脐带华通胶来源的间充质干细胞在急性心肌梗死细胞移植治疗中的应用的制作方法
专利名称：脐带华通胶来源的间充质干细胞在急性心肌梗死细胞移植治疗中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物材料在医疗领域的用途，特别涉及以人脐带华通胶为原料制 备的间充质干细胞在制备治疗急性心肌梗死细胞移植材料方面的应用。
背景技术：
冠心病是一种严重危害人类生命和健康的疾病，仅中国每年就有500多万人 死于冠心病，其中死于急性心肌梗死(Acute myocardial infarction, AMI)者占相当 大的比例。近年来直接介入手术、药物溶栓等血管重建技术的发展，使AMI早期 预后得到了改善，但是，循证医学证实，早期血管重建只能挽救缺血顿抑心肌， 不能阻止己经坏死的心肌被无收縮力的纤维结缔组织替代形成疤痕，经历心室重 构，部分病人发展为心力衰竭。因此，必须将血管重建与心肌修复同时进行才能 根本改善冠心病患者的预后。
当代细胞生物学研究表明，具有自我更新、多向分化潜能的胚胎干细胞和骨 髓间充质干细胞(MSCs)可以在梗死心肌存活、分化为心肌样细胞，改善心功能。 但是在相继的临床研究和应用中遇到了种种问题和障碍，诸如胚胎干细胞的应 用存在伦理、法律、免疫排斥及致肿瘤性等问题，被医疗界放弃或搁置；自体成 体干细胞在急性心肌梗死的细胞学治疗中也遇到一些障碍①骨髂肌成肌细胞移 植治疗心肌梗死存在严重致心律失常性；②骨髓单个核细胞移植成分复杂，具有 多向分化潜能的干细胞含量低，分化潜能有限；③造血干细胞CD34不能分化为 心肌细胞表型；④CD133细胞移植可致冠脉支架再狭窄；⑤内皮祖细胞改善心功 能作用有限；⑥骨髓间充质干细胞(MSCs)来源受限，细胞增殖分化潜能随年龄 的增长而明显下降，尤其是冠心病患者MSCs增殖分化能力明显低于同龄健康人， 体外长期扩增降低体内分化归巢潜能；⑦脐血源MSCs分离效率低。因此，冠心 病干细胞治疗的技术瓶颈是解决多能干细胞的来源。
目前急性心肌梗死细胞治疗亟待解决的问题是①冠心病及老年患者自体
4干细胞分化增殖及旁/自分泌功能减低，不能达到有效的生物学效应；②AMI细 胞移植的最佳时间窗为梗死相关血管重建后4-6天，而自体骨髓MSCs制备时间 要长得多，因此错失最佳细胞移植时机;③自体骨髓MSCs制备经约14天后，BMSCs 细胞数也仅能达到2-3X106，达不到有效剂量，如进一步扩增，则BMSCs体积过 大易致冠脉微栓塞；④AMI患者对于抽取自体约80ml骨髓顾虑重重，医从性差； ⑤病人为等待BMSCs制备拖延住院时间，医疗费用增加。
本发明人的在先专利申请"200910157731.6脐带华通胶间充质干细胞的制 备方法及其产品"为急性心肌梗死实施细胞治疗提供了新的物质基础。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，将脐带华通胶来源的间充质干细胞作为细胞移 植材料应用于对急性心肌梗死(Acute myocardial infarction, AMI)的治疗。
本发明所称"脐带华通胶来源的间充质干细胞"，英文名称为"Umbilical Cord Wharton， s Jelly- Derived MSCs, UW-MSCs"，是按以下方法制备的
取人新鲜脐带，以等渗的平衡盐溶液或无血清培养基洗去脐带残留血液，去 除脐动脉、脐静脉及脐带外膜，剥离华通胶并剪切成小块，再以等渗的平衡盐溶 液或无血清培养液冲洗后，浸泡于0.05-0.3%胶原酶溶液中，置于35-37.5 "C温箱中10-30小时，组织块消化，液体呈粘稠状，然后加入相当于原液l-10倍量的含胎牛血清的培养基终止消化，分装于培养瓶或培养皿，置C02培养箱， 待细胞贴壁后更换含胎牛血清的培养基溶液，以后每隔2 4天换液一次，细胞贴 壁融合后传代培养；传代培养2~4代，即时使用或冷冻保存备用。
本发明所称"脐带华通胶来源的间充质干细胞"在生物学表型鉴定中，具 有以下技术特征:①在标准培养条件下粘附于塑料制培养器皿生长;②表达CD90、 CD105、 CD44; HLA-ABC;不表达CD45、 CD34, HLA-DR;③体外可诱导分化为成 骨细胞和脂肪细胞。
本发明方法所用UW-MSCs细胞移植材料，可以即时使用刚刚完成传代培养2 一4代的UW-MSCs新鲜品；也可以使用冷冻保存的传2—4代UW-MSCs备用品。
本发明方法对急性心肌梗死患者移植UW-MSCs的常用方法为冠状动脉灌注。
本发明经冠状动脉UW-MSCs移植术治疗心肌梗死的适应症包括，根据病史、 心电图、实验室等检査，按照WHO/AHA/ACC急性心肌梗死诊断标准及分类，属于急性ST段抬高型心肌梗死和急性非ST段抬高心肌梗死，发病在1个月以内者。
下列情况属于本发明方法的不适应症肝脏或肾脏功能障碍；出血性疾 病、恶性肿瘤；自身免疫病或任何严重致命性疾病；冠脉介入治疗禁忌证；其 它心脏病者先天性心脏病(室缺、房缺、动脉导管未闭等先天性畸形)；原发 性心瓣膜疾病；肺源性心脏病；甲亢性心脏病、粘液水肿性心脏病等。 经冠状动脉超选择性UW-MSCs移植术技术要点
急性心肌梗死发病6小时之内实施血管重建术者，于血管重建后4-6天实施 UW-MSCs移植；急性心肌梗死发病在12小时以上，在一个月内择期实施血管重 建的患者，于血管重建手术的同时实施冊-MSCs移植。手术方法是，在冠状动脉 梗死相关血管，经穿导丝球囊导管，每次在充盈球囊完全封堵靶血管下高压注 入l-2 X107rd脐带华通胶间充质干细胞悬液2ml，每次球囊充盈持续I分钟， 后解除球囊充盈2分钟，共重复5-6次，移植细胞数共2-3X107。
行冠脉造影及经皮穿刺冠脉介入治疗(PCI术)，成功的血管再通后行超选择 性UW-MSCs移植。将超长(3m)BMW导丝置于闭塞重建血管远端，沿导丝插入穿导 丝球囊置于梗死闭塞段血管，抽出导丝，连接压力泵，充盈球囊4-8个大气压 不等，以阻断前向血流为标准，以高压快速注入2ml含4Xl(fUW-MSCs(2X106 个/ml)细胞悬液，气囊保持充盈1分钟后恢复灌注，2分钟后重复上述操作注 入UW-MSCs,共注入5-6次。术中密切心电和血液动力学监测。
本发明匿-MSCs移植术治疗心肌梗死的机理是利用UW-MSCs较自体干细胞 更强的自我更新及多向分化潜能，及归巢与旁/自分泌功能，释放大量生物因子， 促进血管和心肌再生等生物学效应来修复心肌、减少梗死面积、限制心室重构， 从而改善心肌梗死患者的近期和远期预后。
对本发明细胞移植疗法的效应，按照国际医学界通行的标准，主要从心肌重 建有效和心功能改善有效两方面进行分析判断；对本发明细胞移植疗法的安全 性，按照国际医学界通行的标准，主要从冠脉再狭窄、心律失常发生率、致肿瘤 性、心肌纤维化和钙化、微血管栓塞、系列实验室检査指标进行评价。
本发明应用以脐带华通胶制备的间充质干细胞UW-MSCs，其增殖能力、纯度 均高于骨髓间充质干细胞MSCs。UW-MSCs所释放的干细胞因子、粒细胞集落因子、 肝细胞生长因子、转化生长因子-3、白介素-8等生长因子、细胞因子量明显高 于BMSCs。本发明方法的应用有助于解决目前困扰医学界的多个问题，例如①胚胎干细胞存在的伦理道德、法律、免疫排斥及致肿瘤性等问题；②成体干细胞 存在的分化增殖归巢能力低及制备周期长等种种缺陷；③冠心病患者自体骨髓抽 取医从性差、MSCs增殖能力差剂量不足、AMI细胞时间窗等问题；④从根本上改 善心肌梗死预后。
具体实施例方式
以下通过实施例对本发明作进一步说明。
实施例1 UW-MSCs移植材料的准备——应用UW-MSCs新鲜品
将刚刚完成传代培养2—4代的脐带华通胶间充质干细胞新鲜品，以0. 05 -0.25%胰酶消化1一5分钟，血清中和，平衡盐溶液洗涤3遍，离心机的离心力 控制在100-1000g，应用"10-20单位肝素/毫升0. 9%氯化钠"注射液重悬使用。
实施例2 UW-MSCs移植材料的准备——应用冷冻保存的UW-MSCs备用品
从低温容器中取出冻存的传2—4代脐带华通胶间充质干细胞，迅速放入35 一38"温箱及水浴箱中，2分钟内溶化，使用完全培养基溶液重悬细胞，培养2 一4天细胞融合后重新消化、洗涤细胞，配以肝素氯化钠注射液制成细胞浓度为 l一2X107ml的细胞悬液，通常按每支10毫升包装。其中用以悬浮细胞的肝素 氯化钠注射液，优选配比为肝素1000单位生理盐水100毫升。
实验例l W-MSCs体内外向心肌细胞分化及功能鉴定
纯化3代UW-MSCs用DAPI染色标记后用5-氮胞苷诱导分化，2周后行免疫 荧光染色，共聚焦显微镜下检测发现在DAPI染色阳性的UW-MSCs可分化为具 有心肌细胞表型特征的心肌样细胞，与DAPI共表达肌钙蛋白(TnT)、肌动蛋白 (a-actin) 、 GATA-4、 connexin-43。进一步在体内，在大鼠急性心肌梗死模型上， 将绿色荧光蛋白基因(EGFP)转染UW-MSCs作为UW-MSCs标记，将IX 106UW-MSCs-EGFP注入大鼠梗死心肌周围，4周后心肌组织冷冻切片，免疫荧光 共聚焦显微镜检测，可见原梗死心肌组织中有EGFP标记的移植细胞UW-MSCs存 活生长及分化，EGFP阳性的移植细胞与EGFP共表达肌钙蛋白(TnT)、肌动蛋白 (a-actin) 、GATA-4、connexin-43等心肌细胞表型标志。为了进一步鉴定UW-MSCs 移植后整体心功能效应，于AMI制备后及UW-MSCs移植后应用2维超声心动图进 行了动态心功能监测，结果显示UW- MSCs移植后7天LVEF绝对值增加5. 3%、 28天增加6.8%,短轴缩短率亦明显增加，而对照组心功能恶化化，应用TTC染
7色心肌梗死范囲明显缩小。
实验例2 UW-MSCs免疫源性鉴定
本发明将UW-MSCs作心肌梗死移植材料，与自体BMSCs所不同的是，采用的 是同种异体干细胞作为种子细胞来源，即异基因种子细胞。异基因种子细胞移植 的关键是移植免疫学问题，此也是本发明实用性所系。为此，发明人进行了系统 的UW-MSCs体内外免疫源性鉴定。
体外实验以流式细胞仪进行了 UW-MSCs免疫表型鉴定，结果为UW-MSCs 仅表达HLA-ABC，不表达HLA-II类抗源HLA-DR及协同刺激抗源CD80, CD86,表 明UW-MSCs体外无免疫源性。
UW-MSCs移植后进行整体免疫学观察，观察项目和结果为①动态混合淋巴 细胞培养试验发现UW-MSCs对异体淋巴细胞有明显抑制增殖反应；②外周血T细 胞亚群检测，流式细胞仪动态检测移植后大鼠周围血T淋巴细胞CD3、 CD4、 CD8 变化，UW-MSCs均无刺激增加；③局部组织病理学检测光镜检测UW-MSCs移植 区域心肌组织未见淋巴细胞、巨噬细胞增殖侵润等心肌组织免疫反应性变化。
实验例3 UW-MSCs移植在急性心肌梗死模型实验
大鼠给盐酸氯胺酮10mg/kg、速眠新80mg/kg腹腔注射麻醉，气管插管人工 呼吸支持下，于左3-4肋间切开，逐层切开暴露左心耳与肺动脉交界前室间沟， 7-0丝线模穿冠状动脉左前降支近段全层结扎，显示左室前壁心肌变紫黑色，局 部心电图显示ST段-T明显抬高，为AMI模型成功。于AMI后lh，将经ad-EGFP 基因转染的1X106UW- MSCs分5点注入梗死心肌周围。
大鼠存活4周处理，UW-MSCs移植大鼠及对照组大鼠心脏大体解剖石腊切片， 光镜检测，显示在梗死心肌中可见新生心肌细胞。共聚焦图心肌细胞表型特征。
UW-MSCs移植后心脏功能明显改善，如下表所示。
Control group (n:=8)UW-MSCs group (n=8)lday7 days28 days1 day7 days28 days
UVEF(%)51.7±2.848.4 ±4.045.9±4.4*51.4±3.156.7±3.7*58.2±3.0**
LVEDV(ml)1.80±0.21.84 ±0.21.83±0.21.81 ±0.31.71 ±0.31.70±0.2
LVESV(ml)0.87 ±0.20.95 ±0.20.99 ±0.2*0.88 ±0.20.74 ±0.20.71 ±0.2*
FS (%)26.5 ±1.824.5 ±0.921.9±1.4*26.1 ±0.927.0±1.128.1 ±1.0*
注LVEF:左室射血分数；LVEDV:左室舒张末容量；LVESV:左室收縮末容量;
FS:短轴縮短率
权利要求
1.脐带华通胶来源的间充质干细胞作为治疗急性心肌梗死细胞移植材料的应用。
2. 根据权利要求1所述脐带华通胶间充质干细胞的用途，其特征在于， 所述急性心肌梗死为冠心病急性ST段抬高型或非ST段抬高型心肌梗死。
3. 根据权利要求2所述脐带华通胶间充质干细胞的用途，其特征在于， 所述急性心肌梗死为发病在1个月内的病例。
4. 根据权利要求3所述脐带华通胶间充质干细胞的用途，其特征在于， 脐带华通胶间充质干细胞移植是对发病6小时内实施血管重建术的急性心肌 梗死病例，在术后4-6天实施冠状动脉灌注移植的。
5. 根据权利要求3所述脐带华通胶间充质干细胞的用途，其特征在于， 脐带华通胶间充质干细胞移植是对择期实施血管重建的急性心肌梗死病例， 于手术同时实施冠状动脉灌注移植的。
6. 根据权利要求l一5任一权利要求所述的脐带华通胶间充质干细胞的 用途，其特征在于，所用细胞移植材料为完成2—4代传代培养的脐带华通胶 间充质干细胞新鲜品。
7. 根据权利要求l一5任一权利要求所述的脐带华通胶间充质干细胞的 用途，其特征在于，所用细胞移植材料为经传代培养2—4代的脐带华通胶间 充质干细胞冷冻保存品。
8. 根据权利要求7所述的脐带华通胶间充质干细胞的用途，其特征在于， 使用冷冻保存的脐带华通胶间充质干细胞的方法是，从低温容器中取出冻存 的细胞迅速放入35-38'C温箱及水浴箱中，2分钟内溶化，使用完全培养基 溶液重悬细胞，培养2-4天细胞融合后重新消化、洗涤细胞，用肝素氯化钠 注射液制成细胞浓度为1—2X107ml的脐带华通胶间充质干细胞悬液。
9. 根据权利要求8所述的脐带华通胶间充质干细胞的用途，其特征在于， 用以悬浮细胞的肝素氯化钠注射液，其配比为肝素1000单位生理盐水 100毫升。
10. 根据权利要求4或5所述脐带华通胶间充质干细胞的用途，其特征 在于，经穿导丝球囊导管，每次在充盈球囊完全封堵靶血管下高压注入1-2X10Vml脐带华通胶间充质干细胞悬液2ni1，每次球囊充盈持续1分钟，后 解除球囊充盈2分钟，共重复5-6次，移植细胞数共2-3X107。
全文摘要
本发明公开了脐带华通胶来源的间充质干细胞作为治疗急性心肌梗死细胞移植材料的应用。适用于发病在1个月内的ST段抬高型心肌梗死或非ST段拾高型心肌梗死病例，发病6小时之内实施血管重建术者在术后4-6天作冠状动脉灌注，其他择期实施血管重建术者，于手术同时实施冠状动脉灌注。本发明方法治疗效果优于骨髓间充质干细胞移植。
文档编号A61K35/12GK101642469SQ200910170249
公开日2010年2月10日 申请日期2009年9月9日 优先权日2009年9月9日
发明者丁青艾, 张宁坤, 毅 曹, 朱智明, 晔 杨, 宇 陈, 高连如 申请人:中国人民解放军海军总医院
技术领域：
本发明涉及生物材料在医疗领域的用途，特别涉及以人脐带华通胶为原料制 备的间充质干细胞在制备治疗急性心肌梗死细胞移植材料方面的应用。
背景技术：
冠心病是一种严重危害人类生命和健康的疾病，仅中国每年就有500多万人 死于冠心病，其中死于急性心肌梗死(Acute myocardial infarction, AMI)者占相当 大的比例。近年来直接介入手术、药物溶栓等血管重建技术的发展，使AMI早期 预后得到了改善，但是，循证医学证实，早期血管重建只能挽救缺血顿抑心肌， 不能阻止己经坏死的心肌被无收縮力的纤维结缔组织替代形成疤痕，经历心室重 构，部分病人发展为心力衰竭。因此，必须将血管重建与心肌修复同时进行才能 根本改善冠心病患者的预后。
当代细胞生物学研究表明，具有自我更新、多向分化潜能的胚胎干细胞和骨 髓间充质干细胞(MSCs)可以在梗死心肌存活、分化为心肌样细胞，改善心功能。 但是在相继的临床研究和应用中遇到了种种问题和障碍，诸如胚胎干细胞的应 用存在伦理、法律、免疫排斥及致肿瘤性等问题，被医疗界放弃或搁置；自体成 体干细胞在急性心肌梗死的细胞学治疗中也遇到一些障碍①骨髂肌成肌细胞移 植治疗心肌梗死存在严重致心律失常性；②骨髓单个核细胞移植成分复杂，具有 多向分化潜能的干细胞含量低，分化潜能有限；③造血干细胞CD34不能分化为 心肌细胞表型；④CD133细胞移植可致冠脉支架再狭窄；⑤内皮祖细胞改善心功 能作用有限；⑥骨髓间充质干细胞(MSCs)来源受限，细胞增殖分化潜能随年龄 的增长而明显下降，尤其是冠心病患者MSCs增殖分化能力明显低于同龄健康人， 体外长期扩增降低体内分化归巢潜能；⑦脐血源MSCs分离效率低。因此，冠心 病干细胞治疗的技术瓶颈是解决多能干细胞的来源。
目前急性心肌梗死细胞治疗亟待解决的问题是①冠心病及老年患者自体
4干细胞分化增殖及旁/自分泌功能减低，不能达到有效的生物学效应；②AMI细 胞移植的最佳时间窗为梗死相关血管重建后4-6天，而自体骨髓MSCs制备时间 要长得多，因此错失最佳细胞移植时机;③自体骨髓MSCs制备经约14天后，BMSCs 细胞数也仅能达到2-3X106，达不到有效剂量，如进一步扩增，则BMSCs体积过 大易致冠脉微栓塞；④AMI患者对于抽取自体约80ml骨髓顾虑重重，医从性差； ⑤病人为等待BMSCs制备拖延住院时间，医疗费用增加。
本发明人的在先专利申请"200910157731.6脐带华通胶间充质干细胞的制 备方法及其产品"为急性心肌梗死实施细胞治疗提供了新的物质基础。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，将脐带华通胶来源的间充质干细胞作为细胞移 植材料应用于对急性心肌梗死(Acute myocardial infarction, AMI)的治疗。
本发明所称"脐带华通胶来源的间充质干细胞"，英文名称为"Umbilical Cord Wharton， s Jelly- Derived MSCs, UW-MSCs"，是按以下方法制备的
取人新鲜脐带，以等渗的平衡盐溶液或无血清培养基洗去脐带残留血液，去 除脐动脉、脐静脉及脐带外膜，剥离华通胶并剪切成小块，再以等渗的平衡盐溶 液或无血清培养液冲洗后，浸泡于0.05-0.3%胶原酶溶液中，置于35-37.5 "C温箱中10-30小时，组织块消化，液体呈粘稠状，然后加入相当于原液l-10倍量的含胎牛血清的培养基终止消化，分装于培养瓶或培养皿，置C02培养箱， 待细胞贴壁后更换含胎牛血清的培养基溶液，以后每隔2 4天换液一次，细胞贴 壁融合后传代培养；传代培养2~4代，即时使用或冷冻保存备用。
本发明所称"脐带华通胶来源的间充质干细胞"在生物学表型鉴定中，具 有以下技术特征:①在标准培养条件下粘附于塑料制培养器皿生长;②表达CD90、 CD105、 CD44; HLA-ABC;不表达CD45、 CD34, HLA-DR;③体外可诱导分化为成 骨细胞和脂肪细胞。
本发明方法所用UW-MSCs细胞移植材料，可以即时使用刚刚完成传代培养2 一4代的UW-MSCs新鲜品；也可以使用冷冻保存的传2—4代UW-MSCs备用品。
本发明方法对急性心肌梗死患者移植UW-MSCs的常用方法为冠状动脉灌注。
本发明经冠状动脉UW-MSCs移植术治疗心肌梗死的适应症包括，根据病史、 心电图、实验室等检査，按照WHO/AHA/ACC急性心肌梗死诊断标准及分类，属于急性ST段抬高型心肌梗死和急性非ST段抬高心肌梗死，发病在1个月以内者。
下列情况属于本发明方法的不适应症肝脏或肾脏功能障碍；出血性疾 病、恶性肿瘤；自身免疫病或任何严重致命性疾病；冠脉介入治疗禁忌证；其 它心脏病者先天性心脏病(室缺、房缺、动脉导管未闭等先天性畸形)；原发 性心瓣膜疾病；肺源性心脏病；甲亢性心脏病、粘液水肿性心脏病等。 经冠状动脉超选择性UW-MSCs移植术技术要点
急性心肌梗死发病6小时之内实施血管重建术者，于血管重建后4-6天实施 UW-MSCs移植；急性心肌梗死发病在12小时以上，在一个月内择期实施血管重 建的患者，于血管重建手术的同时实施冊-MSCs移植。手术方法是，在冠状动脉 梗死相关血管，经穿导丝球囊导管，每次在充盈球囊完全封堵靶血管下高压注 入l-2 X107rd脐带华通胶间充质干细胞悬液2ml，每次球囊充盈持续I分钟， 后解除球囊充盈2分钟，共重复5-6次，移植细胞数共2-3X107。
行冠脉造影及经皮穿刺冠脉介入治疗(PCI术)，成功的血管再通后行超选择 性UW-MSCs移植。将超长(3m)BMW导丝置于闭塞重建血管远端，沿导丝插入穿导 丝球囊置于梗死闭塞段血管，抽出导丝，连接压力泵，充盈球囊4-8个大气压 不等，以阻断前向血流为标准，以高压快速注入2ml含4Xl(fUW-MSCs(2X106 个/ml)细胞悬液，气囊保持充盈1分钟后恢复灌注，2分钟后重复上述操作注 入UW-MSCs,共注入5-6次。术中密切心电和血液动力学监测。
本发明匿-MSCs移植术治疗心肌梗死的机理是利用UW-MSCs较自体干细胞 更强的自我更新及多向分化潜能，及归巢与旁/自分泌功能，释放大量生物因子， 促进血管和心肌再生等生物学效应来修复心肌、减少梗死面积、限制心室重构， 从而改善心肌梗死患者的近期和远期预后。
对本发明细胞移植疗法的效应，按照国际医学界通行的标准，主要从心肌重 建有效和心功能改善有效两方面进行分析判断；对本发明细胞移植疗法的安全 性，按照国际医学界通行的标准，主要从冠脉再狭窄、心律失常发生率、致肿瘤 性、心肌纤维化和钙化、微血管栓塞、系列实验室检査指标进行评价。
本发明应用以脐带华通胶制备的间充质干细胞UW-MSCs，其增殖能力、纯度 均高于骨髓间充质干细胞MSCs。UW-MSCs所释放的干细胞因子、粒细胞集落因子、 肝细胞生长因子、转化生长因子-3、白介素-8等生长因子、细胞因子量明显高 于BMSCs。本发明方法的应用有助于解决目前困扰医学界的多个问题，例如①胚胎干细胞存在的伦理道德、法律、免疫排斥及致肿瘤性等问题；②成体干细胞 存在的分化增殖归巢能力低及制备周期长等种种缺陷；③冠心病患者自体骨髓抽 取医从性差、MSCs增殖能力差剂量不足、AMI细胞时间窗等问题；④从根本上改 善心肌梗死预后。
具体实施例方式
以下通过实施例对本发明作进一步说明。
实施例1 UW-MSCs移植材料的准备——应用UW-MSCs新鲜品
将刚刚完成传代培养2—4代的脐带华通胶间充质干细胞新鲜品，以0. 05 -0.25%胰酶消化1一5分钟，血清中和，平衡盐溶液洗涤3遍，离心机的离心力 控制在100-1000g，应用"10-20单位肝素/毫升0. 9%氯化钠"注射液重悬使用。
实施例2 UW-MSCs移植材料的准备——应用冷冻保存的UW-MSCs备用品
从低温容器中取出冻存的传2—4代脐带华通胶间充质干细胞，迅速放入35 一38"温箱及水浴箱中，2分钟内溶化，使用完全培养基溶液重悬细胞，培养2 一4天细胞融合后重新消化、洗涤细胞，配以肝素氯化钠注射液制成细胞浓度为 l一2X107ml的细胞悬液，通常按每支10毫升包装。其中用以悬浮细胞的肝素 氯化钠注射液，优选配比为肝素1000单位生理盐水100毫升。
实验例l W-MSCs体内外向心肌细胞分化及功能鉴定
纯化3代UW-MSCs用DAPI染色标记后用5-氮胞苷诱导分化，2周后行免疫 荧光染色，共聚焦显微镜下检测发现在DAPI染色阳性的UW-MSCs可分化为具 有心肌细胞表型特征的心肌样细胞，与DAPI共表达肌钙蛋白(TnT)、肌动蛋白 (a-actin) 、 GATA-4、 connexin-43。进一步在体内，在大鼠急性心肌梗死模型上， 将绿色荧光蛋白基因(EGFP)转染UW-MSCs作为UW-MSCs标记，将IX 106UW-MSCs-EGFP注入大鼠梗死心肌周围，4周后心肌组织冷冻切片，免疫荧光 共聚焦显微镜检测，可见原梗死心肌组织中有EGFP标记的移植细胞UW-MSCs存 活生长及分化，EGFP阳性的移植细胞与EGFP共表达肌钙蛋白(TnT)、肌动蛋白 (a-actin) 、GATA-4、connexin-43等心肌细胞表型标志。为了进一步鉴定UW-MSCs 移植后整体心功能效应，于AMI制备后及UW-MSCs移植后应用2维超声心动图进 行了动态心功能监测，结果显示UW- MSCs移植后7天LVEF绝对值增加5. 3%、 28天增加6.8%,短轴缩短率亦明显增加，而对照组心功能恶化化，应用TTC染
7色心肌梗死范囲明显缩小。
实验例2 UW-MSCs免疫源性鉴定
本发明将UW-MSCs作心肌梗死移植材料，与自体BMSCs所不同的是，采用的 是同种异体干细胞作为种子细胞来源，即异基因种子细胞。异基因种子细胞移植 的关键是移植免疫学问题，此也是本发明实用性所系。为此，发明人进行了系统 的UW-MSCs体内外免疫源性鉴定。
体外实验以流式细胞仪进行了 UW-MSCs免疫表型鉴定，结果为UW-MSCs 仅表达HLA-ABC，不表达HLA-II类抗源HLA-DR及协同刺激抗源CD80, CD86,表 明UW-MSCs体外无免疫源性。
UW-MSCs移植后进行整体免疫学观察，观察项目和结果为①动态混合淋巴 细胞培养试验发现UW-MSCs对异体淋巴细胞有明显抑制增殖反应；②外周血T细 胞亚群检测，流式细胞仪动态检测移植后大鼠周围血T淋巴细胞CD3、 CD4、 CD8 变化，UW-MSCs均无刺激增加；③局部组织病理学检测光镜检测UW-MSCs移植 区域心肌组织未见淋巴细胞、巨噬细胞增殖侵润等心肌组织免疫反应性变化。
实验例3 UW-MSCs移植在急性心肌梗死模型实验
大鼠给盐酸氯胺酮10mg/kg、速眠新80mg/kg腹腔注射麻醉，气管插管人工 呼吸支持下，于左3-4肋间切开，逐层切开暴露左心耳与肺动脉交界前室间沟， 7-0丝线模穿冠状动脉左前降支近段全层结扎，显示左室前壁心肌变紫黑色，局 部心电图显示ST段-T明显抬高，为AMI模型成功。于AMI后lh，将经ad-EGFP 基因转染的1X106UW- MSCs分5点注入梗死心肌周围。
大鼠存活4周处理，UW-MSCs移植大鼠及对照组大鼠心脏大体解剖石腊切片， 光镜检测，显示在梗死心肌中可见新生心肌细胞。共聚焦图心肌细胞表型特征。
UW-MSCs移植后心脏功能明显改善，如下表所示。
Control group (n:=8)UW-MSCs group (n=8)lday7 days28 days1 day7 days28 days
UVEF(%)51.7±2.848.4 ±4.045.9±4.4*51.4±3.156.7±3.7*58.2±3.0**
LVEDV(ml)1.80±0.21.84 ±0.21.83±0.21.81 ±0.31.71 ±0.31.70±0.2
LVESV(ml)0.87 ±0.20.95 ±0.20.99 ±0.2*0.88 ±0.20.74 ±0.20.71 ±0.2*
FS (%)26.5 ±1.824.5 ±0.921.9±1.4*26.1 ±0.927.0±1.128.1 ±1.0*
注LVEF:左室射血分数；LVEDV:左室舒张末容量；LVESV:左室收縮末容量;
FS:短轴縮短率
权利要求
1.脐带华通胶来源的间充质干细胞作为治疗急性心肌梗死细胞移植材料的应用。
2. 根据权利要求1所述脐带华通胶间充质干细胞的用途，其特征在于， 所述急性心肌梗死为冠心病急性ST段抬高型或非ST段抬高型心肌梗死。
3. 根据权利要求2所述脐带华通胶间充质干细胞的用途，其特征在于， 所述急性心肌梗死为发病在1个月内的病例。
4. 根据权利要求3所述脐带华通胶间充质干细胞的用途，其特征在于， 脐带华通胶间充质干细胞移植是对发病6小时内实施血管重建术的急性心肌 梗死病例，在术后4-6天实施冠状动脉灌注移植的。
5. 根据权利要求3所述脐带华通胶间充质干细胞的用途，其特征在于， 脐带华通胶间充质干细胞移植是对择期实施血管重建的急性心肌梗死病例， 于手术同时实施冠状动脉灌注移植的。
6. 根据权利要求l一5任一权利要求所述的脐带华通胶间充质干细胞的 用途，其特征在于，所用细胞移植材料为完成2—4代传代培养的脐带华通胶 间充质干细胞新鲜品。
7. 根据权利要求l一5任一权利要求所述的脐带华通胶间充质干细胞的 用途，其特征在于，所用细胞移植材料为经传代培养2—4代的脐带华通胶间 充质干细胞冷冻保存品。
8. 根据权利要求7所述的脐带华通胶间充质干细胞的用途，其特征在于， 使用冷冻保存的脐带华通胶间充质干细胞的方法是，从低温容器中取出冻存 的细胞迅速放入35-38'C温箱及水浴箱中，2分钟内溶化，使用完全培养基 溶液重悬细胞，培养2-4天细胞融合后重新消化、洗涤细胞，用肝素氯化钠 注射液制成细胞浓度为1—2X107ml的脐带华通胶间充质干细胞悬液。
9. 根据权利要求8所述的脐带华通胶间充质干细胞的用途，其特征在于， 用以悬浮细胞的肝素氯化钠注射液，其配比为肝素1000单位生理盐水 100毫升。
10. 根据权利要求4或5所述脐带华通胶间充质干细胞的用途，其特征 在于，经穿导丝球囊导管，每次在充盈球囊完全封堵靶血管下高压注入1-2X10Vml脐带华通胶间充质干细胞悬液2ni1，每次球囊充盈持续1分钟，后 解除球囊充盈2分钟，共重复5-6次，移植细胞数共2-3X107。
全文摘要
本发明公开了脐带华通胶来源的间充质干细胞作为治疗急性心肌梗死细胞移植材料的应用。适用于发病在1个月内的ST段抬高型心肌梗死或非ST段拾高型心肌梗死病例，发病6小时之内实施血管重建术者在术后4-6天作冠状动脉灌注，其他择期实施血管重建术者，于手术同时实施冠状动脉灌注。本发明方法治疗效果优于骨髓间充质干细胞移植。
文档编号A61K35/12GK101642469SQ200910170249
公开日2010年2月10日 申请日期2009年9月9日 优先权日2009年9月9日
发明者丁青艾, 张宁坤, 毅 曹, 朱智明, 晔 杨, 宇 陈, 高连如 申请人:中国人民解放军海军总医院
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