鸡传染性鼻炎灭活疫苗的制备方法
专利名称：鸡传染性鼻炎灭活疫苗的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种灭活疫苗的制备方法，尤其涉及鸡传染性鼻炎灭活疫苗的制备方法，属于灭活疫苗的制备领域。
背景技术：
鸡传染性鼻炎是由副鸡嗜血杆菌引起的 一种急性呼吸系统传染病，主要特征为眼和鼻粘膜发生不同程度炎症，发病率很高，可以引起幼鸡生长停滞和蛋鸡产
蛋量显著下降，8-12周龄的鸡和产蛋母鸡最常发生。此病分布于全世界，由于感染的产蛋鸡产蛋减少10%-40%,生长鸡增重停滞及淘汰鸡数增加，常造成严重经济损失。虽然此病可采用抗生素及磺胺类药物进行治疗，但会造成药物残留，据现地调查卯％以上的大型养鸡场均采用接种疫苗的方式来防治该病。
目前，国内一些生物制品生产厂家生产的鸡传染性鼻炎疫苗均为灭活疫苗。这些生产厂家均采用《兽用生物制品规程》工艺进行生产，其主要的工艺方法如下
1、 一级菌种制备菌种划线接种鸡肉琼脂平板；在5%-10% C02浓度下37°C培养16-18h;选典型菌落接种5日龄鸡胚卵黄嚢内，37。C继续孵育，收集30h以内死亡鸡胚卵黄液，经纯检确认无菌后待用；
2、 二级菌种制备鸡胚卵黄液划线接种鸡肉琼脂平板，5%- 10%CO2 37°C培养16-18h ;选典型菌落接种鸡肉汤培养基中37°C培养16-20h ，纯检确认无菌后待用；
3、 菌液培养按2.5%的接种量接入半合成培养基；37。C培养18-20h ,其间摇振培养瓶二次取样活菌计数；纯检确认无菌后，灭活，即得。
按照《兽用生物制品规程》进行生产所制备得到的灭活疫苗的培养菌数一般
都在30-40亿/ml,按照《兽用生物制品规程》50亿/ml配苗要求，需要对菌液进行浓缩处理。所以，现有的鸡传染性鼻炎灭活疫苗的制备方法存在工艺复杂，生产成本高，产量低等缺陷，有待改进。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有的鸡传染性鼻炎灭活疫苗的制备方法所存在的工艺复杂，生产成本高，产量低等缺陷，提供一种新的鸡传染性鼻炎灭活疫苗的制备方法，该制备方法具有工艺简捷，生产成本低，产量高等优点；
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的
一种鸡传染性鼻炎灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤
(1) 、制备一级斜面菌种将副鸡嗜血杆菌菌种稀释接种鸡肉琼脂平板，
37。C培养22-24h;选典型菌落接种鸡肉琼脂斜面培养基，37°C培养24h ,得到一级斜面菌种；
(2) 、制备二级菌种取一级斜面菌种接种于鸡肉汤培养基中(采用全温振荡器)37。C振荡培养12h,得到二级菌种，备用；
(3) 、菌液培养将二级菌种接种到半合成培养基中用生物发酵罐培养；确认无菌后，灭活，即得。
其中，为了达到更好的技术效果，在步骤(1)中选10-20个典型菌落接种鸡肉琼脂斜面培养基；
步骤(3)中，所述的发酵培养条件优选为培养温度为37°C;转速为100-200r/min;培养时间为8h;本发明人经过进一步的试验发现，在培养过程中，采用逐渐加大通气量的方法，能够显著提高培养菌数。本发明针对现有的鸡传染性鼻炎灭活疫苗的制备方法所存在的工艺复杂，生产成本高，产量低等缺陷，开展了改进生产工艺的研究工作，最终在培养方法上获得了重大突破。本发明方法操作简便可行，培养菌数相比于现有的方法有大幅
度提高，培养时间也缩短了 10-12h ，有效降低了生产成本。
具体实施例方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
1、 副鸡嗜血杆菌菌种购自中国兽医药品监察所。
2、 各培养基的具体组成成分(1)鸡肉琼脂平板鸡肉汁100ml、酪蛋白胨lg、氯化钠0.5g、琼脂粉1.5g、辅酶I0.05g、健康鸡血清10ml; (2)鸡肉琼脂斜面培养基成分与鸡肉琼脂平板相同；(3)鸡肉汤培养基鸡肉汁100ml、酪蛋白胨lg、氯化钠0.5g、辅酶l0.05g、健康鸡血清10ml; (4)半合成培养基多蛋白胨5g、酪蛋白胨30g、谷氨酸钠15g、酵母浸粉5g、葡萄糖3g、氯化钠15g、蒸馏水3000ml，调pH7.2-7.4、 115。C灭菌40分钟，使用前加入灭活的健康鸡血清30-60ml和0.5%辅酶I水溶液8-10ml。
实施例1
1、 一级斜面菌种制备副鸡嗜血杆菌菌种稀释接种鸡肉琼脂平板37°C培养22h,选典型菌落10个接种鸡肉琼脂斜面培养基，37°C培养24h,得到一级斜面菌种，放置4。C冰箱待用；2、 二级菌种制备取一级斜面菌种接种于鸡肉汤培养基中全温振荡器37。C培养12h,纯冲会确认无菌后，得到二级菌种，备用；
3、 菌液培养将二级菌种接种到半合成培养基中用生物发酵罐进行培养；培养温度37°C,转速100r/min ,培养时间8h ;取样平板活菌计数纯检确认无菌后，灭活,即得。
采用《兽用生物制品规程》活菌计数法，鸡肉琼脂平板计数，计算培养菌数，培养菌数的检测结果见表l。
实施例2
1、 一级斜面菌种制备副鸡嗜血杆菌菌种稀释接种鸡肉琼脂平板37°C培养24h，选典型菌落20个接种鸡肉琼脂斜面培养基，37°C培养24h,得到一级斜面菌种，放置4。C冰箱待用；
2、 二级菌种制备取一级斜面菌种接种于鸡肉汤培养基中全温振荡器37。C培养12h,纯检确认无菌后，得到二级菌种，备用；
3、 菌液培养将二级菌种接种到半合成培养基中用生物发酵罐进行培养；培养温度37°C，转速200r/min ，培养时间8h ;在发酵培养过程中，釆用逐渐加大通气量的方法；取样平板活菌计数纯检确认无菌后，灭活,即得。
采用《兽用生物制品规程》活菌计数法，鸡肉琼脂平板计数，计算培养菌数，培养菌数的检测结果见表l。
实施例3
1、 一级斜面菌种制备副鸡嗜血杆菌菌种稀释接种鸡肉琼脂平板37°C培养23h,选典型菌落15个接种鸡肉琼脂斜面培养基，37°C培养24h,得到一级斜面菌种，放置4。C水箱待用；
2、 二级菌种制备取一级斜面菌种接种于鸡肉汤培养基中全温振荡器37。C培养12h，纯检确认无菌后，得到二级菌种，备用；
3、 菌液培养将二级菌种接种到半合成培养基中用生物发酵罐进行培养；培养温度37°C,转速150r/min,培养时间8h;取样平板活菌计数纯检确认无菌后，灭活,即得。
采用《兽用生物制品规程》活菌计数法，鸡肉琼脂平板计数，计算培养菌数，培养菌数的检测结果见表l。
实施例4
1、 一级斜面菌种制备副鸡嗜血杆菌菌种稀释接种鸡肉琼脂平板37°C培养22h，选典型菌落20个接种鸡肉琼脂斜面培养基，37°C培养24h,得到一级斜面菌种，放置4。C水箱待用；
2、 二级菌种制备取一级斜面菌种接种于鸡肉汤培养基中全温振荡器37。C培养12h，纯检确认无菌后，得到二级菌种，备用；
3、 菌液培养将二级菌种接种到半合成培养基中用生物发酵罐进行培养；培养温度37°C，转速120r/min ,培养时间8h ;取样平板活菌计数，纯检确认无菌后，灭活,即得。
采用《兽用生物制品规程》活菌计数法，鸡肉琼脂平板计数，计算培养菌数，培养菌数的检测结果见表l。
实施例5
1、 一级斜面菌种制备副鸡嗜血杆菌菌种稀释接种鸡肉琼脂平板37°C培养200910170071
24h，选典型菌落10个接种鸡肉琼脂斜面培养基，37°C培养24h，得到一级斜面菌种，放置4°(3水箱待用；
2、 二级菌种制备取一级斜面菌种接种于鸡肉汤培养基中全温振荡器37。C培养12h,纯检确认无菌后，得到二级菌种，备用；
3、 菌液培养将二级菌种接种到半合成培养基中用生物发酵罐进行培养；培养温度37°C,转速180r/min ，培养时间8h ;取样平板活菌计数，纯检确认无菌后，灭活,即得。
采用《兽用生物制品规程》活菌计数法，鸡肉琼脂平板计数，计算培养菌数，培养菌数的检测结果见表l。
实施例6
1、 一级斜面菌种制备副鸡嗜血杆菌菌种稀释接种鸡肉琼脂平板37°C培养23h，选典型菌落16个接种鸡肉琼脂斜面培养基，37°C培养24h，得到一级斜面菌种，放置4。C冰箱待用；
2、 二级菌种制备取一级斜面菌种接种于鸡肉汤培养基中全温振荡器37。C培养12h，纯检确认无菌后，得到二级菌种，备用；
3、 菌液培养将二级菌种接种到半合成培养基中用生物发酵罐进行培养；培养温度37°C,转速140r/min ,培养时间8h ;取样平板活菌计数，纯检确认无菌后，灭活,即得。
采用《兽用生物制品规程》活菌计数法，鸡肉琼脂平板计数，计算培养菌数，培养菌数的检测结果见表l。
实施例7
81、 一级斜面菌种制备副鸡嗜血杆菌菌种稀释接种鸡肉琼脂平板37°C培养 24h,选典型菌落17个接种鸡肉琼脂斜面培养基，37°C培养24h，得到一级斜面 菌种，放置4。C水箱待用；
2、 二级菌种制备取一级斜面菌种接种于鸡肉汤培养基中全温振荡器37。C培 养12h，纯检确认无菌后，得到二级菌种，备用；
3、 菌液培养将二级菌种接种到半合成培养基中用生物发酵罐进行培养；培 养温度37°C,转速190r/min ,培养时间8h ;取样平板活菌计数，纯检确 认无菌后，灭活，即得。
釆用《兽用生物制品规程》活菌计数法，鸡肉琼脂平板计数，计算培养菌 数，培养菌数的检测结果见表l。
实施例8
1、 一级斜面菌种制备副鸡嗜血杆菌菌种稀释接种鸡肉琼脂平板37°C培养 24h,选典型菌落18个接种鸡肉琼脂斜面培养基，37°C培养24h,得到一级斜面 菌种，放置4。C冰箱待用；
2、 二级菌种制备取一级斜面菌种接种于鸡肉汤培养基中全温振荡器37。C培 养12h，纯检确认无菌后，得到二级菌种，备用；
3、 菌液培养将二级菌种接种到半合成培养基中用生物发酵罐进行培养；培 养温度37°C,转速200r/min ,培养时间8h ;在发酵培养过程中，采用逐渐 加大通气量的方法；取样平板活菌计数，纯检确认无菌后，灭活，即得。培养菌数 的检测结果见表1。
釆用《兽用生物制品规程》活菌计数法，鸡肉琼脂平板计数，计算培养菌 数，培养菌数的检测结果见表l。对照实施例1
1、 一级菌种制备副鸡嗜血杆菌菌种划线接种鸡肉琼脂平板；在5%(302浓 度下37°C培养16h;选典型菌落接种5日龄鸡胚卵黄嚢内，37。C继续孵育，收集 30h以内死亡鸡胚卵黄液，纯检确认无菌后待用；
2、 二级菌种制备鸡胚卵黄液划线接种鸡肉琼脂平板，5%C02 37°C培养 16h ;选典型菌落"^妄种鸡肉汤培养基中37°C培养16h ，纯才企确认无菌后待用；
3、 菌液培养按2.5%的接种量接入到半合成培养基中；37。C培养18h ,其 间摇振培养瓶二次，取样活菌计数；纯检确认无菌后，灭活，即得。
釆用《兽用生物制品规程》活菌计数法，鸡肉琼脂平板计数，计算培养菌 数，培养菌数的检测结果见表l。
对照实施例2
1、 一级菌种制备副鸡嗜血杆菌菌种划线接种鸡肉琼脂平板；在10。/。CO2浓 度下37°C培养18h;选典型菌落接种5日龄鸡胚卵黄嚢内，37。C继续孵育，收集 30h以内死亡鸡胚卵黄液，纯检确i人无菌后待用；
2、 二级菌种制备鸡胚卵黄液划线接种鸡肉琼脂平板，10%CO2 37°C培养 18h ;选典型菌落"l秦种鸡肉汤培养基中37°C培养20h ,纯^^确认无菌后待用；
3、 菌液培养按2.5%的接种量接入到半合成培养基中；37。C培养20h ,其 间摇振培养瓶二次，取样活菌计数；纯检确认无菌后，灭活，即得。
采用《兽用生物制品规程》活菌计数法，鸡肉琼脂平板计数，计算培养菌 数，培养菌数的检测结果见表l。
对照实施例3
101、 一级菌种制备副鸡嗜血杆菌菌种划线接种鸡肉琼脂平板；在8% C02浓 度下37°C培养17h;选典型菌落接种5日龄鸡胚卵黄嚢内，37。C继续孵育，收集 30h以内死亡鸡胚卵黄液，纯检确认无菌后待用；
2、 二级菌种制备鸡胚卵黄液划线接种鸡肉琼脂平》反，8 %C02 37°C培养 18h ;选典型菌落接种鸡肉汤培养基中37°C培养16-20h ，纯检确认无菌后待 用；
3、 菌液培养按2.5%的接种量接入到半合成培养基中；37。C培养19h ,其 间摇振培养瓶二次，取样活菌计数；纯检确认无菌后，灭活，即得。
釆用《兽用生物制品规程》活菌计数法，鸡肉琼脂平板计数，计算培养菌 数，培养菌数的检测结果见表l。
对照实施例4
1、 一级菌种制备副鸡嗜血杆菌菌种划线接种鸡肉琼脂平板；在5%% C02 浓度下37°C培养18h;选典型菌落接种5日龄鸡胚卵黄嚢内，37。C继续孵育，收 集30h以内死亡鸡胚卵黄液，纯检确认无菌后待用；
2、 二级菌种制备鸡胚卯黄液划线接种鸡肉琼脂平板，5%C02 37°C培养 18h ;选典型菌落接种鸡肉汤培养基中37°C培养20h ，纯检确认无菌后待用；
3、 菌液培养按2.5%的接种量接入到半合成培养基中；37。C培养20h ,其 间摇振培养瓶二次，取样活菌计数；纯检确认无菌后，灭活，即得。
采用《兽用生物制品规程》活菌计数法，鸡肉琼脂平板计数，计算培养菌 数，培养菌数的检测结果见表l。
对照实施例51、 一级菌种制备副鸡嗜血杆菌菌种划线接种鸡肉琼脂平板；在10%(:02浓 度下37°C培养16h;选典型菌落接种5日龄鸡胚卵黄嚢内，37。C继续孵育，收集 30h以内死亡鸡胚卵黄液，纯检确i人无菌后待用；
2、 二级菌种制备鸡胚卵黄液划线接种鸡肉琼脂平板，10%CO2 37°C培养 16h ;选典型菌落接种鸡肉汤培养基中37°C培养16h ,纯检确认无菌后待用；
3、 菌液培养按2.5%的接种量接入到半合成培养基中；37。C培养18h ,其 间摇振培养瓶二次，取样活菌计数；纯检确认无菌后，灭活，即得。
采用《兽用生物制品规程》活菌计数法，鸡肉琼脂平板计数，计算培养菌 数，培养菌数的检测结果见表l。
对照实施例6
1、 一级菌种制备副鸡嗜血杆菌菌种划线接种鸡肉琼脂平板；在10。/。CO2浓 度下37°C培养17h;选典型菌落接种5日龄鸡胚卯黄嚢内，37。C继续孵育，收集 30h以内死亡鸡胚卵黄液，纯检确^人无菌后待用；
2、 二级菌种制备鸡胚卵黄液划线接种鸡肉琼脂平板，6%- C02 37°C培养 17h ;选典型菌落接种鸡肉汤培养基中37°C培养17h ,纯检确认无菌后待用；
3、 菌液培养按2.5%的接种量接入到半合成培养基中；37。C培养19h ,其 间摇振培养瓶二次，取样活菌计数；纯检确认无菌后，灭活，即得。
采用《兽用生物制品规程》活菌计数法，鸡肉琼脂平板计数，计算培养菌 数，培养菌数的检测结果见表l。
对照实施例7
1、 一级菌种制备副鸡嗜血杆菌菌种划线接种鸡肉琼脂平板；在9%0)2浓 度下37°C培养18h;选典型菌落接种5日龄鸡胚卵黄嚢内，37""C继续孵育，收集30h以内死亡鸡胚卵黄液，纯检确认无菌后待用；
2、 二级菌种制备鸡胚卵黄液划线接种鸡肉琼脂平板，9 %C02 37°C培养 16h ;选典型菌落接种鸡肉汤培养基中37°C培养16-20h ,纯检确认无菌后待 用；
3、 菌液培养按2.5%的接种量接入到半合成培养基中；37。C培养20h ,其 间摇振培养瓶二次，取样活菌计数；纯检确认无菌后，灭活，即得。
采用《兽用生物制品规程》活菌计数法，鸡肉琼脂平板计数，计算培养菌 数，培养菌数的检测结果见表l。
对照实施例8
1、 一级菌种制备副鸡嗜血杆菌菌种划线接种鸡肉琼脂平板；在7%032浓 度下37°C培养18h;选典型菌落接种5日龄鸡胚卵黄囊内，37。C继续孵育，收集 30h以内死亡鸡胚卵黄液，纯检确认无菌后待用；
2、 二级菌种制备鸡胚卵黄液划线接种鸡肉琼脂平板，10%CO2 37°C培养 18h ;选典型菌落接种鸡肉汤培养基中37°C培养17h ,纯检确认无菌后待用；
3、 菌液培养按2.5%的接种量接入到半合成培养基中；37。C培养19h ,其 间摇振培养瓶二次，取样活菌计数；纯检确认无菌后，灭活，即得。
采用《兽用生物制品规程》活菌计数法，鸡肉琼脂平板计数，计算培养菌 数，培养菌数的检测结果见表l。
对照实施例9
1、 一级菌种制备副鸡嗜血杆菌菌种划线接种鸡肉琼脂平板；在5%% C02 浓度下37°C培养17h;选典型菌落接种5日龄鸡胚卵黄囊内，37。C继续孵育，收 集30h以内死亡鸡胚卵黄液，纯检确认无菌后待用；2、 二级菌种制备鸡胚卵黄液划线接种鸡肉琼脂平板，9%C02 37°C培养 18h ;选典型菌落接种鸡肉汤培养基中37°C培养18h ，纯检确认无菌后待用；
3、 菌液培养按2.5%的接种量接入到半合成培养基中；37。C培养19h ，其 间摇振培养瓶二次，取样活菌计数；纯检确认无菌后，灭活，即得。
采用《兽用生物制品规程》活菌计数法，鸡肉琼脂平板计数，计算培养菌 数，培养菌数的检测结果见表1。
表l 采用《兽用生物制品规程》工艺培养和本发明方法培养菌数对比
采用《》见程》工艺培养方法本发明方法
培养菌数培养菌数
对照实施例128.5亿/ml实施例1369亿/ml
对照实施例231亿/ml实施例2402亿/ml
对照实施例313亿/ml实施例3390亿/ml
对照实施例417亿/ml实施例4264.5亿/ml
对照实施例516亿/ml实施例5389亿/ml
对照实施例612亿/ml实施例6378亿/ml
对照实施例719亿/ml实施例7355.5亿/ml
对照实施例811.5亿/ml实施例8405亿/ml
对照实施例914亿/ml平均369亿/ml
平均17.8亿ml
权利要求
1、一种鸡传染性鼻炎灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤(1)、制备一级斜面菌种将副鸡嗜血杆菌菌种稀释接种鸡肉琼脂平板，37℃培养22-24h；选典型菌落接种鸡肉琼脂斜面培养基，37℃培养24h，得到一级斜面菌种；(2)、制备二级菌种取一级斜面菌种接种于鸡肉汤培养基中37℃振荡培养12h，得到二级菌种，备用；(3)、菌液培养将二级菌种接种到半合成培养基中用生物发酵罐培养；确认无菌后，灭活，即得。
2、 按照权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1 )中选10-20个典型菌落接种鸡肉琼脂斜面培养基。
3、 按照权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中取一级斜面菌种接种于鸡肉汤培养基中采用全温振荡器37。C振荡培养12h。
4、 按照权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中，所述的培养条件为培养温度为37。C;转速为100-200r/min;培养时间为8h。
5、 按照权利要求1或4所述的方法，其特征在于步骤(3)中，在培养过程中，采用逐渐加大通气量的方法进行培养。
全文摘要
本发明公开了一种鸡传染性鼻炎灭活疫苗的制备方法，包括(1)将副鸡嗜血杆菌菌种稀释接种鸡肉琼脂平板，37℃培养22-24h；选典型菌落接种鸡肉琼脂斜面培养基，培养得到一级斜面菌种；(2)取一级斜面菌种接种于鸡肉汤培养基中37℃振荡培养12h，得到二级菌种；(3)将二级菌种接种到半合成培养基中用生物发酵罐培养；灭活，即得。本发明针对现有的鸡传染性鼻炎灭活疫苗的制备方法所存在的工艺复杂，生产成本高，产量低等缺陷，开展了改进生产工艺的研究工作，最终在培养方法上获得了重大突破。本发明方法操作简便可行，培养菌数相比于现有的方法有大幅度提高，培养时间也缩短了10-12h，有效降低了生产成本。
文档编号A61K39/02GK101648013SQ20091017007
公开日2010年2月17日 申请日期2009年9月2日 优先权日2009年9月2日
发明者付丽杰, 刘方悦, 金 吴, 尧 尹, 张明波, 张继东, 华 王 申请人:哈药集团生物疫苗有限公司
技术领域：
本发明涉及一种灭活疫苗的制备方法，尤其涉及鸡传染性鼻炎灭活疫苗的制备方法，属于灭活疫苗的制备领域。
背景技术：
鸡传染性鼻炎是由副鸡嗜血杆菌引起的 一种急性呼吸系统传染病，主要特征为眼和鼻粘膜发生不同程度炎症，发病率很高，可以引起幼鸡生长停滞和蛋鸡产
蛋量显著下降，8-12周龄的鸡和产蛋母鸡最常发生。此病分布于全世界，由于感染的产蛋鸡产蛋减少10%-40%,生长鸡增重停滞及淘汰鸡数增加，常造成严重经济损失。虽然此病可采用抗生素及磺胺类药物进行治疗，但会造成药物残留，据现地调查卯％以上的大型养鸡场均采用接种疫苗的方式来防治该病。
目前，国内一些生物制品生产厂家生产的鸡传染性鼻炎疫苗均为灭活疫苗。这些生产厂家均采用《兽用生物制品规程》工艺进行生产，其主要的工艺方法如下
1、 一级菌种制备菌种划线接种鸡肉琼脂平板；在5%-10% C02浓度下37°C培养16-18h;选典型菌落接种5日龄鸡胚卵黄嚢内，37。C继续孵育，收集30h以内死亡鸡胚卵黄液，经纯检确认无菌后待用；
2、 二级菌种制备鸡胚卵黄液划线接种鸡肉琼脂平板，5%- 10%CO2 37°C培养16-18h ;选典型菌落接种鸡肉汤培养基中37°C培养16-20h ，纯检确认无菌后待用；
3、 菌液培养按2.5%的接种量接入半合成培养基；37。C培养18-20h ,其间摇振培养瓶二次取样活菌计数；纯检确认无菌后，灭活，即得。
按照《兽用生物制品规程》进行生产所制备得到的灭活疫苗的培养菌数一般
都在30-40亿/ml,按照《兽用生物制品规程》50亿/ml配苗要求，需要对菌液进行浓缩处理。所以，现有的鸡传染性鼻炎灭活疫苗的制备方法存在工艺复杂，生产成本高，产量低等缺陷，有待改进。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有的鸡传染性鼻炎灭活疫苗的制备方法所存在的工艺复杂，生产成本高，产量低等缺陷，提供一种新的鸡传染性鼻炎灭活疫苗的制备方法，该制备方法具有工艺简捷，生产成本低，产量高等优点；
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的
一种鸡传染性鼻炎灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤
(1) 、制备一级斜面菌种将副鸡嗜血杆菌菌种稀释接种鸡肉琼脂平板，
37。C培养22-24h;选典型菌落接种鸡肉琼脂斜面培养基，37°C培养24h ,得到一级斜面菌种；
(2) 、制备二级菌种取一级斜面菌种接种于鸡肉汤培养基中(采用全温振荡器)37。C振荡培养12h,得到二级菌种，备用；
(3) 、菌液培养将二级菌种接种到半合成培养基中用生物发酵罐培养；确认无菌后，灭活，即得。
其中，为了达到更好的技术效果，在步骤(1)中选10-20个典型菌落接种鸡肉琼脂斜面培养基；
步骤(3)中，所述的发酵培养条件优选为培养温度为37°C;转速为100-200r/min;培养时间为8h;本发明人经过进一步的试验发现，在培养过程中，采用逐渐加大通气量的方法，能够显著提高培养菌数。本发明针对现有的鸡传染性鼻炎灭活疫苗的制备方法所存在的工艺复杂，生产成本高，产量低等缺陷，开展了改进生产工艺的研究工作，最终在培养方法上获得了重大突破。本发明方法操作简便可行，培养菌数相比于现有的方法有大幅
度提高，培养时间也缩短了 10-12h ，有效降低了生产成本。
具体实施例方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
1、 副鸡嗜血杆菌菌种购自中国兽医药品监察所。
2、 各培养基的具体组成成分(1)鸡肉琼脂平板鸡肉汁100ml、酪蛋白胨lg、氯化钠0.5g、琼脂粉1.5g、辅酶I0.05g、健康鸡血清10ml; (2)鸡肉琼脂斜面培养基成分与鸡肉琼脂平板相同；(3)鸡肉汤培养基鸡肉汁100ml、酪蛋白胨lg、氯化钠0.5g、辅酶l0.05g、健康鸡血清10ml; (4)半合成培养基多蛋白胨5g、酪蛋白胨30g、谷氨酸钠15g、酵母浸粉5g、葡萄糖3g、氯化钠15g、蒸馏水3000ml，调pH7.2-7.4、 115。C灭菌40分钟，使用前加入灭活的健康鸡血清30-60ml和0.5%辅酶I水溶液8-10ml。
实施例1
1、 一级斜面菌种制备副鸡嗜血杆菌菌种稀释接种鸡肉琼脂平板37°C培养22h,选典型菌落10个接种鸡肉琼脂斜面培养基，37°C培养24h,得到一级斜面菌种，放置4。C冰箱待用；2、 二级菌种制备取一级斜面菌种接种于鸡肉汤培养基中全温振荡器37。C培养12h,纯冲会确认无菌后，得到二级菌种，备用；
3、 菌液培养将二级菌种接种到半合成培养基中用生物发酵罐进行培养；培养温度37°C,转速100r/min ,培养时间8h ;取样平板活菌计数纯检确认无菌后，灭活,即得。
采用《兽用生物制品规程》活菌计数法，鸡肉琼脂平板计数，计算培养菌数，培养菌数的检测结果见表l。
实施例2
1、 一级斜面菌种制备副鸡嗜血杆菌菌种稀释接种鸡肉琼脂平板37°C培养24h，选典型菌落20个接种鸡肉琼脂斜面培养基，37°C培养24h,得到一级斜面菌种，放置4。C冰箱待用；
2、 二级菌种制备取一级斜面菌种接种于鸡肉汤培养基中全温振荡器37。C培养12h,纯检确认无菌后，得到二级菌种，备用；
3、 菌液培养将二级菌种接种到半合成培养基中用生物发酵罐进行培养；培养温度37°C，转速200r/min ，培养时间8h ;在发酵培养过程中，釆用逐渐加大通气量的方法；取样平板活菌计数纯检确认无菌后，灭活,即得。
采用《兽用生物制品规程》活菌计数法，鸡肉琼脂平板计数，计算培养菌数，培养菌数的检测结果见表l。
实施例3
1、 一级斜面菌种制备副鸡嗜血杆菌菌种稀释接种鸡肉琼脂平板37°C培养23h,选典型菌落15个接种鸡肉琼脂斜面培养基，37°C培养24h,得到一级斜面菌种，放置4。C水箱待用；
2、 二级菌种制备取一级斜面菌种接种于鸡肉汤培养基中全温振荡器37。C培养12h，纯检确认无菌后，得到二级菌种，备用；
3、 菌液培养将二级菌种接种到半合成培养基中用生物发酵罐进行培养；培养温度37°C,转速150r/min,培养时间8h;取样平板活菌计数纯检确认无菌后，灭活,即得。
采用《兽用生物制品规程》活菌计数法，鸡肉琼脂平板计数，计算培养菌数，培养菌数的检测结果见表l。
实施例4
1、 一级斜面菌种制备副鸡嗜血杆菌菌种稀释接种鸡肉琼脂平板37°C培养22h，选典型菌落20个接种鸡肉琼脂斜面培养基，37°C培养24h,得到一级斜面菌种，放置4。C水箱待用；
2、 二级菌种制备取一级斜面菌种接种于鸡肉汤培养基中全温振荡器37。C培养12h，纯检确认无菌后，得到二级菌种，备用；
3、 菌液培养将二级菌种接种到半合成培养基中用生物发酵罐进行培养；培养温度37°C，转速120r/min ,培养时间8h ;取样平板活菌计数，纯检确认无菌后，灭活,即得。
采用《兽用生物制品规程》活菌计数法，鸡肉琼脂平板计数，计算培养菌数，培养菌数的检测结果见表l。
实施例5
1、 一级斜面菌种制备副鸡嗜血杆菌菌种稀释接种鸡肉琼脂平板37°C培养200910170071
24h，选典型菌落10个接种鸡肉琼脂斜面培养基，37°C培养24h，得到一级斜面菌种，放置4°(3水箱待用；
2、 二级菌种制备取一级斜面菌种接种于鸡肉汤培养基中全温振荡器37。C培养12h,纯检确认无菌后，得到二级菌种，备用；
3、 菌液培养将二级菌种接种到半合成培养基中用生物发酵罐进行培养；培养温度37°C,转速180r/min ，培养时间8h ;取样平板活菌计数，纯检确认无菌后，灭活,即得。
采用《兽用生物制品规程》活菌计数法，鸡肉琼脂平板计数，计算培养菌数，培养菌数的检测结果见表l。
实施例6
1、 一级斜面菌种制备副鸡嗜血杆菌菌种稀释接种鸡肉琼脂平板37°C培养23h，选典型菌落16个接种鸡肉琼脂斜面培养基，37°C培养24h，得到一级斜面菌种，放置4。C冰箱待用；
2、 二级菌种制备取一级斜面菌种接种于鸡肉汤培养基中全温振荡器37。C培养12h，纯检确认无菌后，得到二级菌种，备用；
3、 菌液培养将二级菌种接种到半合成培养基中用生物发酵罐进行培养；培养温度37°C,转速140r/min ,培养时间8h ;取样平板活菌计数，纯检确认无菌后，灭活,即得。
采用《兽用生物制品规程》活菌计数法，鸡肉琼脂平板计数，计算培养菌数，培养菌数的检测结果见表l。
实施例7
81、 一级斜面菌种制备副鸡嗜血杆菌菌种稀释接种鸡肉琼脂平板37°C培养 24h,选典型菌落17个接种鸡肉琼脂斜面培养基，37°C培养24h，得到一级斜面 菌种，放置4。C水箱待用；
2、 二级菌种制备取一级斜面菌种接种于鸡肉汤培养基中全温振荡器37。C培 养12h，纯检确认无菌后，得到二级菌种，备用；
3、 菌液培养将二级菌种接种到半合成培养基中用生物发酵罐进行培养；培 养温度37°C,转速190r/min ,培养时间8h ;取样平板活菌计数，纯检确 认无菌后，灭活，即得。
釆用《兽用生物制品规程》活菌计数法，鸡肉琼脂平板计数，计算培养菌 数，培养菌数的检测结果见表l。
实施例8
1、 一级斜面菌种制备副鸡嗜血杆菌菌种稀释接种鸡肉琼脂平板37°C培养 24h,选典型菌落18个接种鸡肉琼脂斜面培养基，37°C培养24h,得到一级斜面 菌种，放置4。C冰箱待用；
2、 二级菌种制备取一级斜面菌种接种于鸡肉汤培养基中全温振荡器37。C培 养12h，纯检确认无菌后，得到二级菌种，备用；
3、 菌液培养将二级菌种接种到半合成培养基中用生物发酵罐进行培养；培 养温度37°C,转速200r/min ,培养时间8h ;在发酵培养过程中，采用逐渐 加大通气量的方法；取样平板活菌计数，纯检确认无菌后，灭活，即得。培养菌数 的检测结果见表1。
釆用《兽用生物制品规程》活菌计数法，鸡肉琼脂平板计数，计算培养菌 数，培养菌数的检测结果见表l。对照实施例1
1、 一级菌种制备副鸡嗜血杆菌菌种划线接种鸡肉琼脂平板；在5%(302浓 度下37°C培养16h;选典型菌落接种5日龄鸡胚卵黄嚢内，37。C继续孵育，收集 30h以内死亡鸡胚卵黄液，纯检确认无菌后待用；
2、 二级菌种制备鸡胚卵黄液划线接种鸡肉琼脂平板，5%C02 37°C培养 16h ;选典型菌落"^妄种鸡肉汤培养基中37°C培养16h ，纯才企确认无菌后待用；
3、 菌液培养按2.5%的接种量接入到半合成培养基中；37。C培养18h ,其 间摇振培养瓶二次，取样活菌计数；纯检确认无菌后，灭活，即得。
釆用《兽用生物制品规程》活菌计数法，鸡肉琼脂平板计数，计算培养菌 数，培养菌数的检测结果见表l。
对照实施例2
1、 一级菌种制备副鸡嗜血杆菌菌种划线接种鸡肉琼脂平板；在10。/。CO2浓 度下37°C培养18h;选典型菌落接种5日龄鸡胚卵黄嚢内，37。C继续孵育，收集 30h以内死亡鸡胚卵黄液，纯检确i人无菌后待用；
2、 二级菌种制备鸡胚卵黄液划线接种鸡肉琼脂平板，10%CO2 37°C培养 18h ;选典型菌落"l秦种鸡肉汤培养基中37°C培养20h ,纯^^确认无菌后待用；
3、 菌液培养按2.5%的接种量接入到半合成培养基中；37。C培养20h ,其 间摇振培养瓶二次，取样活菌计数；纯检确认无菌后，灭活，即得。
采用《兽用生物制品规程》活菌计数法，鸡肉琼脂平板计数，计算培养菌 数，培养菌数的检测结果见表l。
对照实施例3
101、 一级菌种制备副鸡嗜血杆菌菌种划线接种鸡肉琼脂平板；在8% C02浓 度下37°C培养17h;选典型菌落接种5日龄鸡胚卵黄嚢内，37。C继续孵育，收集 30h以内死亡鸡胚卵黄液，纯检确认无菌后待用；
2、 二级菌种制备鸡胚卵黄液划线接种鸡肉琼脂平》反，8 %C02 37°C培养 18h ;选典型菌落接种鸡肉汤培养基中37°C培养16-20h ，纯检确认无菌后待 用；
3、 菌液培养按2.5%的接种量接入到半合成培养基中；37。C培养19h ,其 间摇振培养瓶二次，取样活菌计数；纯检确认无菌后，灭活，即得。
釆用《兽用生物制品规程》活菌计数法，鸡肉琼脂平板计数，计算培养菌 数，培养菌数的检测结果见表l。
对照实施例4
1、 一级菌种制备副鸡嗜血杆菌菌种划线接种鸡肉琼脂平板；在5%% C02 浓度下37°C培养18h;选典型菌落接种5日龄鸡胚卵黄嚢内，37。C继续孵育，收 集30h以内死亡鸡胚卵黄液，纯检确认无菌后待用；
2、 二级菌种制备鸡胚卯黄液划线接种鸡肉琼脂平板，5%C02 37°C培养 18h ;选典型菌落接种鸡肉汤培养基中37°C培养20h ，纯检确认无菌后待用；
3、 菌液培养按2.5%的接种量接入到半合成培养基中；37。C培养20h ,其 间摇振培养瓶二次，取样活菌计数；纯检确认无菌后，灭活，即得。
采用《兽用生物制品规程》活菌计数法，鸡肉琼脂平板计数，计算培养菌 数，培养菌数的检测结果见表l。
对照实施例51、 一级菌种制备副鸡嗜血杆菌菌种划线接种鸡肉琼脂平板；在10%(:02浓 度下37°C培养16h;选典型菌落接种5日龄鸡胚卵黄嚢内，37。C继续孵育，收集 30h以内死亡鸡胚卵黄液，纯检确i人无菌后待用；
2、 二级菌种制备鸡胚卵黄液划线接种鸡肉琼脂平板，10%CO2 37°C培养 16h ;选典型菌落接种鸡肉汤培养基中37°C培养16h ,纯检确认无菌后待用；
3、 菌液培养按2.5%的接种量接入到半合成培养基中；37。C培养18h ,其 间摇振培养瓶二次，取样活菌计数；纯检确认无菌后，灭活，即得。
采用《兽用生物制品规程》活菌计数法，鸡肉琼脂平板计数，计算培养菌 数，培养菌数的检测结果见表l。
对照实施例6
1、 一级菌种制备副鸡嗜血杆菌菌种划线接种鸡肉琼脂平板；在10。/。CO2浓 度下37°C培养17h;选典型菌落接种5日龄鸡胚卯黄嚢内，37。C继续孵育，收集 30h以内死亡鸡胚卵黄液，纯检确^人无菌后待用；
2、 二级菌种制备鸡胚卵黄液划线接种鸡肉琼脂平板，6%- C02 37°C培养 17h ;选典型菌落接种鸡肉汤培养基中37°C培养17h ,纯检确认无菌后待用；
3、 菌液培养按2.5%的接种量接入到半合成培养基中；37。C培养19h ,其 间摇振培养瓶二次，取样活菌计数；纯检确认无菌后，灭活，即得。
采用《兽用生物制品规程》活菌计数法，鸡肉琼脂平板计数，计算培养菌 数，培养菌数的检测结果见表l。
对照实施例7
1、 一级菌种制备副鸡嗜血杆菌菌种划线接种鸡肉琼脂平板；在9%0)2浓 度下37°C培养18h;选典型菌落接种5日龄鸡胚卵黄嚢内，37""C继续孵育，收集30h以内死亡鸡胚卵黄液，纯检确认无菌后待用；
2、 二级菌种制备鸡胚卵黄液划线接种鸡肉琼脂平板，9 %C02 37°C培养 16h ;选典型菌落接种鸡肉汤培养基中37°C培养16-20h ,纯检确认无菌后待 用；
3、 菌液培养按2.5%的接种量接入到半合成培养基中；37。C培养20h ,其 间摇振培养瓶二次，取样活菌计数；纯检确认无菌后，灭活，即得。
采用《兽用生物制品规程》活菌计数法，鸡肉琼脂平板计数，计算培养菌 数，培养菌数的检测结果见表l。
对照实施例8
1、 一级菌种制备副鸡嗜血杆菌菌种划线接种鸡肉琼脂平板；在7%032浓 度下37°C培养18h;选典型菌落接种5日龄鸡胚卵黄囊内，37。C继续孵育，收集 30h以内死亡鸡胚卵黄液，纯检确认无菌后待用；
2、 二级菌种制备鸡胚卵黄液划线接种鸡肉琼脂平板，10%CO2 37°C培养 18h ;选典型菌落接种鸡肉汤培养基中37°C培养17h ,纯检确认无菌后待用；
3、 菌液培养按2.5%的接种量接入到半合成培养基中；37。C培养19h ,其 间摇振培养瓶二次，取样活菌计数；纯检确认无菌后，灭活，即得。
采用《兽用生物制品规程》活菌计数法，鸡肉琼脂平板计数，计算培养菌 数，培养菌数的检测结果见表l。
对照实施例9
1、 一级菌种制备副鸡嗜血杆菌菌种划线接种鸡肉琼脂平板；在5%% C02 浓度下37°C培养17h;选典型菌落接种5日龄鸡胚卵黄囊内，37。C继续孵育，收 集30h以内死亡鸡胚卵黄液，纯检确认无菌后待用；2、 二级菌种制备鸡胚卵黄液划线接种鸡肉琼脂平板，9%C02 37°C培养 18h ;选典型菌落接种鸡肉汤培养基中37°C培养18h ，纯检确认无菌后待用；
3、 菌液培养按2.5%的接种量接入到半合成培养基中；37。C培养19h ，其 间摇振培养瓶二次，取样活菌计数；纯检确认无菌后，灭活，即得。
采用《兽用生物制品规程》活菌计数法，鸡肉琼脂平板计数，计算培养菌 数，培养菌数的检测结果见表1。
表l 采用《兽用生物制品规程》工艺培养和本发明方法培养菌数对比
采用《》见程》工艺培养方法本发明方法
培养菌数培养菌数
对照实施例128.5亿/ml实施例1369亿/ml
对照实施例231亿/ml实施例2402亿/ml
对照实施例313亿/ml实施例3390亿/ml
对照实施例417亿/ml实施例4264.5亿/ml
对照实施例516亿/ml实施例5389亿/ml
对照实施例612亿/ml实施例6378亿/ml
对照实施例719亿/ml实施例7355.5亿/ml
对照实施例811.5亿/ml实施例8405亿/ml
对照实施例914亿/ml平均369亿/ml
平均17.8亿ml
权利要求
1、一种鸡传染性鼻炎灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤(1)、制备一级斜面菌种将副鸡嗜血杆菌菌种稀释接种鸡肉琼脂平板，37℃培养22-24h；选典型菌落接种鸡肉琼脂斜面培养基，37℃培养24h，得到一级斜面菌种；(2)、制备二级菌种取一级斜面菌种接种于鸡肉汤培养基中37℃振荡培养12h，得到二级菌种，备用；(3)、菌液培养将二级菌种接种到半合成培养基中用生物发酵罐培养；确认无菌后，灭活，即得。
2、 按照权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1 )中选10-20个典型菌落接种鸡肉琼脂斜面培养基。
3、 按照权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中取一级斜面菌种接种于鸡肉汤培养基中采用全温振荡器37。C振荡培养12h。
4、 按照权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中，所述的培养条件为培养温度为37。C;转速为100-200r/min;培养时间为8h。
5、 按照权利要求1或4所述的方法，其特征在于步骤(3)中，在培养过程中，采用逐渐加大通气量的方法进行培养。
全文摘要
本发明公开了一种鸡传染性鼻炎灭活疫苗的制备方法，包括(1)将副鸡嗜血杆菌菌种稀释接种鸡肉琼脂平板，37℃培养22-24h；选典型菌落接种鸡肉琼脂斜面培养基，培养得到一级斜面菌种；(2)取一级斜面菌种接种于鸡肉汤培养基中37℃振荡培养12h，得到二级菌种；(3)将二级菌种接种到半合成培养基中用生物发酵罐培养；灭活，即得。本发明针对现有的鸡传染性鼻炎灭活疫苗的制备方法所存在的工艺复杂，生产成本高，产量低等缺陷，开展了改进生产工艺的研究工作，最终在培养方法上获得了重大突破。本发明方法操作简便可行，培养菌数相比于现有的方法有大幅度提高，培养时间也缩短了10-12h，有效降低了生产成本。
文档编号A61K39/02GK101648013SQ20091017007
公开日2010年2月17日 申请日期2009年9月2日 优先权日2009年9月2日
发明者付丽杰, 刘方悦, 金 吴, 尧 尹, 张明波, 张继东, 华 王 申请人:哈药集团生物疫苗有限公司
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