南瓜蛋白在制备治疗肺癌药物中的应用的制作方法
专利名称：南瓜蛋白在制备治疗肺癌药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗肿瘤药物领域，尤其涉及南瓜蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
恶性肿瘤是严重威胁人类生命健康的疾病，目前临床常用的化疗药物在杀伤肿瘤 细胞的同时，也很大地损伤了正常组织和细胞，这就限制了它的应用。寻找高效、低毒的治 疗肿瘤的药物已成为当前抗癌药物研究的方向和迫切任务。从天然物质中寻找抗肿瘤药物 已被认为是一种有效的途径，对天然活性物质进行抗肿瘤作用的研究，尤其在抑制增殖及 诱导凋亡和分化方面进行探索，将有助于获得理想的抗肿瘤药物。核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating protein, RIP)广泛存在于高等植物 中，迄今分离到的植物RIP约80余种。植物RIP通常按结构不同分为两型1型RIP为单链 蛋白，如天花粉蛋白(Trichosanthin，TCS)，在植物RIP中占多数；II型RIP是通过二硫键 连接的双链蛋白，如蓖麻毒素(ricin)。它们是一类RNA N-糖苷酶或多核苷酸腺苷糖苷 酶，具有抗生育、抗病毒和抗肿瘤等多种生物学活性。植物RIP抗肿瘤方面的研究早就引起 人们的兴趣RIP对肿瘤细胞的杀伤作用远比对正常细胞的强，尤其是与单克隆抗体交联 成的免疫毒素对肿瘤细胞具有靶向性和高杀伤效应。而有关RIP抗肿瘤的机制，最初认为 在于RIP的细胞毒作用所致的肿瘤细胞坏死，后来发现是通过诱导肿瘤细胞凋亡产生的。CN 1263107A提供了从南瓜中分离出的类型1 RIP-南瓜蛋白(Cucurmosin)，并公 开了它的制备方法。SDS-PAGE显示它的分子量为27kDa，等电点pi > 9，具有强烈抑制细 胞内核糖体蛋白质合成的活性。南瓜蛋白已长出可供χ-射线衍射用的单晶，晶体结构分 析结果指出，南瓜蛋白与天花粉蛋白具有结构同源性[Chen et al. Acta Cryst. D56 2000， 665-666 ；Shi etal =Chinese J. struct, chem. 2003, 22 (2), 165-168] CN 1603340Α 提供了 南瓜蛋白具有RNA N糖苷酶活性和体外抑制白血病细胞增殖的抗肿瘤活性。本发明是基于上述现有技术基础，通过实验证实了南瓜蛋白对体外培养的实体瘤 细胞(胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌和黑色素瘤等)及小鼠移植瘤(黑色素瘤、宫颈癌和肺癌 等)具有显著的抑制作用，而对人正常肝细胞株L02及外周血淋巴细胞的影响小，表现出明 显的选择性。通过细胞形态观察、细胞增殖周期分析及琼脂糖凝胶电泳测定等研究发现，南 瓜蛋白对胃癌、肝癌和黑色素瘤等实体瘤细胞具有诱导凋亡的作用。此外，以黑色素瘤Β16 细胞为模型，通过细胞形态观察、流式细胞仪分析及黑色素含量测定等研究发现，南瓜蛋白 对黑色素瘤细胞尚具有诱导分化的作用；对肿瘤细胞的诱导凋亡和诱导分化作用同时存 在，但低浓度时以诱导分化为主，而高浓度时则具有显著的诱导凋亡的作用。我们首次发现 南瓜蛋白能诱导肿瘤细胞分化，诱导分化是其抗肿瘤的新机制。南瓜蛋白对肿瘤细胞的诱 导凋亡和诱导分化作用是其抗肿瘤活性的重要机制。
发明内容
本发明的目的是通过研究南瓜蛋白在体内外的抗肿瘤活性，提供南瓜蛋白在抗肿 瘤制药中的应用采用温和的分离纯化方法，包括盐溶液抽提、DEAE-纤维素过滤、CM-纤维素或 SP-琼脂糖等强或弱的阳离子凝胶介质二次离子交换层析分离，可以从南瓜果肉中分离到 南瓜蛋白，SDS-PAGE检测分子量为27kDa。层析纯的南瓜蛋白(纯度>97%)经过滤除菌 后用于实验。本发明提供了南瓜蛋白作为制备治疗肝癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、宫颈癌、黑色素瘤 药物的应用。
具体实施例方式下面用具体的实施例来说明南瓜蛋白的药效作用和有益效果 实施例1 南瓜蛋白对体外培养的肿瘤细胞的增殖抑制作用及对人正常细胞的影 响取对数生长期的肿瘤细胞(胃癌细胞SGC79tll，肝癌细胞H印G2、Bel74tl4，非小细胞肺 癌细胞A549，乳腺癌细胞MCF-7及黑色素瘤细胞B16)和人正常肝细胞L02接种于96孔培 养板上，每孔接种量分别为3000 4000个/100 μ L和6000个/100 μ L ；无菌采集健康献 血者静脉血15mL，肝素抗凝，用Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞，用含10%胎牛血 清的RPMI1640配制单个细胞悬夜，调细胞浓度为2 X IO5个/mL，接种于96孔培养板，每孔 IOOyL0上述各培养板细胞培养24h后，实验组加不同浓度的南瓜蛋白100 μ L，每个浓度 做三个复孔；阴性对照组加营养液100μ 1，空白对照孔加营养液IOOyL,用于仪器调零。作 用不同时间(48h和72h)后，每孔加5mg/mL的MTT20 μ L，继续培养4h，甩去上清，每孔加 二甲亚砜150 μ L。用酶标仪(BI0-RAD产品)测定570nm各孔的吸光度值(A57tl),各组取平 均值，计算抑制率抑制率=(I-实验组A57tl/对照组A57tl) X 100%。用SPSS12. 0进行统计 学分析，并计算IC5(I。结果南瓜蛋白对上述胃癌、肝癌、乳腺癌、非小细胞肺癌及黑色素瘤 细胞均具有明显的增殖抑制作用，并呈剂量依赖性和时间依赖性，其48h的IC5tl从9. 77到 36. 91 μ g/mL, 72h的IC50从1. 94 μ g/mL到13. 54 μ g/mL ；而南瓜蛋白对人正常肝细胞和外 周血淋巴细胞抑制作用较小，其48h的IC50分别> 80 μ g/mL和> 40 μ g/mL, 72h的IC50分 别为27. 30 μ g/mL和> 40 μ g/mL (表1)。可见南瓜蛋白对肿瘤细胞具有明显的选择性抑制 作用。表1南瓜蛋白对肿瘤细胞及正常细胞的半数抑制浓度 实施例2 南瓜蛋白对SGC79tll、H印G2、BeI74tl4、A549、MCF-7及B16细胞的诱导凋亡作 用(1)南瓜蛋白对上述肿瘤细胞形态的影响①荧光显微镜观察上述肿瘤细胞分别接种于多个盖玻片上，12h后加入不同浓 度的南瓜蛋白处理24、48和72h，用吖啶橙(AO)/溴乙啶(EB)混合荧光染料染色后，倒扣于 载玻片上，在荧光显微镜下观察细胞的形态学变。结果上述细胞均可观察到早、中期凋亡 细胞的细胞核或细胞质内有浓染致密的颗粒状黄绿色荧光，核染色质浓缩，核破裂，凋亡小 体释放等典型的凋亡细胞形态学改变；同时凋亡有时间及剂量依赖关系。②电子显微镜观察上述肿瘤细胞分别用20μ g/mL南瓜蛋白作用48h为实验组， 同时以正常培养的上述细胞为对照组，各组细胞经0. 25%胰酶消化后，离心收集细胞沉淀， 用4°C预冷的2. 5%戊二醛-1%多聚甲醛混合液固定，锇酸后固定，环氧树脂包埋，超薄 切片，醋酸铀和柠檬铅染色，透射电子显微镜(HITACHI Hu-12A型)观察并拍照。结果上 述肿瘤细胞经南瓜蛋白作用后均出现典型的凋亡形态学改变，细胞变小，细胞质浓缩，内质 网扩张，核仁消失，细胞核内染色质边聚于核膜下，可见核固缩、核碎裂和凋亡小体；凋亡细 胞约占15-20%。(2)流式细胞仪分析以2X 105/mL接种于培养瓶中培养12h后，加入不同浓度南 瓜蛋白溶液继续培养24、48和72h，收集细胞，2000r/min离心5分钟，PBS洗1次后，倾去 上清。以70%乙醇在4°C固定30min以上，离心除去固定液，PBS洗1次后用碘化丙啶(PI) 溶液(含 0.005% PI、0· Triton Χ_100、0· lmmol/L EDTA 和 0· 01 % RNase Α)在室温避 光染色30min，上机分析。结果上述肿瘤细胞经不同浓度南瓜蛋白处理24、48和72h后， 在GcZG1峰的前面，都有高度不同的亚二倍体峰，且呈明显的时间和剂量依赖性。(3)琼脂糖凝胶电泳检测细胞DNA 分别收集经20 μ g/mL南瓜蛋白处理的上述 肿瘤细胞1 2X IO6个，同时以正常培养的上述细胞为对照。用PBS重悬浮一遍，加入 20(^1^裂解液(含10讓01/1 Tris、50mmol/L EDTA、0. 5% SDS)，同时加入 1 μ 1 蛋白酶 K 溶液(20mg/mL)，于55°C消化4小时，经酚氯仿异戊醇(25 24 1)和氯仿异戊醇 (24 1)各抽提一次，用无水乙醇沉淀、TE溶解，加入RNaSe，37°C 30分钟，加入上样缓冲 液后，于90V、1.2%琼脂糖凝胶电泳2h。电泳完毕，于紫外观察仪上观察并拍照。结果上 述肿瘤细胞经20 μ g/mL南瓜蛋白处理72h，均可见明显的DNA Ladder条带。而对照组仅见 一基因组DNA条带。结果表明，南瓜蛋白对胃癌，肝癌和黑色素瘤细胞均具有显著的诱导凋亡作用。
实施例3 南瓜蛋白对肿瘤细胞的诱导分化作用(以黑色素瘤B16细胞为模型)(1)细胞形态观察将对照组及实验组B16细胞培养72h后，分别用相差显微镜和 透射电子显微镜观察细胞形态并拍照。结果如下①光学显微镜观察对照组B16细胞呈多层不规则生长，具有重叠的圆形细胞；南 瓜蛋白作用后，细胞呈一定的极性生长，平行排列，不重叠；3d后，南瓜蛋白浓度在2. 5 μ g/ mL以上者，细胞极性明显，多数细胞体积变大，具有树突状结构，细胞间连成网状，生长缓 慢，细胞数变少。②电镜观察对照组B16细胞表面可见较多微绒毛，细胞核多数较大且为椭圆形， 核内以常染色质为主，胞浆内细胞器较少，黑色素颗粒少见；20 μ g/mL南瓜蛋白处理3d后， B16细胞体积多数变大，表面较光滑，微绒毛减少，细胞核减小且不规则，核内异染色质增 多，胞浆内细胞器丰富，可见大量不同成熟期的黑色素小体，部分细胞大量黑色素小体聚集 成团。(2)南瓜蛋白对黑色素瘤细胞增殖周期的影响收集经10 μ g/mL南瓜蛋白处理24 小时的B16细胞，1500r/min离心lOmin，沉淀经70%乙醇固定12小时，PBS洗涤2遍后重 悬，用300目尼龙网过滤，以碘化丙啶(PI)溶液在室温避光染色30m in，流式细胞仪分析。 结果B16细胞经1(^8/!^南瓜蛋白处理241!后，G2/M期细胞减少，S期细胞明显减少，而 GcZG1期细胞增多。提示南瓜蛋白可阻止B16细胞由G1期向S期过渡从而停滞于G1期。(3)南瓜蛋白对黑色素瘤细胞黑色素含量的影响接种对数生长期的B16细胞至6 孔板，每孔1. 5 X 105，每组3孔，d2加入南瓜蛋白，终浓度分别为1. 25,2. 5、5和10 μ g/mL，作 用72h后用PBS洗涤3次，0. 25%胰酶消化、计数，1000r/min离心lOmin，细胞沉淀溶于IM NaOH-IO % DMSO溶液ImL中，室温放置30min，于400nm波长测定吸收度值(A4J，将结果换 算成IO6细胞的吸收度。结果对照组B16细胞黑色素含量为0. 040 士0. 002 (A4ticZlO6细胞)， 而1·25、2·5、5和10 μ g/mL南瓜蛋白组黑色素含量分别为0. 088士0. 007,0. 165士0. 003、 0. 225士0. 006和0. 309士0. 008 (A400/IO6细胞)。可见，经南瓜蛋白处理后B16细胞黑色素 含量明显增加。结果表明，南瓜蛋白对黑色素瘤细胞具有明显的诱导分化作用。实施例4 南瓜蛋白对动物移植瘤的抑制作用(1)南瓜蛋白对宫颈癌U14的抑制作用选择肿瘤生长良好、全身状态较好的荷瘤 小鼠，颈椎脱白处死，固定后碘酒酒精消毒，无菌条件下取出瘤块，将肿瘤(g)和生理盐水 (mL)以1 4比例勻浆后，于皮下接种ICR小鼠(合格证号SCXK (闽)2004-0002)，每只 0. 2mL。将动物随机分组并于接种24h后腹腔注射给药，设0. 25、0. 5和lmg/kg三个剂量组， 同时设环磷酰胺组和生理盐水对照组，每2天给药1次，共5次后，颈椎脱白处死，分别称取 体重和瘤重。计算肿瘤生长抑制率(％)肿瘤生长抑制率％= (1-给药组平均瘤重/对照 组平均瘤重)X 100 ；并将结果进行统计学处理。结果南瓜蛋白0. 25,0.5和lmg/kg对宫颈癌U14均具有明显的抑制作用，抑制率 分别为 22. 57%、41· 17%和 58.26% (表 2)。(2)南瓜蛋白对黑色素瘤B16的抑制作用将黑色素瘤B16于皮下接种纯系小鼠 C57(合格证号SCXK (沪)2003-0003)按上述方法测定南瓜蛋白对黑色素瘤B16的抑制作用。
结果南瓜蛋白0. 25、0. 5和lmg/kg对黑色素瘤B16均具有明显的抑制作用，抑制 率分别为 22. 26%,36. 55%和 52. 21% (表 3)。(3)南瓜蛋白对肺癌Lewi s的抑制作用将肺癌Lewi s于皮下接种纯系小鼠 C57(合格证号SCXK (沪)2003-0003)按上述方法测定南瓜蛋白对肺癌Lewis的抑制作用。结果南瓜蛋白0. 25、0. 5和lmg/kg对肺癌Lewis均具有明显的抑制作用，抑制率 分别为 30. 80%、50. 76% 和 65. 54% (表 4)
表2南瓜蛋白对小鼠U14瘤重的影响(x+s) 注与对照组比较， < 0. 01表3南瓜蛋白对小鼠B16瘤重的影响(x+s) 注与对照组比较，**p < 0. 01广ρ < 0. 001表4南瓜蛋白对小鼠Lewis瘤重的影响(x+s) 注与对照组比较，**p< 0. 01 ；***p < 0. 001从上述实验结果可得出，本发明的南瓜蛋白的有益效果在于南瓜蛋白显著抑制 体外培养的胃癌细胞SGC79tll，肝癌细胞!fepG2、Bel7404,非小细胞肺癌细胞A549，乳腺癌细胞 MCF-7及黑色素瘤细胞B16的增殖，而对人正常肝细胞和外周血淋巴细胞抑制作用较小，表 现出明显的选择性，南瓜蛋白亦能在体内明显抑制宫颈癌U14、黑色素瘤B16和肺癌Lewis 等动物移植瘤。因此，本发明证实南瓜蛋白具良好的体内外抗实体瘤作用。过细胞形态观 察、细胞增殖周期分析及琼脂糖凝胶电泳测定等研究发现，南瓜蛋白对胃癌、肝癌和黑色素瘤等实体瘤细胞具有诱导凋亡的作用；此外，以黑色素瘤B16细胞为模型，通过细胞形态观 察、流式细胞仪分析及黑色素含量测定等研究发现，南瓜蛋白对黑色素瘤细胞尚具有诱导 分化的作用。对肿瘤细胞的诱导凋亡和诱导分化作用同时存在，但低浓度时以诱导分化为 主，而高浓度时则具有显著的诱导凋亡的作用。因此，本发明证实南瓜蛋白具有诱导肿瘤细 胞分化和凋亡的作用机制。实施例5 南瓜蛋白和天花粉蛋白对胃癌、肝癌及黑色素瘤细胞的增殖抑制作用 的比较
分别取对数生长期的胃癌SGC79m、肝癌Bel74tl4和黑色素瘤B16细胞，接种于96孔 培养板上，每孔接种量3000 4000个/100 μ 1。培养隔夜后，实验组加不同浓度的南瓜 蛋白或天花粉蛋白100 μ 1，每个浓度做三个复孔；阴性对照组加营养液100μ 1，空白对照 孔加营养液100μ 1，用于仪器调零。作用不同时间(24、48、72小时)后，每孔加5mg/ml的 ΜΤΤ20μ 1，继续培养4小时，甩去上清，每孔加二甲亚砜150μ 1。用酶标仪(BI0-RAD产品) 测定570nm各孔的吸光度值，各组取平均值，并计算抑制率。抑制率=(1_实验组OD值/ 对照组OD值)XlOO%结果见表5:表 5 南瓜蛋白2.01*10"' 4.20*10·' 0.718*10·' 天花粉蛋白 2.25*10"7 2.60* IO"7 2’38*10'权利要求
南瓜蛋白作为制备治疗肺癌药物的应用。
全文摘要
南瓜蛋白在制药中的应用，能够从南瓜果肉中分离出一种核糖体失活蛋白-南瓜蛋白，该蛋白显示了良好的抗肿瘤活性，可用于制备抗肿瘤药物。南瓜蛋白能显著抑制体外培养的胃癌细胞SGC7901，肝癌细胞HepG2、Bel7404，非小细胞肺癌细胞A549，乳腺癌细胞MCF-7及黑色素瘤细胞B16，而对人正常肝细胞和外周血淋巴细胞的抑制作用较小，表现出明显的选择性；南瓜蛋白亦能在小鼠体内明显抑制宫颈癌U14、黑色素瘤B16和肺癌Lewis等动物移植瘤。此外，本发明也证实了南瓜蛋白对肿瘤细胞的诱导凋亡和诱导分化作用是其抗肿瘤活性的重要机制。
文档编号A61P35/00GK101843894SQ20091017427
公开日2010年9月29日 申请日期2005年11月3日 优先权日2005年11月3日
发明者谢捷明, 陈明晃 申请人:中国科学院福建物质结构研究所;福建医科大学
技术领域：
本发明涉及抗肿瘤药物领域，尤其涉及南瓜蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
恶性肿瘤是严重威胁人类生命健康的疾病，目前临床常用的化疗药物在杀伤肿瘤 细胞的同时，也很大地损伤了正常组织和细胞，这就限制了它的应用。寻找高效、低毒的治 疗肿瘤的药物已成为当前抗癌药物研究的方向和迫切任务。从天然物质中寻找抗肿瘤药物 已被认为是一种有效的途径，对天然活性物质进行抗肿瘤作用的研究，尤其在抑制增殖及 诱导凋亡和分化方面进行探索，将有助于获得理想的抗肿瘤药物。核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating protein, RIP)广泛存在于高等植物 中，迄今分离到的植物RIP约80余种。植物RIP通常按结构不同分为两型1型RIP为单链 蛋白，如天花粉蛋白(Trichosanthin，TCS)，在植物RIP中占多数；II型RIP是通过二硫键 连接的双链蛋白，如蓖麻毒素(ricin)。它们是一类RNA N-糖苷酶或多核苷酸腺苷糖苷 酶，具有抗生育、抗病毒和抗肿瘤等多种生物学活性。植物RIP抗肿瘤方面的研究早就引起 人们的兴趣RIP对肿瘤细胞的杀伤作用远比对正常细胞的强，尤其是与单克隆抗体交联 成的免疫毒素对肿瘤细胞具有靶向性和高杀伤效应。而有关RIP抗肿瘤的机制，最初认为 在于RIP的细胞毒作用所致的肿瘤细胞坏死，后来发现是通过诱导肿瘤细胞凋亡产生的。CN 1263107A提供了从南瓜中分离出的类型1 RIP-南瓜蛋白(Cucurmosin)，并公 开了它的制备方法。SDS-PAGE显示它的分子量为27kDa，等电点pi > 9，具有强烈抑制细 胞内核糖体蛋白质合成的活性。南瓜蛋白已长出可供χ-射线衍射用的单晶，晶体结构分 析结果指出，南瓜蛋白与天花粉蛋白具有结构同源性[Chen et al. Acta Cryst. D56 2000， 665-666 ；Shi etal =Chinese J. struct, chem. 2003, 22 (2), 165-168] CN 1603340Α 提供了 南瓜蛋白具有RNA N糖苷酶活性和体外抑制白血病细胞增殖的抗肿瘤活性。本发明是基于上述现有技术基础，通过实验证实了南瓜蛋白对体外培养的实体瘤 细胞(胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌和黑色素瘤等)及小鼠移植瘤(黑色素瘤、宫颈癌和肺癌 等)具有显著的抑制作用，而对人正常肝细胞株L02及外周血淋巴细胞的影响小，表现出明 显的选择性。通过细胞形态观察、细胞增殖周期分析及琼脂糖凝胶电泳测定等研究发现，南 瓜蛋白对胃癌、肝癌和黑色素瘤等实体瘤细胞具有诱导凋亡的作用。此外，以黑色素瘤Β16 细胞为模型，通过细胞形态观察、流式细胞仪分析及黑色素含量测定等研究发现，南瓜蛋白 对黑色素瘤细胞尚具有诱导分化的作用；对肿瘤细胞的诱导凋亡和诱导分化作用同时存 在，但低浓度时以诱导分化为主，而高浓度时则具有显著的诱导凋亡的作用。我们首次发现 南瓜蛋白能诱导肿瘤细胞分化，诱导分化是其抗肿瘤的新机制。南瓜蛋白对肿瘤细胞的诱 导凋亡和诱导分化作用是其抗肿瘤活性的重要机制。
发明内容
本发明的目的是通过研究南瓜蛋白在体内外的抗肿瘤活性，提供南瓜蛋白在抗肿 瘤制药中的应用采用温和的分离纯化方法，包括盐溶液抽提、DEAE-纤维素过滤、CM-纤维素或 SP-琼脂糖等强或弱的阳离子凝胶介质二次离子交换层析分离，可以从南瓜果肉中分离到 南瓜蛋白，SDS-PAGE检测分子量为27kDa。层析纯的南瓜蛋白(纯度>97%)经过滤除菌 后用于实验。本发明提供了南瓜蛋白作为制备治疗肝癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、宫颈癌、黑色素瘤 药物的应用。
具体实施例方式下面用具体的实施例来说明南瓜蛋白的药效作用和有益效果 实施例1 南瓜蛋白对体外培养的肿瘤细胞的增殖抑制作用及对人正常细胞的影 响取对数生长期的肿瘤细胞(胃癌细胞SGC79tll，肝癌细胞H印G2、Bel74tl4，非小细胞肺 癌细胞A549，乳腺癌细胞MCF-7及黑色素瘤细胞B16)和人正常肝细胞L02接种于96孔培 养板上，每孔接种量分别为3000 4000个/100 μ L和6000个/100 μ L ；无菌采集健康献 血者静脉血15mL，肝素抗凝，用Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞，用含10%胎牛血 清的RPMI1640配制单个细胞悬夜，调细胞浓度为2 X IO5个/mL，接种于96孔培养板，每孔 IOOyL0上述各培养板细胞培养24h后，实验组加不同浓度的南瓜蛋白100 μ L，每个浓度 做三个复孔；阴性对照组加营养液100μ 1，空白对照孔加营养液IOOyL,用于仪器调零。作 用不同时间(48h和72h)后，每孔加5mg/mL的MTT20 μ L，继续培养4h，甩去上清，每孔加 二甲亚砜150 μ L。用酶标仪(BI0-RAD产品)测定570nm各孔的吸光度值(A57tl),各组取平 均值，计算抑制率抑制率=(I-实验组A57tl/对照组A57tl) X 100%。用SPSS12. 0进行统计 学分析，并计算IC5(I。结果南瓜蛋白对上述胃癌、肝癌、乳腺癌、非小细胞肺癌及黑色素瘤 细胞均具有明显的增殖抑制作用，并呈剂量依赖性和时间依赖性，其48h的IC5tl从9. 77到 36. 91 μ g/mL, 72h的IC50从1. 94 μ g/mL到13. 54 μ g/mL ；而南瓜蛋白对人正常肝细胞和外 周血淋巴细胞抑制作用较小，其48h的IC50分别> 80 μ g/mL和> 40 μ g/mL, 72h的IC50分 别为27. 30 μ g/mL和> 40 μ g/mL (表1)。可见南瓜蛋白对肿瘤细胞具有明显的选择性抑制 作用。表1南瓜蛋白对肿瘤细胞及正常细胞的半数抑制浓度 实施例2 南瓜蛋白对SGC79tll、H印G2、BeI74tl4、A549、MCF-7及B16细胞的诱导凋亡作 用(1)南瓜蛋白对上述肿瘤细胞形态的影响①荧光显微镜观察上述肿瘤细胞分别接种于多个盖玻片上，12h后加入不同浓 度的南瓜蛋白处理24、48和72h，用吖啶橙(AO)/溴乙啶(EB)混合荧光染料染色后，倒扣于 载玻片上，在荧光显微镜下观察细胞的形态学变。结果上述细胞均可观察到早、中期凋亡 细胞的细胞核或细胞质内有浓染致密的颗粒状黄绿色荧光，核染色质浓缩，核破裂，凋亡小 体释放等典型的凋亡细胞形态学改变；同时凋亡有时间及剂量依赖关系。②电子显微镜观察上述肿瘤细胞分别用20μ g/mL南瓜蛋白作用48h为实验组， 同时以正常培养的上述细胞为对照组，各组细胞经0. 25%胰酶消化后，离心收集细胞沉淀， 用4°C预冷的2. 5%戊二醛-1%多聚甲醛混合液固定，锇酸后固定，环氧树脂包埋，超薄 切片，醋酸铀和柠檬铅染色，透射电子显微镜(HITACHI Hu-12A型)观察并拍照。结果上 述肿瘤细胞经南瓜蛋白作用后均出现典型的凋亡形态学改变，细胞变小，细胞质浓缩，内质 网扩张，核仁消失，细胞核内染色质边聚于核膜下，可见核固缩、核碎裂和凋亡小体；凋亡细 胞约占15-20%。(2)流式细胞仪分析以2X 105/mL接种于培养瓶中培养12h后，加入不同浓度南 瓜蛋白溶液继续培养24、48和72h，收集细胞，2000r/min离心5分钟，PBS洗1次后，倾去 上清。以70%乙醇在4°C固定30min以上，离心除去固定液，PBS洗1次后用碘化丙啶(PI) 溶液(含 0.005% PI、0· Triton Χ_100、0· lmmol/L EDTA 和 0· 01 % RNase Α)在室温避 光染色30min，上机分析。结果上述肿瘤细胞经不同浓度南瓜蛋白处理24、48和72h后， 在GcZG1峰的前面，都有高度不同的亚二倍体峰，且呈明显的时间和剂量依赖性。(3)琼脂糖凝胶电泳检测细胞DNA 分别收集经20 μ g/mL南瓜蛋白处理的上述 肿瘤细胞1 2X IO6个，同时以正常培养的上述细胞为对照。用PBS重悬浮一遍，加入 20(^1^裂解液(含10讓01/1 Tris、50mmol/L EDTA、0. 5% SDS)，同时加入 1 μ 1 蛋白酶 K 溶液(20mg/mL)，于55°C消化4小时，经酚氯仿异戊醇(25 24 1)和氯仿异戊醇 (24 1)各抽提一次，用无水乙醇沉淀、TE溶解，加入RNaSe，37°C 30分钟，加入上样缓冲 液后，于90V、1.2%琼脂糖凝胶电泳2h。电泳完毕，于紫外观察仪上观察并拍照。结果上 述肿瘤细胞经20 μ g/mL南瓜蛋白处理72h，均可见明显的DNA Ladder条带。而对照组仅见 一基因组DNA条带。结果表明，南瓜蛋白对胃癌，肝癌和黑色素瘤细胞均具有显著的诱导凋亡作用。
实施例3 南瓜蛋白对肿瘤细胞的诱导分化作用(以黑色素瘤B16细胞为模型)(1)细胞形态观察将对照组及实验组B16细胞培养72h后，分别用相差显微镜和 透射电子显微镜观察细胞形态并拍照。结果如下①光学显微镜观察对照组B16细胞呈多层不规则生长，具有重叠的圆形细胞；南 瓜蛋白作用后，细胞呈一定的极性生长，平行排列，不重叠；3d后，南瓜蛋白浓度在2. 5 μ g/ mL以上者，细胞极性明显，多数细胞体积变大，具有树突状结构，细胞间连成网状，生长缓 慢，细胞数变少。②电镜观察对照组B16细胞表面可见较多微绒毛，细胞核多数较大且为椭圆形， 核内以常染色质为主，胞浆内细胞器较少，黑色素颗粒少见；20 μ g/mL南瓜蛋白处理3d后， B16细胞体积多数变大，表面较光滑，微绒毛减少，细胞核减小且不规则，核内异染色质增 多，胞浆内细胞器丰富，可见大量不同成熟期的黑色素小体，部分细胞大量黑色素小体聚集 成团。(2)南瓜蛋白对黑色素瘤细胞增殖周期的影响收集经10 μ g/mL南瓜蛋白处理24 小时的B16细胞，1500r/min离心lOmin，沉淀经70%乙醇固定12小时，PBS洗涤2遍后重 悬，用300目尼龙网过滤，以碘化丙啶(PI)溶液在室温避光染色30m in，流式细胞仪分析。 结果B16细胞经1(^8/!^南瓜蛋白处理241!后，G2/M期细胞减少，S期细胞明显减少，而 GcZG1期细胞增多。提示南瓜蛋白可阻止B16细胞由G1期向S期过渡从而停滞于G1期。(3)南瓜蛋白对黑色素瘤细胞黑色素含量的影响接种对数生长期的B16细胞至6 孔板，每孔1. 5 X 105，每组3孔，d2加入南瓜蛋白，终浓度分别为1. 25,2. 5、5和10 μ g/mL，作 用72h后用PBS洗涤3次，0. 25%胰酶消化、计数，1000r/min离心lOmin，细胞沉淀溶于IM NaOH-IO % DMSO溶液ImL中，室温放置30min，于400nm波长测定吸收度值(A4J，将结果换 算成IO6细胞的吸收度。结果对照组B16细胞黑色素含量为0. 040 士0. 002 (A4ticZlO6细胞)， 而1·25、2·5、5和10 μ g/mL南瓜蛋白组黑色素含量分别为0. 088士0. 007,0. 165士0. 003、 0. 225士0. 006和0. 309士0. 008 (A400/IO6细胞)。可见，经南瓜蛋白处理后B16细胞黑色素 含量明显增加。结果表明，南瓜蛋白对黑色素瘤细胞具有明显的诱导分化作用。实施例4 南瓜蛋白对动物移植瘤的抑制作用(1)南瓜蛋白对宫颈癌U14的抑制作用选择肿瘤生长良好、全身状态较好的荷瘤 小鼠，颈椎脱白处死，固定后碘酒酒精消毒，无菌条件下取出瘤块，将肿瘤(g)和生理盐水 (mL)以1 4比例勻浆后，于皮下接种ICR小鼠(合格证号SCXK (闽)2004-0002)，每只 0. 2mL。将动物随机分组并于接种24h后腹腔注射给药，设0. 25、0. 5和lmg/kg三个剂量组， 同时设环磷酰胺组和生理盐水对照组，每2天给药1次，共5次后，颈椎脱白处死，分别称取 体重和瘤重。计算肿瘤生长抑制率(％)肿瘤生长抑制率％= (1-给药组平均瘤重/对照 组平均瘤重)X 100 ；并将结果进行统计学处理。结果南瓜蛋白0. 25,0.5和lmg/kg对宫颈癌U14均具有明显的抑制作用，抑制率 分别为 22. 57%、41· 17%和 58.26% (表 2)。(2)南瓜蛋白对黑色素瘤B16的抑制作用将黑色素瘤B16于皮下接种纯系小鼠 C57(合格证号SCXK (沪)2003-0003)按上述方法测定南瓜蛋白对黑色素瘤B16的抑制作用。
结果南瓜蛋白0. 25、0. 5和lmg/kg对黑色素瘤B16均具有明显的抑制作用，抑制 率分别为 22. 26%,36. 55%和 52. 21% (表 3)。(3)南瓜蛋白对肺癌Lewi s的抑制作用将肺癌Lewi s于皮下接种纯系小鼠 C57(合格证号SCXK (沪)2003-0003)按上述方法测定南瓜蛋白对肺癌Lewis的抑制作用。结果南瓜蛋白0. 25、0. 5和lmg/kg对肺癌Lewis均具有明显的抑制作用，抑制率 分别为 30. 80%、50. 76% 和 65. 54% (表 4)
表2南瓜蛋白对小鼠U14瘤重的影响(x+s) 注与对照组比较， < 0. 01表3南瓜蛋白对小鼠B16瘤重的影响(x+s) 注与对照组比较，**p < 0. 01广ρ < 0. 001表4南瓜蛋白对小鼠Lewis瘤重的影响(x+s) 注与对照组比较，**p< 0. 01 ；***p < 0. 001从上述实验结果可得出，本发明的南瓜蛋白的有益效果在于南瓜蛋白显著抑制 体外培养的胃癌细胞SGC79tll，肝癌细胞!fepG2、Bel7404,非小细胞肺癌细胞A549，乳腺癌细胞 MCF-7及黑色素瘤细胞B16的增殖，而对人正常肝细胞和外周血淋巴细胞抑制作用较小，表 现出明显的选择性，南瓜蛋白亦能在体内明显抑制宫颈癌U14、黑色素瘤B16和肺癌Lewis 等动物移植瘤。因此，本发明证实南瓜蛋白具良好的体内外抗实体瘤作用。过细胞形态观 察、细胞增殖周期分析及琼脂糖凝胶电泳测定等研究发现，南瓜蛋白对胃癌、肝癌和黑色素瘤等实体瘤细胞具有诱导凋亡的作用；此外，以黑色素瘤B16细胞为模型，通过细胞形态观 察、流式细胞仪分析及黑色素含量测定等研究发现，南瓜蛋白对黑色素瘤细胞尚具有诱导 分化的作用。对肿瘤细胞的诱导凋亡和诱导分化作用同时存在，但低浓度时以诱导分化为 主，而高浓度时则具有显著的诱导凋亡的作用。因此，本发明证实南瓜蛋白具有诱导肿瘤细 胞分化和凋亡的作用机制。实施例5 南瓜蛋白和天花粉蛋白对胃癌、肝癌及黑色素瘤细胞的增殖抑制作用 的比较
分别取对数生长期的胃癌SGC79m、肝癌Bel74tl4和黑色素瘤B16细胞，接种于96孔 培养板上，每孔接种量3000 4000个/100 μ 1。培养隔夜后，实验组加不同浓度的南瓜 蛋白或天花粉蛋白100 μ 1，每个浓度做三个复孔；阴性对照组加营养液100μ 1，空白对照 孔加营养液100μ 1，用于仪器调零。作用不同时间(24、48、72小时)后，每孔加5mg/ml的 ΜΤΤ20μ 1，继续培养4小时，甩去上清，每孔加二甲亚砜150μ 1。用酶标仪(BI0-RAD产品) 测定570nm各孔的吸光度值，各组取平均值，并计算抑制率。抑制率=(1_实验组OD值/ 对照组OD值)XlOO%结果见表5:表 5 南瓜蛋白2.01*10"' 4.20*10·' 0.718*10·' 天花粉蛋白 2.25*10"7 2.60* IO"7 2’38*10'权利要求
南瓜蛋白作为制备治疗肺癌药物的应用。
全文摘要
南瓜蛋白在制药中的应用，能够从南瓜果肉中分离出一种核糖体失活蛋白-南瓜蛋白，该蛋白显示了良好的抗肿瘤活性，可用于制备抗肿瘤药物。南瓜蛋白能显著抑制体外培养的胃癌细胞SGC7901，肝癌细胞HepG2、Bel7404，非小细胞肺癌细胞A549，乳腺癌细胞MCF-7及黑色素瘤细胞B16，而对人正常肝细胞和外周血淋巴细胞的抑制作用较小，表现出明显的选择性；南瓜蛋白亦能在小鼠体内明显抑制宫颈癌U14、黑色素瘤B16和肺癌Lewis等动物移植瘤。此外，本发明也证实了南瓜蛋白对肿瘤细胞的诱导凋亡和诱导分化作用是其抗肿瘤活性的重要机制。
文档编号A61P35/00GK101843894SQ20091017427
公开日2010年9月29日 申请日期2005年11月3日 优先权日2005年11月3日
发明者谢捷明, 陈明晃 申请人:中国科学院福建物质结构研究所;福建医科大学
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