脐带华通胶来源的间充质干细胞在心力衰竭细胞移植治疗中的应用的制作方法
专利名称：脐带华通胶来源的间充质干细胞在心力衰竭细胞移植治疗中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物材料在医疗领域的用途，特别涉及以人脐带华通胶为原料制备
的间充质干细胞，在制备因冠心病及扩张性心肌病引起的心力衰竭细胞移植材料方面的 应用。
背景技术：
全球每年有约1700万人死于心血管疾病。虽然随着药物治疗、介入技术和外科 手术水平的提高，急性心肌梗死的病死率明显下降，但循证医学发现，即使早期成功接 受再血管化治疗的急性心肌梗死患者中，仍有超过30%的患者发展为缺血性心力衰竭， 甚至进一步发展为终末期缺血性心力衰竭。终末期缺血性心力衰竭是指①有心肌梗死 史；②有严重心力衰竭临床表现并反复住院；③强化内科药物治疗无效；④无内科介入 及外科搭桥手术指征；⑤左心室射血分数(LVEF)小于40% 。终末期缺血性心力衰竭年 死亡率在60%以上。对终末期缺血性心力衰竭所能采取的治疗手段仅有两项①心脏移 植；②安装心室辅助装置。心脏移植因为手术耐受、供体、免疫排斥等原因不可能广泛 使用；安装心室辅助装置则仅适用于短期支持过渡期严重血液动力学障碍急性患者，不 能长期维持应用。因此，当前国际医学界尚无有效方法逆转终末期缺血性心力衰竭患者 的病情。 除缺血性心脏病所致的心力衰竭，扩张性心肌病是慢性心力衰竭又一常见原 因，其中包括病因不清的特发性心肌病和继发于心肌炎后的心肌病。扩张性心肌病引起 的慢性心力衰竭l年病死率约25-30%，心脏移植是唯一有效治疗措施。由于受供体来源 和技术的限制，全球心脏移植每年只有三千余例，中国仅数十例。 当代细胞生物学的发展给这些慢性心力衰竭患者带来了新的希望。临床研究发 现，自体骨髓单个核细胞、自体骨髓间充质干细胞，以及内皮祖细胞、骨髓侧群细胞等 成体干细胞移植治疗缺血性心力衰竭、陈旧性心肌梗死及心肌梗死后心衰，可以不同程 度改善心脏收縮和舒张功能、阻止左室重构、改善预后。 然而，细胞疗法在临床应用中遇到了来自种子细胞的重重障碍应用胚胎干细 胞存在伦理、法律、免疫排斥及致肿瘤性等问题；应用自体成体干细胞遇到更多问题， 诸如①骨髂肌成肌细胞移植存在严重致心律失常性；②骨髓单个核细胞移植成分复杂， 所含具有多向分化潜能的干细胞数量低，分化潜能有限；③造血干细胞CD34不能分化 为心肌细胞表型；④CD133细胞移植可致冠脉支架再狭窄；⑤内皮祖细胞改善心功能作 用有限；⑥骨髓间充质干细胞(MSCs)材料来源受限，细胞增殖分化潜能随年龄的增长 而明显下降，尤其是冠心病患者MSCs增殖分化能力明显低于同龄健康人，体外长时间 扩增降低体内分化归巢潜能；⑦与自体MSCs相比，脐血MSCs有诸多优点，但脐血源 MSCs分离效率低，限制了其广泛应用。总之，当前尚无一种理想的种子细胞满足对这些 慢性心力衰竭患者实施细胞生物学治疗的临床需求，需要突破的技术瓶颈是解决多能干
3细胞的来源。 本发明人的在先专利申请"200910157731.6脐带华通胶间充质干细胞的制备方 法及其产品"为心力衰竭患者实施细胞生物学治疗提供了新的物质基础。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，将脐带华通胶来源的间充质干细胞应用于因冠心 病及扩张性心肌病引起的慢性心力衰竭患者，作为对其实施细胞移植治疗的材料，用以 改善以上这些慢性心力衰竭患者的生存质量，降低死亡率；同时克服冠心病及老年患者 自体干细胞分化增殖及旁/自分泌功能减低不能达到有效的生物学效应的缺陷。
本发明所称"脐带华通胶来源的间充质干细胞"，英文名称为"Umbilical Cord Wharton' s Jelly-Derived MSCs， UW-MSCs"，是按以下方法制备的
取人新鲜脐带，以等渗的平衡盐溶液或无血清培养基洗去脐带残留血液，去除 脐动脉、脐静脉及脐带外膜，剥离华通胶并剪切成小块，再以等渗的平衡盐溶液或无血 清培养液冲洗后，浸泡于0.05 0.3%胶原酶溶液中，置于35 37.5t:温箱中10 30 小时，组织块消化，液体呈粘稠状，然后加入相当于原液1 10倍量的含胎牛血清的培 养基终止消化，分装于培养瓶或培养皿，置CC^培养箱，待细胞贴壁后更换含胎牛血清 的培养基溶液，以后每隔2 4天换液一次，细胞贴壁融合后传代培养；传代培养2 4 代，即时使用或冷冻保存备用。 本发明所称"脐带华通胶来源的间充质干细胞"在生物学表型鉴定中，具有以 下技术特征①在标准培养条件下粘附于塑料制培养器皿生长；②表达CD90、 CD105、 CD44 ; HLA-ABC ;不表达CD45、 CD34， HLA-DR ;③体外可诱导分化为成骨细胞和 脂肪细胞。 本发明方法所用细胞移植材料，可以即时使用刚刚完成传代培养2-4代的
UW-MSCs新鲜品，也可以使用冷冻保存的传2-4代UW-MSCs备用品。 本发明所称"因冠心病及扩张性心肌病引起的心力衰竭"包括心力衰竭的两个
类别 一类为因冠心病引起的心力衰竭，包括慢性缺血性心力衰竭(Chronic ischemic heart
failure, CIHF)及终末期缺血性心力衰竭(end-stage ischemic heart failure, EIHF);另一类
为扩张性心肌病引起的心力衰竭，包括原发性扩张性心肌病及心肌炎后继发心肌病所致
心力衰竭。 应用本发明方法，移植UW-MSCs手术方法有①经静脉快速注入UW-MSCs悬 液；②经冠状动脉超选择性移植UW-MSCs ;③经冠状动脉选择性移植UW-MSCs ; 经 心内膜心肌注射器直接心肌注射移植UW-MSCs。 本发明UW-MSCs移植治疗冠心病心肌梗死后及扩张性心肌病所致慢性心力衰竭 的机理是利用UW-MSCs较自体干细胞更强的自我更新及多向分化潜能，及归巢与旁/ 自分泌功能，释放大量生物因子，促进血管和心肌再生等生物学效应来修复心肌和改善心 功能，改善这些慢性心力衰竭患者的近期和远期预后。 本发明所应用的脐带华通胶来源的间充质干细胞，其性能介于胚胎干细胞与成 体干细胞之间，以其替代患者自体干细胞应用于治疗心力衰竭，解决了目前细胞疗法中 困扰医学界的多个问题，如①胚胎干细胞存在的伦理道德、法律、免疫排斥及致肿瘤
4性等问题；②成体干细胞存在的分化增殖归巢能力低及制备周期长等缺陷；③冠心病患 者抽取自体骨髓医从性差、MSCs增殖能力差、剂量不足等问题；④免去体外过长时间 培养及病人长时间等待；⑤可以从根本上改善冠心病心肌梗死后及扩张性心肌病等所致 的慢性心力衰竭患者的预后，尤其是解决该病高死亡率问题。
具体实施例方式
以下通过实施例对本发明作进一步说明。 实施例1 UW-MSCs移植材料的准备——应用UW-MSCs新鲜品
将刚刚完成传代培养2-4代的脐带华通胶间充质干细胞新鲜品，以0.05-0.25%胰 酶消化l-5分钟，血清中和，平衡盐溶液洗涤3遍，离心机的离心力控制在100-1000g， 应用含0-100单位肝素/毫升0.9%氯化钠注射液重悬使用。 实施例2 UW-MSCs移植材料的准备——应用冷冻保存的UW-MSCs备用品
从低温容器中取出冻存的传2-4代脐带华通胶间充质干细胞，迅速放入35-38t: 温箱及水浴箱中，2分钟内溶化，使用完全培养基溶液重悬细胞，培养2-4天细胞融合后 重新消化、洗涤细胞，使用浓度为"肝素1000单位0.9%氯化钠溶液100毫升"的肝 素氯化钠注射液，制成细胞浓度为l-2X106/ml的细胞悬液，通常按每支10毫升包装。
实施例3经静脉移植UW-MSCs手术方法 将2 X 107UW-MSCs悬液稀释在20ml肝素盐水中(肝素200单位+生理盐水20ml) 从静脉快速注入。 实施例4经冠状动脉超选择性移植UW-MSCs手术方法 对于冠心病慢性缺血性心力衰竭患者在冠脉闭塞血管经PCI术血管再通后执 行，将超长(3m)BMW导丝置于闭塞重建血管远端，沿导丝插入穿导丝球囊置于梗死闭塞 段血管；对于扩张性心肌病慢性心力衰竭者直接将超长(3m)BMW导丝置于左或右优势 冠脉血管远端，沿导丝插入穿导丝球囊置于优势冠脉血管中远端之交界处，抽出导丝， 连结压力泵，充盈球囊4-8个大气压不等，扩张性心肌病患者球囊充盈以不贴血管壁为原 则，冠心病心衰者以阻断前向血流为标准，高压快速注入2ml含4Xl()6uW-MSCs(2X106 个/ml)细胞悬液，气囊保持充盈lmin后恢复灌注，2min后再次重复上述方法注入 UW-MSCs，共注入5 6次。术中密切心电、血液动力学监测。
实施例5经冠状动脉选择性移植UW-MSCs 采用不进行球囊充盈闭塞的相关冠脉，在梗死相关动脉入口，或左右冠状动脉 主干入口处，或逆灌注血管、侧支血管、桥血管等处同样分次高压注入UW-MSCs，细胞
量同实施例4。 此手术方法适用于部分严重冠心病慢性心力衰竭患者。
实施例6经心内膜直接心肌注射移植UW-MSCs手术方法 应用中国微创公司生产的心肌注射器，经股动脉穿剌插入7F心肌旋转注射器经 主动脉插入左室，在超声心动图声学造影及电机械标测双定位下确定梗死心肌部位，于5 个位点共2xl07UW-MSCs细胞数注入梗死心肌周围。 此手术方法适用于冠心病慢性心力衰竭未能血管重建者及部分扩张性心肌病慢 性心力衰竭者。
5
实验例l UW-MSCs体内外向心肌细胞分化及功能鉴定 纯化3代UW-MSCs用DAPI染色标记后用5-氮胞苷诱导分化，2周后行免疫 荧光染色，共聚焦显微镜下检测发现，在DAPI染色阳性的UW-MSCs可分化为具有心 肌细胞表型特征的心肌样细胞，与DAPI共表达肌钙蛋白(TnT)、肌动蛋白(a-actin)、 GATA-4、 connexin-43。进一步在体内，在大鼠缺血性心力衰竭模型上，将绿色荧光蛋白 基因(EGFP)转染UW-MSCs作为UW-MSCs标记，将1 X 106UW-MSCs-EGFP注入大鼠梗 死心肌周围，4周后心肌组织冷冻切片，免疫荧光共聚焦显微镜检测，可见原梗死心肌组 织中有EGFP标记的移植细胞UW-MSCs存活生长及分化，EGFP阳性的移植细胞与EGFP 共表达肌钙蛋白(TnT)、肌动蛋白(aactin)、 GATA-4、 connexin-43等心肌细胞表型标志。 为了进一步鉴定UW-MSCs移植后整体心功能效应，于AMI制备后及UW-MSCs移植后应 用2维超声心动图进行动态心功能监测，结果显示，UW-MSCs移植后7天LVEF绝对值 增加5.3%、 28天增加6.8%，短轴縮短率亦明显增加，而对照组心功能恶化，应用TTC 染色心肌梗死范囲明显縮小。
实验例2 UW-MSCs免疫源性鉴定 本发明将UW-MSCs作细胞移植材料，与自体BMSCs所不同的是，采用的是同 种异体干细胞作为种子细胞来源，即异基因种子细胞。异基因种子细胞移植的关键是移 植免疫学问题，此也是本发明实用性所系。为此，发明人进行了系统的UW-MSCs体内 外免疫源性鉴定。 体外实验以流式细胞仪进行UW-MSCs免疫表型鉴定，结果为UW-MSCs仅 表达HLA-ABC，不表达HLA-II类抗源HLA-DR及协同剌激抗源CD80， CD86，表明 UW-MSCs体外无免疫源性。 UW-MSCs移植后进行整体免疫学观察，观察项目和结果为①动态混合淋巴 细胞培养试验发现UW-MSCs对异体淋巴细胞有明显抑制增殖反应；②外周血T细胞亚 群检测，流式细胞仪动态检测移植后大鼠周围血T淋巴细胞CD3、 CD4、 CD8变化， UW-MSCs均无剌激增加；③局部组织病理学检测光镜检测UW-MSCs移植区域心肌组 织未见淋巴细胞、巨噬细胞增殖侵润等心肌组织免疫反应性变化。
实验例3 UW-MSCs移植对动物模型心肌恢复作用实验 大鼠给盐酸氯胺酮10mg/kg、速眠新80mg/kg腹腔注射麻醉，气管插管人工呼吸 支持下，于左3-4肋间逐层切开，暴露左心耳与肺动脉交界前室间沟，7-0丝线模穿冠状 动脉左前降支近段全层结扎，显示左室前壁心肌变紫黑色，局部心电图显示ST段-T明显 抬高，为AMI模型成功。于AMI后5天，应用2-D超声心动图检测确定左室射血分 数(LVEF) < 50%为心衰模型成功。心衰大鼠分两组①UW-MSCs移植组；②对照生 理盐水注射组。于AMI后7天，将经ad-EGFP基因转染的1X 106UW-MSCs分5点注入 梗死心肌周围。 大鼠存活4周末行2-D超声心动图检测，UW-MSCs移植组心衰大鼠心功能明 显改善，其左室射血分数(LVEF)较移植前绝对值平均增加10.2±2.3% (n = 8)，对照组 LVEF减低2.7±0.8% (n = 8)， 二组相比P < 0.01 ;左室短轴縮短率UW-MSCs移植组 较术前增加绝对值3.9%，对照组减低4.5， 二者相比P〈0.01， UW-MSCs移植后左室舒 张末容量减低，但与对照组未构成统计学差异。
大鼠存活5周处理，UW-MSCs移植心衰大鼠及对照组心衰大鼠心肌组织冷冻 切片，免疫荧光共聚焦显微镜检测，可见原梗死组织中有EGFP标记-UW-MSCs分化的 心肌样细胞存在，EGFP阳性心肌样细胞共表达肌钙蛋白(TnT)、肌动蛋白(a-actin)、 GATA-4、 connexin-43等心肌细胞表型标志。
实验例4临床应用典型病例 患者李某，男性，71岁，发作性心前区闷痛10余年，冠脉造影为3支病变，于 2007年11月行搭桥术，术后6月出现活动时呼吸困难，逐渐加重，发作夜间阵发性呼吸 困难，后进展为夜间不能平卧，双下肢无水肿，活动严重受限，左室射血分数29%，经 优化内科药物治疗无效。于2009年6月18日予UW-MSCs 6xl06静注，后2周，心功能 LVEF由29%升至42%， 6分钟步行试验由原20米至450米，病人夜间平卧入睡，再无 夜间阵发性呼吸困难发作。UW-MSCs细胞移植后2月，可每日散步1小时。
权利要求
脐带华通胶来源的间充质干细胞作为治疗因冠心病及扩张性心肌病引起的心力衰竭细胞移植材料的应用。
2. 权利要求1所述因冠心病引起的心力衰竭为慢性缺血性心力衰竭。
3. 权利要求1所述因冠心病引起的心力衰竭为终末期缺血性心力衰竭。
4. 权利要求1所述因扩张性心肌病引起的心力衰竭为原发性扩张性心肌病所致心力衰竭。
5. 权利要求1所述因扩张性心肌病引起的心力衰竭为心肌炎后继发心肌病所致心力衰竭。
6. 根据权利要求1所述的脐带华通胶间充质干细胞的用途，其特征在于，所用细胞移 植材料为完成2-4代传代培养的脐带华通胶间充质干细胞新鲜品。
7. 根据权利要求1所述的脐带华通胶间充质干细胞的用途，其特征在于，所用细胞移 植材料为经传代培养2-4代的脐带华通胶间充质干细胞冷冻保存品。
8. 根据权利要求7所述的脐带华通胶间充质干细胞的用途，其特征在于，使用冷冻保 存的脐带华通胶间充质干细胞的方法是，从低温容器中取出冻存的细胞迅速放入35-38°C 温箱及水浴箱中，2分钟内溶化，使用完全培养基溶液重悬细胞，培养2-4天细胞融合后 重新消化、洗涤细胞，使用浓度为"肝素1000单位0.9%氯化钠溶液100毫升"的肝 素氯化钠注射液制成细胞浓度为l-2X106/ml的脐带华通胶间充质干细胞悬液。
9. 根据权利要求6或7所述脐带华通胶间充质干细胞的用途，其特征在于，经冠状动 脉超选择性移植或超选择性移植，每次注入4X10e脐带华通胶间充质干细胞，间断注射 5 6次。
10. 根据权利要求6或7所述脐带华通胶间充质干细胞的用途，其特征在于，经心内 膜直接心肌注射移植，于5个位点共注入2X 107脐带华通胶间充质干细胞。
全文摘要
本发明涉及脐带华通胶来源的间充质干细胞作为治疗因冠心病及扩张性心肌病引起的心力衰竭细胞移植材料的应用，包括心肌梗死后引起的慢性缺血性心力衰竭、终末期缺血性心力衰竭，及原发性扩张性心肌病和心肌炎后继发心肌病所致的心力衰竭。
文档编号A61P9/04GK101690731SQ200910170248
公开日2010年4月7日 申请日期2009年9月9日 优先权日2009年9月9日
发明者丁青艾, 张宁坤, 曹毅, 朱智明, 杨晔, 陈宇, 高连如 申请人:中国人民解放军海军总医院
技术领域：
本发明涉及生物材料在医疗领域的用途，特别涉及以人脐带华通胶为原料制备
的间充质干细胞，在制备因冠心病及扩张性心肌病引起的心力衰竭细胞移植材料方面的 应用。
背景技术：
全球每年有约1700万人死于心血管疾病。虽然随着药物治疗、介入技术和外科 手术水平的提高，急性心肌梗死的病死率明显下降，但循证医学发现，即使早期成功接 受再血管化治疗的急性心肌梗死患者中，仍有超过30%的患者发展为缺血性心力衰竭， 甚至进一步发展为终末期缺血性心力衰竭。终末期缺血性心力衰竭是指①有心肌梗死 史；②有严重心力衰竭临床表现并反复住院；③强化内科药物治疗无效；④无内科介入 及外科搭桥手术指征；⑤左心室射血分数(LVEF)小于40% 。终末期缺血性心力衰竭年 死亡率在60%以上。对终末期缺血性心力衰竭所能采取的治疗手段仅有两项①心脏移 植；②安装心室辅助装置。心脏移植因为手术耐受、供体、免疫排斥等原因不可能广泛 使用；安装心室辅助装置则仅适用于短期支持过渡期严重血液动力学障碍急性患者，不 能长期维持应用。因此，当前国际医学界尚无有效方法逆转终末期缺血性心力衰竭患者 的病情。 除缺血性心脏病所致的心力衰竭，扩张性心肌病是慢性心力衰竭又一常见原 因，其中包括病因不清的特发性心肌病和继发于心肌炎后的心肌病。扩张性心肌病引起 的慢性心力衰竭l年病死率约25-30%，心脏移植是唯一有效治疗措施。由于受供体来源 和技术的限制，全球心脏移植每年只有三千余例，中国仅数十例。 当代细胞生物学的发展给这些慢性心力衰竭患者带来了新的希望。临床研究发 现，自体骨髓单个核细胞、自体骨髓间充质干细胞，以及内皮祖细胞、骨髓侧群细胞等 成体干细胞移植治疗缺血性心力衰竭、陈旧性心肌梗死及心肌梗死后心衰，可以不同程 度改善心脏收縮和舒张功能、阻止左室重构、改善预后。 然而，细胞疗法在临床应用中遇到了来自种子细胞的重重障碍应用胚胎干细 胞存在伦理、法律、免疫排斥及致肿瘤性等问题；应用自体成体干细胞遇到更多问题， 诸如①骨髂肌成肌细胞移植存在严重致心律失常性；②骨髓单个核细胞移植成分复杂， 所含具有多向分化潜能的干细胞数量低，分化潜能有限；③造血干细胞CD34不能分化 为心肌细胞表型；④CD133细胞移植可致冠脉支架再狭窄；⑤内皮祖细胞改善心功能作 用有限；⑥骨髓间充质干细胞(MSCs)材料来源受限，细胞增殖分化潜能随年龄的增长 而明显下降，尤其是冠心病患者MSCs增殖分化能力明显低于同龄健康人，体外长时间 扩增降低体内分化归巢潜能；⑦与自体MSCs相比，脐血MSCs有诸多优点，但脐血源 MSCs分离效率低，限制了其广泛应用。总之，当前尚无一种理想的种子细胞满足对这些 慢性心力衰竭患者实施细胞生物学治疗的临床需求，需要突破的技术瓶颈是解决多能干
3细胞的来源。 本发明人的在先专利申请"200910157731.6脐带华通胶间充质干细胞的制备方 法及其产品"为心力衰竭患者实施细胞生物学治疗提供了新的物质基础。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，将脐带华通胶来源的间充质干细胞应用于因冠心 病及扩张性心肌病引起的慢性心力衰竭患者，作为对其实施细胞移植治疗的材料，用以 改善以上这些慢性心力衰竭患者的生存质量，降低死亡率；同时克服冠心病及老年患者 自体干细胞分化增殖及旁/自分泌功能减低不能达到有效的生物学效应的缺陷。
本发明所称"脐带华通胶来源的间充质干细胞"，英文名称为"Umbilical Cord Wharton' s Jelly-Derived MSCs， UW-MSCs"，是按以下方法制备的
取人新鲜脐带，以等渗的平衡盐溶液或无血清培养基洗去脐带残留血液，去除 脐动脉、脐静脉及脐带外膜，剥离华通胶并剪切成小块，再以等渗的平衡盐溶液或无血 清培养液冲洗后，浸泡于0.05 0.3%胶原酶溶液中，置于35 37.5t:温箱中10 30 小时，组织块消化，液体呈粘稠状，然后加入相当于原液1 10倍量的含胎牛血清的培 养基终止消化，分装于培养瓶或培养皿，置CC^培养箱，待细胞贴壁后更换含胎牛血清 的培养基溶液，以后每隔2 4天换液一次，细胞贴壁融合后传代培养；传代培养2 4 代，即时使用或冷冻保存备用。 本发明所称"脐带华通胶来源的间充质干细胞"在生物学表型鉴定中，具有以 下技术特征①在标准培养条件下粘附于塑料制培养器皿生长；②表达CD90、 CD105、 CD44 ; HLA-ABC ;不表达CD45、 CD34， HLA-DR ;③体外可诱导分化为成骨细胞和 脂肪细胞。 本发明方法所用细胞移植材料，可以即时使用刚刚完成传代培养2-4代的
UW-MSCs新鲜品，也可以使用冷冻保存的传2-4代UW-MSCs备用品。 本发明所称"因冠心病及扩张性心肌病引起的心力衰竭"包括心力衰竭的两个
类别 一类为因冠心病引起的心力衰竭，包括慢性缺血性心力衰竭(Chronic ischemic heart
failure, CIHF)及终末期缺血性心力衰竭(end-stage ischemic heart failure, EIHF);另一类
为扩张性心肌病引起的心力衰竭，包括原发性扩张性心肌病及心肌炎后继发心肌病所致
心力衰竭。 应用本发明方法，移植UW-MSCs手术方法有①经静脉快速注入UW-MSCs悬 液；②经冠状动脉超选择性移植UW-MSCs ;③经冠状动脉选择性移植UW-MSCs ; 经 心内膜心肌注射器直接心肌注射移植UW-MSCs。 本发明UW-MSCs移植治疗冠心病心肌梗死后及扩张性心肌病所致慢性心力衰竭 的机理是利用UW-MSCs较自体干细胞更强的自我更新及多向分化潜能，及归巢与旁/ 自分泌功能，释放大量生物因子，促进血管和心肌再生等生物学效应来修复心肌和改善心 功能，改善这些慢性心力衰竭患者的近期和远期预后。 本发明所应用的脐带华通胶来源的间充质干细胞，其性能介于胚胎干细胞与成 体干细胞之间，以其替代患者自体干细胞应用于治疗心力衰竭，解决了目前细胞疗法中 困扰医学界的多个问题，如①胚胎干细胞存在的伦理道德、法律、免疫排斥及致肿瘤
4性等问题；②成体干细胞存在的分化增殖归巢能力低及制备周期长等缺陷；③冠心病患 者抽取自体骨髓医从性差、MSCs增殖能力差、剂量不足等问题；④免去体外过长时间 培养及病人长时间等待；⑤可以从根本上改善冠心病心肌梗死后及扩张性心肌病等所致 的慢性心力衰竭患者的预后，尤其是解决该病高死亡率问题。
具体实施例方式
以下通过实施例对本发明作进一步说明。 实施例1 UW-MSCs移植材料的准备——应用UW-MSCs新鲜品
将刚刚完成传代培养2-4代的脐带华通胶间充质干细胞新鲜品，以0.05-0.25%胰 酶消化l-5分钟，血清中和，平衡盐溶液洗涤3遍，离心机的离心力控制在100-1000g， 应用含0-100单位肝素/毫升0.9%氯化钠注射液重悬使用。 实施例2 UW-MSCs移植材料的准备——应用冷冻保存的UW-MSCs备用品
从低温容器中取出冻存的传2-4代脐带华通胶间充质干细胞，迅速放入35-38t: 温箱及水浴箱中，2分钟内溶化，使用完全培养基溶液重悬细胞，培养2-4天细胞融合后 重新消化、洗涤细胞，使用浓度为"肝素1000单位0.9%氯化钠溶液100毫升"的肝 素氯化钠注射液，制成细胞浓度为l-2X106/ml的细胞悬液，通常按每支10毫升包装。
实施例3经静脉移植UW-MSCs手术方法 将2 X 107UW-MSCs悬液稀释在20ml肝素盐水中(肝素200单位+生理盐水20ml) 从静脉快速注入。 实施例4经冠状动脉超选择性移植UW-MSCs手术方法 对于冠心病慢性缺血性心力衰竭患者在冠脉闭塞血管经PCI术血管再通后执 行，将超长(3m)BMW导丝置于闭塞重建血管远端，沿导丝插入穿导丝球囊置于梗死闭塞 段血管；对于扩张性心肌病慢性心力衰竭者直接将超长(3m)BMW导丝置于左或右优势 冠脉血管远端，沿导丝插入穿导丝球囊置于优势冠脉血管中远端之交界处，抽出导丝， 连结压力泵，充盈球囊4-8个大气压不等，扩张性心肌病患者球囊充盈以不贴血管壁为原 则，冠心病心衰者以阻断前向血流为标准，高压快速注入2ml含4Xl()6uW-MSCs(2X106 个/ml)细胞悬液，气囊保持充盈lmin后恢复灌注，2min后再次重复上述方法注入 UW-MSCs，共注入5 6次。术中密切心电、血液动力学监测。
实施例5经冠状动脉选择性移植UW-MSCs 采用不进行球囊充盈闭塞的相关冠脉，在梗死相关动脉入口，或左右冠状动脉 主干入口处，或逆灌注血管、侧支血管、桥血管等处同样分次高压注入UW-MSCs，细胞
量同实施例4。 此手术方法适用于部分严重冠心病慢性心力衰竭患者。
实施例6经心内膜直接心肌注射移植UW-MSCs手术方法 应用中国微创公司生产的心肌注射器，经股动脉穿剌插入7F心肌旋转注射器经 主动脉插入左室，在超声心动图声学造影及电机械标测双定位下确定梗死心肌部位，于5 个位点共2xl07UW-MSCs细胞数注入梗死心肌周围。 此手术方法适用于冠心病慢性心力衰竭未能血管重建者及部分扩张性心肌病慢 性心力衰竭者。
5
实验例l UW-MSCs体内外向心肌细胞分化及功能鉴定 纯化3代UW-MSCs用DAPI染色标记后用5-氮胞苷诱导分化，2周后行免疫 荧光染色，共聚焦显微镜下检测发现，在DAPI染色阳性的UW-MSCs可分化为具有心 肌细胞表型特征的心肌样细胞，与DAPI共表达肌钙蛋白(TnT)、肌动蛋白(a-actin)、 GATA-4、 connexin-43。进一步在体内，在大鼠缺血性心力衰竭模型上，将绿色荧光蛋白 基因(EGFP)转染UW-MSCs作为UW-MSCs标记，将1 X 106UW-MSCs-EGFP注入大鼠梗 死心肌周围，4周后心肌组织冷冻切片，免疫荧光共聚焦显微镜检测，可见原梗死心肌组 织中有EGFP标记的移植细胞UW-MSCs存活生长及分化，EGFP阳性的移植细胞与EGFP 共表达肌钙蛋白(TnT)、肌动蛋白(aactin)、 GATA-4、 connexin-43等心肌细胞表型标志。 为了进一步鉴定UW-MSCs移植后整体心功能效应，于AMI制备后及UW-MSCs移植后应 用2维超声心动图进行动态心功能监测，结果显示，UW-MSCs移植后7天LVEF绝对值 增加5.3%、 28天增加6.8%，短轴縮短率亦明显增加，而对照组心功能恶化，应用TTC 染色心肌梗死范囲明显縮小。
实验例2 UW-MSCs免疫源性鉴定 本发明将UW-MSCs作细胞移植材料，与自体BMSCs所不同的是，采用的是同 种异体干细胞作为种子细胞来源，即异基因种子细胞。异基因种子细胞移植的关键是移 植免疫学问题，此也是本发明实用性所系。为此，发明人进行了系统的UW-MSCs体内 外免疫源性鉴定。 体外实验以流式细胞仪进行UW-MSCs免疫表型鉴定，结果为UW-MSCs仅 表达HLA-ABC，不表达HLA-II类抗源HLA-DR及协同剌激抗源CD80， CD86，表明 UW-MSCs体外无免疫源性。 UW-MSCs移植后进行整体免疫学观察，观察项目和结果为①动态混合淋巴 细胞培养试验发现UW-MSCs对异体淋巴细胞有明显抑制增殖反应；②外周血T细胞亚 群检测，流式细胞仪动态检测移植后大鼠周围血T淋巴细胞CD3、 CD4、 CD8变化， UW-MSCs均无剌激增加；③局部组织病理学检测光镜检测UW-MSCs移植区域心肌组 织未见淋巴细胞、巨噬细胞增殖侵润等心肌组织免疫反应性变化。
实验例3 UW-MSCs移植对动物模型心肌恢复作用实验 大鼠给盐酸氯胺酮10mg/kg、速眠新80mg/kg腹腔注射麻醉，气管插管人工呼吸 支持下，于左3-4肋间逐层切开，暴露左心耳与肺动脉交界前室间沟，7-0丝线模穿冠状 动脉左前降支近段全层结扎，显示左室前壁心肌变紫黑色，局部心电图显示ST段-T明显 抬高，为AMI模型成功。于AMI后5天，应用2-D超声心动图检测确定左室射血分 数(LVEF) < 50%为心衰模型成功。心衰大鼠分两组①UW-MSCs移植组；②对照生 理盐水注射组。于AMI后7天，将经ad-EGFP基因转染的1X 106UW-MSCs分5点注入 梗死心肌周围。 大鼠存活4周末行2-D超声心动图检测，UW-MSCs移植组心衰大鼠心功能明 显改善，其左室射血分数(LVEF)较移植前绝对值平均增加10.2±2.3% (n = 8)，对照组 LVEF减低2.7±0.8% (n = 8)， 二组相比P < 0.01 ;左室短轴縮短率UW-MSCs移植组 较术前增加绝对值3.9%，对照组减低4.5， 二者相比P〈0.01， UW-MSCs移植后左室舒 张末容量减低，但与对照组未构成统计学差异。
大鼠存活5周处理，UW-MSCs移植心衰大鼠及对照组心衰大鼠心肌组织冷冻 切片，免疫荧光共聚焦显微镜检测，可见原梗死组织中有EGFP标记-UW-MSCs分化的 心肌样细胞存在，EGFP阳性心肌样细胞共表达肌钙蛋白(TnT)、肌动蛋白(a-actin)、 GATA-4、 connexin-43等心肌细胞表型标志。
实验例4临床应用典型病例 患者李某，男性，71岁，发作性心前区闷痛10余年，冠脉造影为3支病变，于 2007年11月行搭桥术，术后6月出现活动时呼吸困难，逐渐加重，发作夜间阵发性呼吸 困难，后进展为夜间不能平卧，双下肢无水肿，活动严重受限，左室射血分数29%，经 优化内科药物治疗无效。于2009年6月18日予UW-MSCs 6xl06静注，后2周，心功能 LVEF由29%升至42%， 6分钟步行试验由原20米至450米，病人夜间平卧入睡，再无 夜间阵发性呼吸困难发作。UW-MSCs细胞移植后2月，可每日散步1小时。
权利要求
脐带华通胶来源的间充质干细胞作为治疗因冠心病及扩张性心肌病引起的心力衰竭细胞移植材料的应用。
2. 权利要求1所述因冠心病引起的心力衰竭为慢性缺血性心力衰竭。
3. 权利要求1所述因冠心病引起的心力衰竭为终末期缺血性心力衰竭。
4. 权利要求1所述因扩张性心肌病引起的心力衰竭为原发性扩张性心肌病所致心力衰竭。
5. 权利要求1所述因扩张性心肌病引起的心力衰竭为心肌炎后继发心肌病所致心力衰竭。
6. 根据权利要求1所述的脐带华通胶间充质干细胞的用途，其特征在于，所用细胞移 植材料为完成2-4代传代培养的脐带华通胶间充质干细胞新鲜品。
7. 根据权利要求1所述的脐带华通胶间充质干细胞的用途，其特征在于，所用细胞移 植材料为经传代培养2-4代的脐带华通胶间充质干细胞冷冻保存品。
8. 根据权利要求7所述的脐带华通胶间充质干细胞的用途，其特征在于，使用冷冻保 存的脐带华通胶间充质干细胞的方法是，从低温容器中取出冻存的细胞迅速放入35-38°C 温箱及水浴箱中，2分钟内溶化，使用完全培养基溶液重悬细胞，培养2-4天细胞融合后 重新消化、洗涤细胞，使用浓度为"肝素1000单位0.9%氯化钠溶液100毫升"的肝 素氯化钠注射液制成细胞浓度为l-2X106/ml的脐带华通胶间充质干细胞悬液。
9. 根据权利要求6或7所述脐带华通胶间充质干细胞的用途，其特征在于，经冠状动 脉超选择性移植或超选择性移植，每次注入4X10e脐带华通胶间充质干细胞，间断注射 5 6次。
10. 根据权利要求6或7所述脐带华通胶间充质干细胞的用途，其特征在于，经心内 膜直接心肌注射移植，于5个位点共注入2X 107脐带华通胶间充质干细胞。
全文摘要
本发明涉及脐带华通胶来源的间充质干细胞作为治疗因冠心病及扩张性心肌病引起的心力衰竭细胞移植材料的应用，包括心肌梗死后引起的慢性缺血性心力衰竭、终末期缺血性心力衰竭，及原发性扩张性心肌病和心肌炎后继发心肌病所致的心力衰竭。
文档编号A61P9/04GK101690731SQ200910170248
公开日2010年4月7日 申请日期2009年9月9日 优先权日2009年9月9日
发明者丁青艾, 张宁坤, 曹毅, 朱智明, 杨晔, 陈宇, 高连如 申请人:中国人民解放军海军总医院
最新回复(0)