胃给药10天，末次给药24小时后，处死动物， 分离腋下肿瘤并称重，计算肿瘤抑制率。按下式计算抑瘤率抑瘤率(％)=[(空白对 照组平均瘤重一给药组平均瘤重)/空白对照组平均瘤重]X 100%。每个瘤株实验三次， 实验结果如下
(1)对S湖荷瘤的影响ZTF (200, 400mg/kg)均能明显抑制S，荷瘤小鼠瘤重，与对照组相比，有显著性差异。三次实验结果表明ZTF(400mg/kg)对小鼠S，肉瘤的抑制率 分别为60.00， 62.09和61.96%。提示，ZTF对小鼠荷瘤S哪有较好的抗肿瘤作用。结 果见表l。
表l珍珠菜总黄酮(ZTF)对小鼠肉瘤S,的影响
组别
剂量 (mg-kg—')
给药前
给药后
(g)
抑瘤率(％)
ZTF40020.0±0.2626.4±3.140.64±0.32林60.00
20020.2±0.3424.9±2.620.89±0.21*44.38
第10019.8±0.4525.8±2.981.21±0.5424.38
1 批环磷酰 胺2519.4±0.3923.9±3.460.52±0.27林67.50
空白对 昭—19.6±0.4525.4±2.071.60±0.57一—
ZTF40018.4±0.3626.0±2.150.58±0.21林62.09
第20018.6±0.4325.6±2.340.78±0.23*49.02
210018.9±0.5427.4±2.671.ll土O.3427.45
批环磷酰 胺2519.0±0.4523.8±2.560.47±0.30林69.28
空白对 照--18.4±0.2526.2±2.341.53±0.36—~
ZTF40020.4±0.4627.2±2.650.54±0.29林61.97
20019.6±0.3626. 3±2.670.76±0.34*46.48
第10019.9±0.6426. 4±2. 881.Ol土O.4528.87
3 批环磷酰 胺2519.8±0.4625. 7土2. 360.40±0.29氺*71.83
空白对 昭 "、 --18.8±0.3426. 9 ±2. 451.42±0.39——
*代0. 05，购^代0. 01与空白对照组相比
实验结果显示ZTF (100，200，400mg/kg)可显著抑制小鼠1肝癌的瘤重，三个剂 量抑制率分别为66. 67、 62. 75和46. 41% (第1批)，均在30%以上。第2批和3批最 大抑制率分别达67.67、 60.16%，结果见表2。
ZTF (100,200，400mg/kg)对小鼠白血病U、。均有一定的抑制作用。200mg/kg组的 抑制率分别为39.00%， 400mg/kg组的抑制率分别为64.54%,与对照组相比，有显著性 差异(第l批)。第2批和第3批结果与第1批类似，结果见表3。第1批实验结果表明ZTF (100，200，400mg/kg)对U"宫颈癌小鼠/J 率分别为33.81%， 48.92%和51.08%，与空白对照组均有显著差异。 批结果与第l批类似，结果见表4。
表2珍珠菜总黄酮(ZTF)小鼠肝癌H22的影响
、鼠瘤重的抑制 第2批和第3
组别
剂量 (mg'kg-l)
体重 给药前/给药后
(g)
抑瘤率(％)
ZTF40020. 25.0±0. 4±3.31 020. 51 ±0. 27**66. 67
第 1 批20019. 24.2±0. 8±2.24 040. 57±0. 29**62. 75
10019. 23.4±0. 4±2.26 070. 82±0. 31*46.41
环磷酰 胺2518. 24.8±0. 8±2.32 540. 44±0. 21**71. 24
空白对 昭 "、、19. 26.5±0. 1±2.36 091. 53±0. 43---
ZTF40018. 27.2±0. 1±2.31 360. 43±0. 22**67. 67
20018.4±0.560. 67±0. 31*49. 62
第 2 批26.8±1.89
10018.8±0.451. 01±0. 2724. 06
26.8±2.56
环磷酰 胺2518. 24.7±0. 9±2.46 150. 37±0. 31**72. 18
空白对——18.2±0.481. 33±0. 32一
昭 "、、26.9±2.56
ZTF40019. 27.8±0. 6±2.56 340. 49±0. 31**60. 16
20019.3±0.450. 52±0. 31*57. 72
第 3 批26.1±2.19
10019.6±0.380. 89 ±0. 3627. 64
26.0±2.38
环磷酰 胺2519. 25.0±0. 0±2.67 360. 32±0. 31**73. 98
空白对—19.1±0.291, 23±0. 21一
昭 "、、25.8±2.17
*P<0. 05， **P<0.01与空白对照组相比表3珍珠菜总黄酮(ZTF)对小鼠白血病L1210的影响
组别
(mg.kg-1)
体重 给药前/给药后
瘤重(g) 抑瘤率(％)
19.2±0.32
ZTF4000. 50±0. 39*64. 54
26.2±2.89
18.7±0.32
2000. 86 ±0. 24*39. 00
26.4±2.01
第19.1±0.26
1001. 20±0. 3414. 89
26.3±1.87
^ 环磷酰19.3±0.31
批250. 50±0. 31**64. 54
胺25.1±2.09
空白对19.0±0.78
-—1. 41±0. 23---
昭 >、、、26.8±1.78
18.0±0.24
ZTF4000. 51±0. 29林60. 46
27.5±2.08
18.2±0.89
2000. 89±0. 32*31. 00
26.9±1.46
第19.0±0.98
1001. 09±0. 2915. 50
226.2±3.10
批 环磷酰19.1±0.72
250. 29±0. 31**77. 52
胺25.9±2.34
空白对18.2±0.48
一1. 29±0. 31-—
照、26.9±2.56
19.0±0.26
ZTF4000. 58±0. 23**62. 09
27.4±2.46
19.2±0.65
2000. 80±0. 35*47. 71
26.6±2.78
第19.0±0.58
1000.98 ±0.2435. 95
325.9±1.69
批 环磷酰19.1±1.35
250. 45±0. 27**70. 59
胺25.7±2.35
空白对19.0±0.46
——1. 53±0. 31——
昭 j 、、、25.9±2.08
*P<0. 05， **P<0. 01与空白对照组相比表4珍珠菜总黄酮(ZTF)对小鼠宫颈癌U14的影响
组别剂量 (mg.kg-1)体重 给药前/给药后瘤重 (g)抑瘤率 (%)
ZTF40019. 1±0. 23 26. 7±2. 450. 68±0. 18**51. 08
20018. 4±0. 34 26. 0±1.910. 71 ±0. 30**48. 92
第10018. 9±0. 34 26. 1±1. 450. 92±0. 2233.81
批环磷酰胺 空白对照2519. 03±0. 45 25. 0±2. 12 18. 7±0. 56 26. 5±1. 450. 45 ±0. 23** 1. 39土0. 3267. 63
ZTF40019. 0±0. 21 27. 4±2. 360. 56 ±0. 19**56. 25
20018. 8±0. 31 27. 2±1. 450. 74±0. 32**41. 19
第 210018. 7±0. 25 26. 6±1. 390. 95±0. 3425. 78
批环磷酰胺 空白对照2519. 23±0. 30 26. 1±2. 09 18. 9±0. 33 26.6±1.810. 37 ±0. 27** 1. 28±0. 3171. 09
ZTF40018. 9±0. 18 26.5±2. 310. 60 ±0. 29林60. 26
20018. 6±0. 24 25. 8±1,310. 67±0. 35**55.63
第 310018. 7±0. 26 26. 9±1. 560. 98±0. 3235.09
批环磷酰胺 空白对照2518. 99±0. 23 25. 7±2. 90 18. 7±0. 19 26. 6土1, 340. 55±0. 41** 1.51±0.3563.58
**P<0.01与空白对照组相比(2)对H22肝癌大鼠的影响
实验结果显示ZTF (100， 200mg/kg)可显著抑制大鼠&2肝癌的瘤重，200mg/kg剂] ZTF三批抑瘤率分别为61.03， 57.71和62.72。均在30%以上，结果见表5。 表5珍珠菜总黄酮(ZTF)大鼠肝癌&2的影响
剂量 ，，工 ， 工
组别 ,，-,、 仏汰二/w汰r ,、 抑瘤率(％)
(mg'kg1) 给药刖/给药后 (g)
*代0. 05， **代0. 01与空白对照组相比
12
ZTF
第 1
批
环磷酰
胺
空白对 昭
八"
ZTF
200
100
50
25
酰 对
200 100 50 25
酰 对
200 100 50 25
187.0±2. 1
217.4±6. 5
190.6±4. 5
226.8±7. 6
192.8±4. 7
Sw-8±5. 9
iss.8±5.3
210.8±7. 5
跳5±8. 36
228.1±8.9
180.2±8. 3
224.1±8. 9
197.4±8. 7
228.8±10. 7
198.8±6. 6
219.8±9.5
200.7±9. 7
212.,9±8.6
191.,2±5. 8
219..9±9.8
199.,8±6. 7
235..6±8.9
187.,3±8.8
243.1±12.3
198.6±13. 2
231.0±13. 1
199..0±7.8
210.0±15. 0
199. ].±13. 29236. 8±10. 81.40±0.78** 61.03
1.90±1.20** 47.08
2. 70±0. 89* 24.79
1.14±0.89** 68.25
3. 59±1. 04
1. 70±0. 89林 57. 71
2. 16±1.24* 46.27
3.21±1.67 20.15
1.49土1.21林 62.94
4. 02±1. 29
1.45士0.89林 62.72
2.32±1。89* 40.36
3.01 ±1.56 22.62
1. 26±1. 23** 67. 61
3. 89±1. 45
磷胺白照
环 空
z
磷胺白昭M
环 空
第3批(3)对S,8。大鼠肉瘤的影响
实验结果显示珍珠菜总黄酮(ZTF) (100, 200mg/kg)可显著抑制大鼠肉瘤S^。的瘤重， 2()0mg/kg剂量ZTF三批抑瘤率分别为59. 27%， 66. 44%和60. 00%。均在30%以上。结果 见表6 (*代0.05， **代0.01与空白对照组相比)。
表6珍珠菜总黄酮(ZTF)对大鼠肉瘤S^。的影响
组别
剂量 (mg-kg一1)
给药前/给药后
(g)
抑瘤率(％)
1
批
2
批
3
批
ZTF
环磷酰
胺
空白对 昭
八、、
ZTF
环磷酰
胺 空白对
照
ZTF
环磷酰
胺
空白对 昭
200 100 50 25
200 100 50 25
200 100 50 25
190. 0±4. 6 237. 4±6.9 199. 7±8. 6 230. 8±7. 9 208. 8 ±4. 9 229. 8±7.9 202. 8±9. 3 225. 8±7. 9 190. 5±8. 36 236. 1±8. 5 180. 9±9. 8 234. 7±9.9 198. 9±9. 8
236. 6±8, 9 196. 7±8. 2 239. 8±9.8 201. 6±9. 5 224. 6±8. 5 190. 8±10. 8 239. 9±9. 4 187. 2 ±5. 9
237. 1±9. 4 189. 1±9. 8
239. 4± 12. 6 198. 9±12. 7
238. 0±11. 4 187. 0±9. 5 232. 0±11. 6 196. 2±10. 4
240. 8±12. 9
1.45土0.98林 59.27
2.00±1.60** 43.82
2.73±1.23* 23.31
1.00±0.98** 71.91
3. 56±1. 34
1. 45±0. 98** 66. 44
2.01±1.23* 53.47
3.02±1.45 30.09
1. 20±1. 18** 72. 22
4. 32±1. 31
1.40±0.78林 60.00
1.92±1.23* 45.14
2. 89 ±1. 23 17. 43
1. 12±1. 34** 68. 00
3. 50±1. 242扶正作用
2. 1珍珠菜总黄酮(ZTF)对荷瘤动物免疫功能的影响
实验结果提示珍珠菜总黄酮(ZTF)可明显升高荷瘤小鼠的脾指数、脾淋巴细胞 转化率和NK细胞的杀伤活性。
建立H22荷瘤小鼠动物模型，珍珠菜总黄酮(ZTF) (100， 200， 400mg/kg)灌胃 给药，连续10天，末次给药24小时后，将动物处死，取荷瘤小鼠胸腺和脾脏，称重， 分别计算胸腺指数[胸腺重(mg),/体重(g)]X10，脾指数[脾重(mg)/体重(g)]X10。 另外—一部分采用MTT法做小鼠脾淋巴细胞转化试验和NK细胞活性的测定实验。
(1)对小鼠胸腺指数和脾指数的影响
与空白对照组相比，ZTF (200,400mg/kg)能明显提高}122荷瘤小鼠的脾指数和胸腺 指数，但环磷酰胺却明显降低脾指数和胸腺指数。提示，环磷酰胺可引起荷瘤小鼠脾和 胸腺萎縮。初步说明ZTF在发挥抗癌作用的同时可能提高小鼠的免疫力，结果见表7。
表7珍珠菜总黄酮(ZTF)对H22荷瘤小鼠免疫系统的影响(x土s)
组别 剂量(mg.kg—M) 脾指数 胸腺指数
ZTF4009. 48±1. 75*3. 80±1. 34*
2009. 11±1.65*3. 25±1.23*
1007.94±2. 492. 78±1. 09
环磷酰胺257. 32±2. 131. 17±0. 30**
空白对照组7. 88±2. 262. 68±1. 27
*P<0. 05， **P<0. 01，与空白对照组相比
(2)对外周血免疫细胞的影响
经计数分析，与空白对照组比较，环磷酰胺组小鼠白细胞总数、淋巴细胞和红细胞 显著降低(/X0.01), ZTF各组小鼠白细胞总数、淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞数 有上升的趋势，但无显著差异。X).05)。提示，环磷酰胺明显抑制小鼠免疫细胞，而 ZTF各组与环磷酰胺的作用明显不同，对小鼠免疫细胞无抑制作用，并有增强免疫功能 的趋势。结果见表8。表8珍珠菜总黄酮(ZTF)对荷瘤小鼠外周血免疫细胞的影响
组别剂量 (mg.kg—')WBC (X109-L)(X109.L)WO (X109.L)GR (X109.L)RBC (X1012.L)
ZTF40012. 36±5. 019. 74±3. 242. 13±1.20. 59 ±0. 347. 56±1. 45
20012. 36±3. 009. 26±2. 312. 06 ±0. 560. 49±0. 217. 06±0. 78
10011. 36±1. 2710, 50±1. 341.29±0. 220. 48 ±0. 236. 97±1. 98
环磷 酰胺253. 78±3. 34*3. 00±1. 96*0. 78±0. 450. 22±0. 215. 06±0. 56*
空白 对照—一10. 29±1.478. 45±1. 011.09±0. 450. 58±0. 137. 42±0. 45
*P<0.05，与空白对照组相比 (3)对脾淋巴细胞转化功能的影响
小鼠脾淋巴细胞经刀豆蛋白刺激后细胞活性显著增高(/XO.Ol),而ZTF与刀豆蛋 白共剌激后细胞活性更高，与刀豆蛋白组比较差异显著(AO.Ol)。实验结果提示，ZTF 在体外可提高脾淋巴细胞转化效率，见表9。
表9珍珠菜总黄酮(ZTF)对H22荷瘤小鼠脾淋巴细胞转化功能的影响(x士s, n=4)
组别浓度(|ag/ml)OD
空白对照组0. 025±0. 005*
ConA102. 620 ±0. 008
5-Fu+ ConA10， 100. 028 ±0. 0065*
ZTF+ ConA100， 104. 678±0. 013*
50， 103. 912土0. 009*
25, 103. 104±0. 011*
^^(0.05与刀豆蛋白组相比 (4)对NK细胞活性的影响
实验结果表明，ZTF(50,100 ng/ml)组NK活性高于正常对照组，提示ZTF显著提 高NK细胞的杀伤能力，其作用呈现一定的量效关系，结果见表IO。
表10ZTF对NK细胞活性的影响(x±s， n=4)
组别浓度(pg/ml)NK细胞活性
空白对照组52. 1±7.0
ZTF]0074. 3±8. 1**
5060. 1±8. 2*
2556. 2 ±6. 8
*^X0. 01， *p<0. 05 与空白对照组相比3增效作用
实验用小鼠，分为空白对照组、ZTF (400 mg/kg)组、环磷酰胺(25mg/kg)组及ZTF (400mg/kg)+CTX(25mg/kg)合用组，重复三批实验。取S180小鼠腹水，接种于小鼠右 侧腋下，接种后随机分组，第2天起灌胃给药，每天1次，共10天，各组给药体积均 为0.2ml/10g体重，对照组给予相同体积的蒸馏水。末次给药24h后处死动物，取瘤称 重。按下式计算抑瘤率抑瘤率(%)=[(对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/对照组平均 瘤重]x1000/0。
两药合用疗效是否增强，按Burgi修正公式q=E(A+B)/[EA+(l_EA)xEB]，算出q 值，其中E(A+B)为两药合用疗效发生率;EA和EB分别为A药和B药单用的疗效发生率； q=0.85~1.15，表示两药作用单纯相加；q>1.15，表示两药有协同作用；q<0.85，表示 两药作用拮抗。实验结果如下
ZTF(400 mg/kg)组单用抑瘤率分别为62. 58%， 59.腦和61. 74%。环磷酰胺单 用抑瘤率分别为67. 48%, 62. 17%和69. 13%，两药和用后抑瘤率为73. 62%, 74. 84% 和74.49%, q值为0.86,提示ZTF和环磷酰胺合用，两药作用单纯相加。结果见表11 和12
表ll两药合用疗效是否增强
ZTF环磷酰胺ZTF +环磷酰胺q
62. 5867. 4873.620. 84
抑制率(%)59. 1062. 1774. 840. 89
61. 7469. 1374. 490. 85
平均61. 1467. 3874. 320. 86表12珍珠菜总黄酮(ZTF)对小鼠肉瘤S180的影响(x土s)No.组别剂量动物体重瘤重抑制
(mg.kg—')给药前
给药后(g)率(％)
19.9±0.3
ZTF4000. 61±0. 39*62. 58
26.8±0.6
第环磷酰胺19.7±0.3
250. 53±0. 36**67.48
24.6±0.8
丄ZTF +环磷酰胺19.3±0.2
批400+250. 43±0. 39**73.62
25.3±0.7
空白对照19.2±0.5
1. 63±0. 56-
26.5±0.5
19.8±0.3
ZTF4000. 59±0. 32林59. 10
27.8±0.9
第环磷酰胺19.1±0.5
250. 42±0. 41**72. 90
25.0±0.5
2
ZTF +环磷酰胺19.1±0.3
批400 + 250. 39±0. 5274. 84
25.4±0.4
空白对照19.4±0.2
—1. 55±0. 36—
26.1±0.4
20.0±0.5
ZTF4000. 57±0. 32*61. 74
27.0±0.9
第环磷酰胺19.5±0.3
250. 46±0. 19林69. 13
25.9±0.6
ZTF+环磷酰胺19.1±0.4
批400 + 250. 38±0. 2074. 49
26.1±0.7
19.1±0.3
空白对照一1.49±0. 34一
26.5±0.8
*代0. 05， **代0. 01， ks空白对照组相比
4减毒作用
4.1 ZTF对环磷酰胺所致小鼠骨髓抑制的保护作用
与空白对照组相比，环鳞酰胺可引起骨髓有核细胞和DNA含量明显减少，呈明显的 骨髓抑制作用(P<0.01)，而ZTF则能有效地保护环磷酰胺所致的骨髓抑制作用，小鼠 骨髓DNA含量及有核细胞数量均可明显升高(P〈0.01)，提示，ZTF对环鳞酰胺所致骨 髓损伤具有一定的保护作用，见表13。表13珍珠菜总黄酮(ZTF)对环磷酰胺所致小鼠骨髓抑制的保护作用(n=8， x±s)
组别剂量 (rag.kg—')有核细胞数 (xlOVFemur)腿(jag/femur)
正常对照组--12. 28±2. 19#310. 58±69. 77 #
空白对照组--11.93±2. 64*285. 25±46. 73 #
环磷酰胺257. 10±1. 79189. 83±22. 45#
ZTF +环磷酰胺400， 2512. 03±2. 47#272. 75±65. 42 #
200， 2511. 20±2. 45245. 93±20. 32
100， 251. 93±2. 64221. 10±20. 01
*P<0.05， **尸<0.01， ra环磷酰胺组比较 5最大耐受量实验
采用珍珠菜活性部位提取物浸膏，用蒸馏水配制成所需浓度的混悬液，采用清洁级 小鼠，由苏州大学实验动物中心提供。预实验表明，在珍珠菜总黄酮(ZTF)最高浓度 下，给小鼠灌胃给药无法测无定LD，因而采用最大耐受剂量实验。小鼠灌胃给药，最 大给药量为14000mg/kg，。相当于临床用药(1000mg/人/日)的70倍，动物无死亡， 提示临床用药安全。结果见表14。
表14.珍珠菜总黄酮(ZTF)对体重增长的影响(n=20， X±SD)
组别对照组给药组
给药前18.70±1.0818.30±1.17
给药后l天19.35±1.0918.55±1.32
2天19.75±1.5219.15±1.60
3天20.45±1.6120.30±1.59
4天20.55±1.6120.60±2.16
5天20.80±1.7021.20±2.31
6天21.05±1.9321.55 ±2.68
7天21.60±2.2822.30±2.77
8天21.95土1.4722.69±1,34
9天22.45±2.3223.11±2.54
10天22.90±1.3623.49±2.10
ll天23.50±1.0923.89±2.01
12天24.Ol土l.5924.47±2.02
13天24.55±1.2225.Ol士l.01
14天25.05±2.1225.,30±2.19
权利要求
1、一种珍珠菜总黄酮提取物及其制备方法，其特征在于珍珠菜总黄酮提取物(以芦丁计)含量为50-100％，总黄酮中的主要成分芦丁的含量为10-25％，柚皮素-7-O-葡萄糖甙的含量为5-15％，异鼠李素-3-O-芸香糖苷的含量为3-10％，、槲皮素的含量为3-10％、山奈酚的的含量为3-10％，其它成分小于50％。
2、 根据权利要求1所述的珍珠菜总黄酮提取物，其提取方法为将珍珠菜药材粉碎成小段， 用50-95%乙醇浸泡0.5-2h， 6-12倍量加热回流提取2-3次，每次l-3h，过滤，合并滤液。 上述滤液于50-70。C减压浓縮至0.5g-L0g生药材/mL，上大孔吸附树脂柱，上样后依次用 6-12倍量蒸馏水、20-40%乙醇洗脱，洗脱流速为1.0-2.0ml/min，收集20-40%乙醇洗脱液。 上述洗脱液于50-7(TC减压浓縮至无乙醇味，浓縮液用蒸馏水稀释后上大孔吸附树脂柱，上 样后用6-12倍量蒸馏水、6-12倍量20-40%乙醇依次洗脱，收集20-40%乙醇洗脱液。洗脱 液于50-7(TC减压浓縮，用喷雾干燥法进行干燥，收集喷干粉，即得。
3、 根据权利要求l-2所述珍珠菜总黄酮提取物，该提取物可以作为活性成分与药物辅料配 制成药剂学上的各种制剂。
4、 根据权利要求3所述的珍珠菜总黄酮提取物制成的制剂，其特征在于珍珠菜总黄酮在 制剂中的分散状态可以是液体，也可以是固体。
5、 根据权利要求1一4所述的珍珠菜总黄酮提取物，其特征在于该制剂的给药途径可以是 口服、注射和局部给药。
6、 根据权利要求1一5所述的珍珠菜总黄酮提取物，其特征在于该提取物可以用于制备抗 肿瘤或肿瘤辅助治疗的药物。
7、 根据权利要求2所述的大孔树脂，选择各种型号的黄酮类吸附树脂，包括D4020型、 NKA-9型、AB-8型、ZTC型、D101型及ADS-F8型中的一种或两种以上。
8、 根据权利要求7所述的黄酮类附树脂，优选AB-8型和ADS-F8型大孔树脂。
全文摘要
一种珍珠菜总黄酮提取物及其制备方法，其特征在于珍珠菜总黄酮提取物(以芦丁计)含量为50-100％，总黄酮中的主要成分芦丁的含量为10-25％，柚皮素-7-O-葡萄糖甙的含量为5-15％，异鼠李素-3-O-芸香糖苷的含量为3-10％，槲皮素的含量为3-10％，山奈酚的含量为3-10％，其它成分小于50％，该提取物作为活性成分可以用于制备抗肿瘤或肿瘤辅助治疗的药物。
文档编号A61K36/185GK101637483SQ200910169559
公开日2010年2月3日 申请日期2009年9月9日 优先权日2009年9月9日
发明者唐丽华, 李笑然, 杨世林, 游本刚, 许琼明 申请人:苏州世林医药技术发展有限公司
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