抗流感病毒疫苗及所述病毒疫苗的制备方法
专利名称：抗流感病毒疫苗及所述病毒疫苗的制备方法
技术领域：
本发明涉及医学领域并可以用于免疫学，特别是流感和急性呼吸系统疾病的预防。
背景技术：
流行性感冒被认为是影响所有人群的最为广泛传播的以病毒为病因的感染性疾病。这种疾病传播的快速性和流感基因组的高度变异性是造成严重大流行的原因。因此抗流感病毒疫苗对于这种疾病的预防是极为重要的。
在现有技术中已知包括整个病毒颗粒制剂的活流感病毒疫苗(Peradze T.V.等，“抗流感预防性制剂”，莫斯科，Meditsina出版社，1986，79-81页，(俄语))。活疫苗的无害性、快速制备实际病毒株疫苗的可能性、它们的低成本及给药的简便性使应用这种疫苗预防流感成为可能。
然而，活疫苗中减毒的病毒可以突变，重新获得毒力和某些其他不可预知的特性。活疫苗的非标准反应原性及其不足的抗原活性使其需要至少两次经鼻给药，限制了活疫苗在大规模免疫接种时的应用。
这些弊端可以通过使用灭活疫苗来克服(Barry D.W.，MaynerR.E.，Staton E.等，流感疫苗的比较试验。全病毒疫苗和裂解产物疫苗在人体中的免疫原性。-美国流行病学杂志，1976，104卷，第一期，34-46页)。
然而，活疫苗和灭活疫苗含有大量可引起副作用和并发症的稳定物质(ballast substances)，这使它们对于大规模预防并不安全。
已知裂解疫苗和亚单位疫苗含有从病毒颗粒分离的主要抗原成分血凝素(H)和神经氨酸酶(N)。裂解流感疫苗诱导产生足够高水平的免疫，并且无主要的稳定物质。例如，一种商品名为“Vaxigrip”由Pasteur Merieux(法国)生产的疫苗被广泛应用。“Vaxigrip”疫苗具有高免疫原性和低反应原性的特点，并被推荐用于从6个月大的婴儿以上的儿童以及高危人群的免疫接种。
亚单位疫苗具有最低的反应原性，但有效性稍差，因此为获得必需的免疫应答它们需要以2-3星期间隔至少两次施用足够大的剂量，这在实质上妨碍了大规模抗流感免疫接种计划的实施。为了增强抗原活性，制备亚单位疫苗时添加了吸附剂或完整的病毒颗粒，这也对制剂的安全性和反应原性产生了不利影响。
在所有已知的疫苗中，与这里所述发明最为接近的是由流感病毒的疫苗抗原和一种聚合载体反应制备的抗流感疫苗(RU 1580617，IPCA61K 39/145，1996年公开)。通过化学性结合制备的抗原-聚合疫苗引起免疫细胞活化和对免疫应答基因调控的表型修正。这种疫苗特征在于反应原性弱并且对儿童和高危人群进行免疫接种是无害的。
然而，结合到低分子量聚合载体的该已知疫苗中的疫苗蛋白在制剂的使用和贮存中不够稳定，因此即便在其特定贮存条件得到满足的情况下，该已知疫苗也不总能达到严格的使用期要求。该已知疫苗的免疫原性也相对较低，需要给予足够大剂量的制剂以获得必需的免疫应答。
此外，在该已知疫苗中采用的聚合载体不能与疫苗抗原形成静电络合物，后者在生理条件下稳定，因此使用简单、安全又经济的配位技术生产抗流感病毒疫苗的可能性被排除。
已知的通过将流感病毒的疫苗抗原与一种聚合载体反应生产抗流感病毒疫苗的方法使获得新一代的疫苗成为可能一种缀合的聚合物亚单位疫苗，不考虑免疫应答的基因控制，缀合物的抗原性部分可产生有效的免疫应答。
然而，实施已知方法要使用有毒性的琥珀酰亚胺酯，使该方法的实施对生态环境不利，并需要采取特殊措施进行精细纯化，使疫苗生产技术复杂化，对生产条件和安全技术提出了更高的要求。生产抗流感病毒疫苗的该已知方法在技术有效性不足的同时，对物质和劳力资源的消耗也相当可观，而目标产品的产率不超过20-30％。生产抗流感病毒疫苗的该已知方法在疫苗生产的所有步骤中缺乏有效客观的控制，这对制剂参数的可重复性不利。
发明内容
本发明旨在提供一种对所有年龄组人群都安全的抗流感病毒疫苗，增加疫苗的预防有效性并很大程度减少制剂的接种剂量。
本发明的另一目的是提高疫苗生产过程的技术有效性，通过使用将聚合载体与疫苗抗原形成化合物的新方法拓宽技术潜力，降低对安全工艺和生态生产条件的要求，改善目标产品的质量。
所述目标的实现是通过一种抗流感病毒疫苗，它包含聚合载体与流感病毒的疫苗抗原的化合物，其中使用以下通式的杂链聚胺衍生物作为聚合载体 其中n是基本单元的数目；q是烷化单元的数目；z是氧化单元的数目；A是CH或N。
根据本发明，使用分子量为50000到150000Da的杂链聚胺衍生物有利。
根据本发明，选择抗原/载体之比等于1∶5-30有利。
根据本发明，选择n＝350-1000，q＝(0.2-0.4)n，z＝(0.4-0.8)n，x＝2或4，y＝1或2有利。
设定目标是通过流感病毒的疫苗抗原与杂链聚胺衍生物共价偶联为所述化合物实现的，形成以下通式的缀合物 其中R表示流感病毒的疫苗抗原。
设定目标还通过包含流感病毒的疫苗抗原与杂链聚胺衍生物通过静电键结合形成的络合物的所述化合物而实现。
作为杂链聚胺衍生物，优选使用以下通式的1，4-乙烯哌嗪N-氧化物和(N-羧乙基)-1，4-乙烯哌嗪鎓溴化物的共聚物 根据本发明，使用以下通式的1，4-乙烯哌啶N-氧化物和(N-羧乙基)-1，4-乙烯哌啶鎓溴化物的共聚物作为杂链聚胺衍生物也是有利的 作为流感病毒的疫苗抗原，优选使用流感病毒的表面蛋白。
根据本发明，使用血凝素和/或神经氨酸酶作为流感病毒的表面蛋白有利。
根据本发明，使用流感病毒的内部蛋白-基质蛋白(M-蛋白)和核蛋白(NP-蛋白)作为流感病毒的疫苗抗原有利。
根据本发明，联合使用流感病毒的表面蛋白和内部蛋白作为疫苗抗原有利。设定目标还通过制备抗流感病毒疫苗的方法实现，所述方法包括使流感病毒的疫苗抗原与聚合载体反应，其中杂链聚胺衍生物被用作聚合载体，它们与流感病毒的疫苗抗原的反应通过叠氮化物法实现。
根据本发明，使用分子量为50000到150000Da的杂链聚胺衍生物有利。
根据本发明，使杂链聚胺衍生物与流感病毒的疫苗抗原在抗原/载体之比为1∶5-30的条件下反应有利。
根据本发明，预活化杂链聚胺衍生物有利。
杂链聚胺衍生物的活化应当优选通过引入酰肼基团而实现。
设定目标还通过制备抗流感病毒疫苗的方法实现，所述方法包括使流感病毒的疫苗抗原与聚合载体反应，其中杂链聚胺衍生物被用作聚合载体，它们与流感病毒的疫苗抗原的反应在配位反应的辅助下完成。
根据本发明，杂链聚胺衍生物与流感病毒的疫苗抗原的配位反应在抗原/载体之比为1∶5-30的条件下进行有利。
设定目标通过杂链聚胺衍生物和流感病毒的疫苗抗原的带相反电荷的大分子之间发生配位反应而实现。
根据本发明，使用1，4-乙烯哌嗪N-氧化物和(N-羧乙基)-1，4-乙烯哌嗪鎓溴化物的共聚物作为杂链聚胺衍生物，并使用流感病毒的表面蛋白血凝素和神经氨酸酶作为疫苗抗原，在pH5.8的磷酸缓冲液、温度2-4℃的条件下进行配位反应是有利的。
由于使用本身具有促免疫活性的杂链聚胺衍生物作为聚合载体，本发明使流感病毒抗原具有高免疫原性及稳定性，从而可形成免疫记忆，大大减少(与流感疫苗的世界标准相比减少大约3倍)抗原的接种剂量，增强机体对其他感染的抵抗力。
本发明还简化并加速了抗流感病毒疫苗的生产过程，减少了能耗强度并改善了生产的生态安全性，从而使目标产品的质量得以提高，产率增加。
要求保护的发明还使获得的抗流感病毒疫苗具有稳定可重复的理化参数及生理特征，表现出对外界因素的高度稳定性。
本发明的其他目的和优势将从以下对抗流感病毒疫苗及其生产方法以及所述方法和所生产疫苗的具体实施方案的详述中可见。
具体实施例方式
根据本发明的抗流感病毒疫苗是流感病毒的疫苗抗原与杂链聚胺的水溶性衍生物通过强共价键形成的缀合物，或者是这些成分之间通过稳定静电偶联形成的络合物制剂。
所述抗流感病毒疫苗是一种高分子化合物，其分子量在1-3mlnDa数量级，分子直径为50-80nm，等电点为7.25。
传统上在流感疫苗中使用流感病毒的表面抗原分子量为77000Da的血凝素(HA)和分子量为220000Da的神经氨酸酶(NA)，它们是病毒颗粒的表面蛋白(超衣壳亚单位)，等电点分别为6.9和7.1。
这些抗原促使抗体免疫应答的形成并提供针对同源病毒感染的保护，因为HA抗体具有病毒中和活性。
用于生产所述疫苗的流感病毒内部抗原(核衣壳亚单位)-分子量为170000Da、等电点6.5的核蛋白(NP蛋白)和分子量为64000Da、等电点6.8的基质蛋白(M蛋白)-在感染过程中也起着重要作用。已知在感染了流感或接种了完整病毒颗粒疫苗的人体内，抗体的产生同时针对表面的HA和NA抗原以及内部的M蛋白和NP蛋白。
为了从相应病毒株中分离疫苗抗原，采用了使用非离子去污剂的技术。使流感病毒在10天大的鸡胚尿囊腔中生长，并通过蔗糖密度分级梯度技术纯化浓缩。
杂链聚胺衍生物是水溶性、无毒、完全生物源性的化合物，具有显著的免疫调节特性。
杂链聚胺衍生物是通过“活”阳离子聚合方法合成聚乙烯哌啶类，随后将合成的杂链聚胺氧化和烷化而获得的。这样获得的物质具有恰当的生理和药理学活性。
所述高分子水溶性免疫调节载体对疫苗抗原的修饰可增强亚单位的免疫原性。由于所述杂链聚胺衍生物与流感病毒的疫苗抗原之间形成稳定的共价或静电偶联(取决于制备化合物的方法)，所述抗原具有了高度稳定性并且它们的免疫原性得到增强，因此可以减少抗原的接种剂量。对流感病毒抗原形成免疫记忆变得更为有效。同时，机体对抗其他感染的保护性加强，其结果是疫苗的整体预防活性增强。此外，无毒水溶性载体的使用令疫苗的安全性增加，使其适于自6个月婴儿以上的儿童接种。
基于杂链聚胺衍生物与流感病毒的保护性抗原形成的缀合物的抗流感病毒疫苗的制备方法按如下方式进行。
-在对生产本发明的抗流感病毒疫苗的方法的描述中，为了明确起见，1，4-乙烯哌嗪N-氧化物和(N-羧乙基)-1，4-乙烯哌嗪鎓溴化物的共聚物(CPL)，商品名“polyoxidonium”，被选作杂链聚胺的起始衍生物。
首先，制备活化形式的杂链聚胺衍生物CPL。为此，将起始CPL用水合肼修饰。
将活化后获得的CPL酰肼与流感病毒保护性抗原按5-30∶1的比例混合并按叠氮化物法反应，结果流感病毒的疫苗抗原与高分子合成载体发生共价偶联，并在聚合载体的羧基与蛋白分子赖氨酸残基的伯氨基之间形成稳定的共价酰胺偶联。
所述的合成在严格控制的条件下进行，以获得具有规定结构和蛋白/聚合物比的制剂。叠氮化物法的使用和对反应条件的严格遵循可完全避免分子间和分子内交联、保存活性中心并获得目标产品的高产率和高质量。
基于杂链聚胺水溶性衍生物中的高分子聚合载体与流感病毒的保护性抗原形成的配位化合物，该抗流感病毒疫苗的制备方法按如下方式进行。
将CPL溶于pH5.8的磷酸缓冲液。将溶于相同缓冲液中的流感病毒的疫苗抗原溶液加入到所述CPL溶液中。
取决于对参与反应的特定杂链聚胺衍生物和保护性抗原的选择，络合物强度各异。为了形成强静电偶联，应当选择溶液中成分的最佳比例。通过向聚合物溶液中按抗原/载体比1∶5-30缓慢加入蛋白溶液来进行配位反应。在所指示的pH值下，聚合载体CPL和流感病毒表面抗原的大分子带有相反电荷，并且作为所述反应的结果，它们形成稳定的静电偶联。
制剂通过层析分离。
使用聚丙烯酰胺凝胶(PAAG)SDS电泳、电子显微镜、荧光光谱、圆二色性法等方法对所获得化合物的组成及其特性进行了分析，这些方法能定量评价蛋白与载体的偶联程度，确定偶联位置，并支持缀合物组成中蛋白的构象稳定性。
通过在实验动物中研究免疫系统和机体作为整体的反应，并通过在志愿者身上测试疫苗来评价所得化合物的免疫原性和保护性。
所进行的研究表明，按这里所述发明制备的缀合或络合物制剂形式的抗流感病毒疫苗具有如下优点-免疫原性比亚单位疫苗高10倍，-最佳活性pH为7.25，接近生理液体的pH值，提供高生物利用率，-制剂使用完全安全，因为只采用流感病毒的高度纯化的疫苗抗原，并且以蛋白计接种量比传统疫苗低3到5倍，-在整个流行季节单次免疫接种疫苗即有效，-在缀合或络合物制剂组成中疫苗抗原的稳定性超出天然蛋白的稳定性100倍以上，-基于杂链聚胺高分子水溶性衍生物的聚合载体具有显著的适宜的免疫调节活性，因此疫苗的免疫原性和预防活性显著增强。
对志愿者进行的研究是在流感和急性呼吸系统疾病(ARD)发病率季节性上升期间进行单次免疫接种。从对成人流感和ARD发病率的分析明显看出，外对照组中流感发病率为每千观察中92.3，大大高于接种了这里所述发明疫苗的个体的组(每千名接种个体中26.7)和内对照组(每千观察中36)。进行了流感病因诊断的血清学解释。
通过使用恰当的公式，可以由流行病学实验数据所得到的特征确定制剂作为疫苗的最重要特性，即-效力指数为3.4，-预防效力因子为77％，-在总体50％免疫中间层的存在下，抗流行保护因子为68％。
在以下讨论的本发明具体实施方案中，实施例1-12描述了制备抗流感病毒疫苗的方法的不同实施方案，实施例13-15呈现了对实施例1-12中获得制剂的效力的实验评估。对制剂效力的评估结果反映在表1-4中。
实施例1.在叠氮化物法缀合的帮助下，制备基于与流感病毒表面蛋白HA和NA形成的CPL缀合物的疫苗。
第一步合成活化形式的载体-CPL酰肼。
将500mg的CPL(n＝700，q＝0.2，z＝0.8，MW＝80000，MWD＝1.33)溶于25ml的甲醇。在20℃下加入0.2ml(2×10-3M)的水合肼。反应进行24小时。此后将甲醇通过旋转式蒸发器蒸馏掉，将残余物溶于水，进行醚萃取。使用“Millipore”膜通过超滤技术分离成品，随后冻干。
酰肼基团的含量通过使用2，4，6-三硝基苯磺酸滴定伯氨基的标准方法测定。酰肼基团的含量为15％。
第二步通过CPL酰肼与HA和NA的缩合反应制备缀合物。
将100mg的CPL酰肼溶于4ml 1N的HCl。将溶液冷却至0-2℃。然后在搅拌和冷却下加入1.15ml 3％的亚硝酸钠溶液。15分钟后加入2N NaOH调节溶液pH至8.5。
将HA和NA蛋白的20mg混合物(按95∶5的比例)溶于10ml0.05M pH8.5的缓冲溶液，并加入到CPL酰肼溶液中。通过加入2NNaOH保持反应pH值等于8.5。在搅拌并冷却至0-2℃条件下反应进行12小时。为了分离和纯化缀合物，将反应混合物装到SephadexG-100柱(2.6×90)上，洗脱剂为0.05M的磷酸缓冲液，pH7.5，含0.05M NaCl。通过流式分光光度计在λ＝226nm控制缀合物产率。通过荧光光谱和聚丙烯酰胺凝胶(PAAG)电泳测定抗原含量并分析缀合物。蛋白/CPL缀合物的摩尔比为1∶5。缀合物产率为97％。
通过NMR-光谱和IR-光谱技术测定共聚物组成，分子量和分子量分布通过小角度激光散射法测定。
实施例2.制备基于与流感病毒表面蛋白HA和NA形成的CPL络合物的疫苗。
将100mg的CPL(n＝1000，q＝0.4，z＝0.4，MW＝145000，MWD＝1.7)溶于10ml 0.05M pH＝5.8的磷酸缓冲液。在2-4℃下加入含10mg HA和NA混合物(比例95∶5)的2ml同样缓冲液。在所述pH值下聚合载体和抗原的大分子带相反电荷。
通过向聚合物溶液中缓慢加入抗原溶液进行配位反应，不使沉淀生成。反应混合物在2-4℃温度下保持24小时。反应一完成，加入氢氧化钠溶液将溶液pH值调到7.1。蛋白/CPL摩尔比为1∶10。目标产品的产率为96％。测定蛋白含量并通过荧光光谱和PAAG电泳分析化合物。
实施例3.过程同实施例1，用作为抗原载体的CPL具有以下特征n＝400，q＝0.3，z＝0.7，MW＝60000，MWD＝1.1，并用流感病毒的内部蛋白M-蛋白和NP-蛋白作为流感病毒的疫苗抗原。蛋白/CPL的摩尔比为1∶6。缀合物中的蛋白通过Lowry法分析。
实施例4.过程同实施例1，用作为载体的CPL具有以下特征n＝900，q＝0.35，z＝0.65，MW＝100000，MWD＝1.6，并用流感病毒的表面HA和NA蛋白与内部M-蛋白和NP-蛋白的混合物作为疫苗抗原。蛋白/CPL的摩尔比为1∶5。蛋白含量通过Bradford法测定。
实施例5.过程同实施例2，用作为载体的CPL具有以下特征n＝540，q＝0.25，z＝0.75，MW＝78000，MWD＝1.8，并用流感病毒的内部M-蛋白和NP-蛋白作为疫苗抗原。蛋白/CPL的摩尔比为1∶30。蛋白含量通过Bradford法测定。
实施例6.过程同实施例2，用作为载体的CPL具有以下特征n＝900，q＝0.3，z＝0.7，MW＝135000，MWD＝1.7，并用流感病毒的表面HA和NA蛋白与内部M-蛋白和NP-蛋白的混合物作为疫苗抗原。蛋白/CPL的摩尔比为1∶25。
实施例7.过程同实施例1，使用具有以下特征的1，2-乙烯哌啶N-氧化物和(N-羧乙基)-1，2-乙烯哌啶鎓溴化物的共聚物(CPL-A)作为流感病毒的疫苗抗原的载体n＝100，q＝0.4，z＝0.4，MW＝145000，MWD＝1.7，并用HA和NA作为抗原。抗原-载体比为1∶10。蛋白通过Lowry法分析。
实施例8.过程同实施例1，用作为载体的CPL-A具有以下特征n＝400，q＝0.3，z＝0.7，MW＝60000，MWD＝1.1，并用流感病毒的内部蛋白基质M-蛋白和NP-蛋白作为疫苗抗原。抗原-载体摩尔比为1∶8。蛋白通过Lowry法分析。
实施例9.过程同实施例1，用作为载体的CPL-A具有以下特征n＝900，q＝0.35，z＝0.65，MW＝110000，MWD＝1.6，并用流感病毒的表面HA和NA蛋白与内部M-蛋白和NP-蛋白的混合物作为疫苗抗原。抗原-载体摩尔比为1∶5。蛋白含量通过Bradford法测定。
实施例10.过程同实施例2，用作为载体的CPL-A具有以下特征n＝540，q＝0.25，z＝0.75，MW＝78000，MWD＝1.8，并用流感病毒的表面蛋白HA-蛋白和NA-蛋白作为疫苗抗原。抗原/载体摩尔比为1∶30。蛋白通过Lowry法分析。
实施例11.过程同实施例2，用作为载体的CPL-A具有以下特征n＝950，q＝0.3，z＝0.7，MW＝120000，MWD＝1.7，并用流感病毒的内部M-蛋白和NP-蛋白作为疫苗抗原。抗原/载体摩尔比为1∶25。制剂中的蛋白含量通过Lowry法测定。
实施例12.过程同实施例2，用作为载体的CPL-A具有以下特征n＝600，q＝0.4，z＝0.4，MW＝90000，MWD＝1.7，并用流感病毒的表面HA和NA蛋白与内部M和NP蛋白的混合物作为疫苗抗原。抗原/载体摩尔比为1∶20。蛋白含量通过Lowry法测定。
实施例13.研究疫苗抗流感病毒的效力。
为了建立特异性并测定特异性抗体滴度的增高，进行了小鼠血清和志愿者血清的血凝抑制反应(HAIR)试验来评价抗原活性。
在去除非特异性抑制物后，将两倍稀释的血清0.2ml置于Plexiglas板的各孔中。向每份稀释血清中加入4AU量的0.2ml同源抗原。摇动混合物并在20±2℃的温度下静置30分钟。此后向每孔中加入0.4ml1％的鸡红细胞悬液。再次摇动混合物并在20±2℃的温度下静置40-45分钟(直至对照中红细胞沉淀)。此后依照4-交叉系统计算反应结果。抗原滴度或一个凝集单位(1AU)被设定为造成显著的红细胞凝集的最大抗原稀释度。如果血清中存在特异性抗体，红细胞的凝集延迟发生。血清中的抗体滴度被定为完全抑制血凝的抗原的极限稀释度。
实验中使用的是体重18-20克的(CBA×C57B1/6)F1系性成熟小鼠。将从相应的H3N2、H1N1、B型流感病毒株分离获得的HA、NA、M-蛋白和NP-蛋白用作抗原，以及在其与聚合载体CPL和CPL-A形成的化合物的基础上生产的制剂。
抗原剂量根据小鼠预实验选择。每组包括8-10只小鼠。所有制剂都以0.5ml的量腹腔内给药。对照组的小鼠给予0.5ml的生理溶液。采用两周后再次接种的两次接种方案。第二次免疫接种后的12天，通过血凝抑制反应(HAIR)测定所研究制剂的免疫原性。
所获结果如表1所示，其中位置13显示对照组的抗原活性。
表1
表1显示的数据说明，在所有给予本发明制剂的实验组中，通过血凝抑制反应测得的抗体滴度都超出了对照组，即，观察到对施用制剂显著的抗原应答。
实施例14.评估抗流感病毒疫苗的免疫原性。
将制剂以不同的剂量并按不同的方案给予近交(CBA×C57B1)F1系小鼠。此后进行了对抗原特异性免疫反应的多参数研究，包括测定被免疫动物血清中HA-特异性抗体的含量。
将制剂于缓冲溶液中稀释并以蛋白计0.1到10mg/只小鼠的剂量经腹腔内或尾根部皮下给药。为诱导继发性免疫反应，在第一次给药后21天进行第二次注射。在免疫接种后限定的时间内将小鼠断头，取血并获得血清。
采用免疫-酶分析法(IEA)测定血清中HA-特异性抗体的含量。按常规步骤在96孔聚苯乙烯板内进行分析。
在第一次和第二次免疫接种后测定实验组和对照组的抗体IEA-滴度，并计算特异性免疫记忆因子Kim和特异性免疫刺激因子Kss。对照组小鼠未形成免疫记忆。
这些因子不依赖于滴度的绝对值，并且是疫苗制剂免疫原性的客观特征。分析结果如表2所示。
表2
表2显示的结果说明，根据本发明生产的所有制剂都具有免疫原性并形成免疫记忆。
实施例15.依照认可的测试记录单在志愿者中评估本发明疫苗的免疫原性。接受免疫接种的志愿者选自血清阴性个体(HAIR滴度小于10)，年龄30到40岁。每组包括10-12个人。肌内接种至左臂三角肌区域，使用一次性注射器注射单剂0.5ml。每剂含有(5±1)μg A型流感病毒(H1N1)的血凝素和相应于实施例1、2、4、6所述剂量的载体CPL-1。对照组个体给予0.5ml的生理溶液。
为评估所研究制剂的免疫原性，使用疫苗流感病毒株对被接种个体在接种前和接种一个月后取样的成对血清进行血凝抑制反应(HAIR)研究。通过产生保护性抗体滴度的个体所占的百分比评估制剂的有效性。如果HAIR中抗体滴度超过1∶40，则该个体被认为受到免疫保护。
对疫苗免疫原性的研究结果见表3。
表3
表3中的实验数据说明接种本发明制剂的个体中形成了高水平的免疫应答及高的保护性抗体滴度。
实施例16.在病毒中和实验中评估抗流感病毒疫苗的有效性。
按测定用所述制剂免疫的小鼠血清的病毒中和活性的步骤测定“保护性”抗体的滴度。
实验进行同实施例14。两次给予小鼠(间隔21天)最适免疫原剂量的疫苗后，取其血清并通过活流感病毒灭活实验研究疫苗活性。为了这一目的，将不同稀释度的血清与流感病毒的悬液混合，并按照普遍采用的方法评估病毒中和抗体的滴度。小鼠血清的病毒中和滴度被认为是消除50％胚胎中尿囊液血凝活性的最大稀释度。评估结果见表4。
表4
已知流感病毒中和实验中1∶400的滴度及血清转变因子等于40是抗流感病毒疫苗有效性的可靠特征，并被认为是“保护性”滴度。表4所示数据表明用本发明制剂免疫的小鼠血清与正常小鼠血清相比，含有至少40倍量的病毒中和抗体。
工业实用性本发明将可应用于生产新一代的抗流感疫苗，由于含聚合免疫调节载体，该疫苗特征为具有显著的免疫原性、高度安全性和预防有效性。这拓宽了它们在不同人群中用于预防流感的可能性，包括在儿童和高危人群中使用。
权利要求
1.一种抗流感病毒疫苗，其包含聚合载体与流感病毒的疫苗抗原的化合物，其特征在于使用以下通式的杂链聚胺衍生物作为聚合载体 其中n是基本单元的数目；q是烷化单元的数目；z是氧化单元的数目；A是CH或N。
2.根据权利要求1的疫苗，其特征为所述杂链聚胺衍生物的分子量为50000-150000Da。
3.根据权利要求1或2的疫苗，其特征为n＝350-1000，q＝(0.2-0.4)n，z＝(0.4-0.8)n，x＝2或4，y＝1或2。
4.根据权利要求1或2的疫苗，其特征为所述化合物的抗原/载体比等于1∶5-30。
5.根据权利要求1的疫苗，其特征为所述化合物包含流感病毒的疫苗抗原与杂链聚胺衍生物共价偶联的缀合物，其通式为 其中R表示流感病毒的疫苗抗原。
6.根据权利要求1的疫苗，其特征为所述化合物包含流感病毒的疫苗抗原与杂链聚胺衍生物通过形成静电偶联得到的络合物。
7.根据权利要求1的疫苗，其特征为使用以下通式的1，4-乙烯哌嗪N-氧化物和(N-羧乙基)-1，4-乙烯哌嗪鎓溴化物的共聚物作为杂链聚胺衍生物
8.根据权利要求1的疫苗，其特征为使用以下通式的1，4-乙烯哌啶N-氧化物和(N-羧乙基)-1，4-乙烯哌啶鎓溴化物的共聚物作为杂链聚胺衍生物
9.根据权利要求1的疫苗，其特征为使用流感病毒的表面蛋白作为流感病毒的疫苗抗原。
8.根据权利要求1的疫苗，其特征为使用血凝素和/或神经氨酸酶作为流感病毒的疫苗抗原。
9.根据权利要求1的疫苗，其特征为使用流感病毒的内部蛋白-基质蛋白和核蛋白作为流感病毒的疫苗抗原。
10.根据权利要求1的疫苗，其特征为使用流感病毒的表面和内部蛋白作为流感病毒的疫苗抗原。
11.一种制备抗流感病毒疫苗的方法，其包括使流感病毒的疫苗抗原与聚合载体反应，特征为使用杂链聚胺衍生物作为聚合载体，并且它们与流感病毒的疫苗抗原的反应通过叠氮化物法实现。
12.根据权利要求11的方法，其特征为所用杂链聚胺衍生物的分子量为50000-150000Da。
13.根据权利要求11的方法，其特征为杂链聚胺衍生物与流感病毒的疫苗抗原的反应在抗原/载体比为1∶5-30的条件下进行。
14.根据权利要求11的方法，其特征为杂链聚胺衍生物经过预活化。
15.根据权利要求14的方法，其特征为杂链聚胺衍生物的活化通过引入酰肼基团实现。
16.一种制备抗流感病毒疫苗的方法，其包括使流感病毒的疫苗抗原与聚合载体反应，特征为使用杂链聚胺衍生物作为聚合载体，且其与流感病毒的疫苗抗原的反应通过配位反应的方式进行。
17.根据权利要求16的方法，其特征为杂链聚胺衍生物与流感病毒的疫苗抗原的配位反应在抗原/载体比为1∶5-30的条件下进行。
18.根据权利要求16或17的方法，其特征为所述配位反应在带相反电荷的杂链聚胺衍生物和流感病毒的疫苗抗原的大分子之间进行。
19.根据权利要求16的方法，其特征为使用1，4-乙烯哌嗪N-氧化物和(N-羧乙基)-1，4-乙烯哌嗪鎓溴化物的共聚物作为杂链聚胺衍生物，并且使用流感病毒的表面蛋白血凝素和神经氨酸酶作为疫苗抗原，所述配位反应在pH5.8的磷酸缓冲液、2-4℃的温度条件下进行。
全文摘要
一种抗流感病毒的疫苗包括杂链聚胺衍生物与流感病毒的疫苗抗原的化合物。所述化合物可以通过叠氮化物法使流感病毒的疫苗抗原与杂链聚胺衍生物进行反应而制备，得到以上通式的缀合物，其中R表示流感病毒的疫苗抗原；n是基本单元的数目；q是烷化单元的数目；z是氧化单元的数目。该疫苗还可以制备成流感病毒的疫苗抗原与杂链聚胺衍生物的配位化合物的形式，通过进行配位反应形成强静电偶联而制备。
文档编号A61P31/16GK1464789SQ01814944
公开日2003年12月31日 申请日期2001年6月13日 优先权日2000年8月9日
发明者列姆·维克多罗维奇·彼得罗夫, 拉希姆·穆萨维奇·哈伊托夫, 阿尔卡蒂·瓦西里耶维奇·涅克拉索夫, 纳塔利亚·格里戈耶维纳·普赫考瓦, 阿尔贝塔·谢尔盖夫纳·伊瓦诺瓦 申请人:列姆·维克多罗维奇·彼得罗夫, 拉希姆·穆萨维奇·哈伊托夫, 阿尔卡蒂·瓦西里耶维奇·涅克拉索夫, 纳塔利亚·格里戈耶维纳·普赫考瓦, 阿尔贝塔·谢尔盖夫纳·伊瓦诺瓦
技术领域：
本发明涉及医学领域并可以用于免疫学，特别是流感和急性呼吸系统疾病的预防。
背景技术：
流行性感冒被认为是影响所有人群的最为广泛传播的以病毒为病因的感染性疾病。这种疾病传播的快速性和流感基因组的高度变异性是造成严重大流行的原因。因此抗流感病毒疫苗对于这种疾病的预防是极为重要的。
在现有技术中已知包括整个病毒颗粒制剂的活流感病毒疫苗(Peradze T.V.等，“抗流感预防性制剂”，莫斯科，Meditsina出版社，1986，79-81页，(俄语))。活疫苗的无害性、快速制备实际病毒株疫苗的可能性、它们的低成本及给药的简便性使应用这种疫苗预防流感成为可能。
然而，活疫苗中减毒的病毒可以突变，重新获得毒力和某些其他不可预知的特性。活疫苗的非标准反应原性及其不足的抗原活性使其需要至少两次经鼻给药，限制了活疫苗在大规模免疫接种时的应用。
这些弊端可以通过使用灭活疫苗来克服(Barry D.W.，MaynerR.E.，Staton E.等，流感疫苗的比较试验。全病毒疫苗和裂解产物疫苗在人体中的免疫原性。-美国流行病学杂志，1976，104卷，第一期，34-46页)。
然而，活疫苗和灭活疫苗含有大量可引起副作用和并发症的稳定物质(ballast substances)，这使它们对于大规模预防并不安全。
已知裂解疫苗和亚单位疫苗含有从病毒颗粒分离的主要抗原成分血凝素(H)和神经氨酸酶(N)。裂解流感疫苗诱导产生足够高水平的免疫，并且无主要的稳定物质。例如，一种商品名为“Vaxigrip”由Pasteur Merieux(法国)生产的疫苗被广泛应用。“Vaxigrip”疫苗具有高免疫原性和低反应原性的特点，并被推荐用于从6个月大的婴儿以上的儿童以及高危人群的免疫接种。
亚单位疫苗具有最低的反应原性，但有效性稍差，因此为获得必需的免疫应答它们需要以2-3星期间隔至少两次施用足够大的剂量，这在实质上妨碍了大规模抗流感免疫接种计划的实施。为了增强抗原活性，制备亚单位疫苗时添加了吸附剂或完整的病毒颗粒，这也对制剂的安全性和反应原性产生了不利影响。
在所有已知的疫苗中，与这里所述发明最为接近的是由流感病毒的疫苗抗原和一种聚合载体反应制备的抗流感疫苗(RU 1580617，IPCA61K 39/145，1996年公开)。通过化学性结合制备的抗原-聚合疫苗引起免疫细胞活化和对免疫应答基因调控的表型修正。这种疫苗特征在于反应原性弱并且对儿童和高危人群进行免疫接种是无害的。
然而，结合到低分子量聚合载体的该已知疫苗中的疫苗蛋白在制剂的使用和贮存中不够稳定，因此即便在其特定贮存条件得到满足的情况下，该已知疫苗也不总能达到严格的使用期要求。该已知疫苗的免疫原性也相对较低，需要给予足够大剂量的制剂以获得必需的免疫应答。
此外，在该已知疫苗中采用的聚合载体不能与疫苗抗原形成静电络合物，后者在生理条件下稳定，因此使用简单、安全又经济的配位技术生产抗流感病毒疫苗的可能性被排除。
已知的通过将流感病毒的疫苗抗原与一种聚合载体反应生产抗流感病毒疫苗的方法使获得新一代的疫苗成为可能一种缀合的聚合物亚单位疫苗，不考虑免疫应答的基因控制，缀合物的抗原性部分可产生有效的免疫应答。
然而，实施已知方法要使用有毒性的琥珀酰亚胺酯，使该方法的实施对生态环境不利，并需要采取特殊措施进行精细纯化，使疫苗生产技术复杂化，对生产条件和安全技术提出了更高的要求。生产抗流感病毒疫苗的该已知方法在技术有效性不足的同时，对物质和劳力资源的消耗也相当可观，而目标产品的产率不超过20-30％。生产抗流感病毒疫苗的该已知方法在疫苗生产的所有步骤中缺乏有效客观的控制，这对制剂参数的可重复性不利。
发明内容
本发明旨在提供一种对所有年龄组人群都安全的抗流感病毒疫苗，增加疫苗的预防有效性并很大程度减少制剂的接种剂量。
本发明的另一目的是提高疫苗生产过程的技术有效性，通过使用将聚合载体与疫苗抗原形成化合物的新方法拓宽技术潜力，降低对安全工艺和生态生产条件的要求，改善目标产品的质量。
所述目标的实现是通过一种抗流感病毒疫苗，它包含聚合载体与流感病毒的疫苗抗原的化合物，其中使用以下通式的杂链聚胺衍生物作为聚合载体 其中n是基本单元的数目；q是烷化单元的数目；z是氧化单元的数目；A是CH或N。
根据本发明，使用分子量为50000到150000Da的杂链聚胺衍生物有利。
根据本发明，选择抗原/载体之比等于1∶5-30有利。
根据本发明，选择n＝350-1000，q＝(0.2-0.4)n，z＝(0.4-0.8)n，x＝2或4，y＝1或2有利。
设定目标是通过流感病毒的疫苗抗原与杂链聚胺衍生物共价偶联为所述化合物实现的，形成以下通式的缀合物 其中R表示流感病毒的疫苗抗原。
设定目标还通过包含流感病毒的疫苗抗原与杂链聚胺衍生物通过静电键结合形成的络合物的所述化合物而实现。
作为杂链聚胺衍生物，优选使用以下通式的1，4-乙烯哌嗪N-氧化物和(N-羧乙基)-1，4-乙烯哌嗪鎓溴化物的共聚物 根据本发明，使用以下通式的1，4-乙烯哌啶N-氧化物和(N-羧乙基)-1，4-乙烯哌啶鎓溴化物的共聚物作为杂链聚胺衍生物也是有利的 作为流感病毒的疫苗抗原，优选使用流感病毒的表面蛋白。
根据本发明，使用血凝素和/或神经氨酸酶作为流感病毒的表面蛋白有利。
根据本发明，使用流感病毒的内部蛋白-基质蛋白(M-蛋白)和核蛋白(NP-蛋白)作为流感病毒的疫苗抗原有利。
根据本发明，联合使用流感病毒的表面蛋白和内部蛋白作为疫苗抗原有利。设定目标还通过制备抗流感病毒疫苗的方法实现，所述方法包括使流感病毒的疫苗抗原与聚合载体反应，其中杂链聚胺衍生物被用作聚合载体，它们与流感病毒的疫苗抗原的反应通过叠氮化物法实现。
根据本发明，使用分子量为50000到150000Da的杂链聚胺衍生物有利。
根据本发明，使杂链聚胺衍生物与流感病毒的疫苗抗原在抗原/载体之比为1∶5-30的条件下反应有利。
根据本发明，预活化杂链聚胺衍生物有利。
杂链聚胺衍生物的活化应当优选通过引入酰肼基团而实现。
设定目标还通过制备抗流感病毒疫苗的方法实现，所述方法包括使流感病毒的疫苗抗原与聚合载体反应，其中杂链聚胺衍生物被用作聚合载体，它们与流感病毒的疫苗抗原的反应在配位反应的辅助下完成。
根据本发明，杂链聚胺衍生物与流感病毒的疫苗抗原的配位反应在抗原/载体之比为1∶5-30的条件下进行有利。
设定目标通过杂链聚胺衍生物和流感病毒的疫苗抗原的带相反电荷的大分子之间发生配位反应而实现。
根据本发明，使用1，4-乙烯哌嗪N-氧化物和(N-羧乙基)-1，4-乙烯哌嗪鎓溴化物的共聚物作为杂链聚胺衍生物，并使用流感病毒的表面蛋白血凝素和神经氨酸酶作为疫苗抗原，在pH5.8的磷酸缓冲液、温度2-4℃的条件下进行配位反应是有利的。
由于使用本身具有促免疫活性的杂链聚胺衍生物作为聚合载体，本发明使流感病毒抗原具有高免疫原性及稳定性，从而可形成免疫记忆，大大减少(与流感疫苗的世界标准相比减少大约3倍)抗原的接种剂量，增强机体对其他感染的抵抗力。
本发明还简化并加速了抗流感病毒疫苗的生产过程，减少了能耗强度并改善了生产的生态安全性，从而使目标产品的质量得以提高，产率增加。
要求保护的发明还使获得的抗流感病毒疫苗具有稳定可重复的理化参数及生理特征，表现出对外界因素的高度稳定性。
本发明的其他目的和优势将从以下对抗流感病毒疫苗及其生产方法以及所述方法和所生产疫苗的具体实施方案的详述中可见。
具体实施例方式
根据本发明的抗流感病毒疫苗是流感病毒的疫苗抗原与杂链聚胺的水溶性衍生物通过强共价键形成的缀合物，或者是这些成分之间通过稳定静电偶联形成的络合物制剂。
所述抗流感病毒疫苗是一种高分子化合物，其分子量在1-3mlnDa数量级，分子直径为50-80nm，等电点为7.25。
传统上在流感疫苗中使用流感病毒的表面抗原分子量为77000Da的血凝素(HA)和分子量为220000Da的神经氨酸酶(NA)，它们是病毒颗粒的表面蛋白(超衣壳亚单位)，等电点分别为6.9和7.1。
这些抗原促使抗体免疫应答的形成并提供针对同源病毒感染的保护，因为HA抗体具有病毒中和活性。
用于生产所述疫苗的流感病毒内部抗原(核衣壳亚单位)-分子量为170000Da、等电点6.5的核蛋白(NP蛋白)和分子量为64000Da、等电点6.8的基质蛋白(M蛋白)-在感染过程中也起着重要作用。已知在感染了流感或接种了完整病毒颗粒疫苗的人体内，抗体的产生同时针对表面的HA和NA抗原以及内部的M蛋白和NP蛋白。
为了从相应病毒株中分离疫苗抗原，采用了使用非离子去污剂的技术。使流感病毒在10天大的鸡胚尿囊腔中生长，并通过蔗糖密度分级梯度技术纯化浓缩。
杂链聚胺衍生物是水溶性、无毒、完全生物源性的化合物，具有显著的免疫调节特性。
杂链聚胺衍生物是通过“活”阳离子聚合方法合成聚乙烯哌啶类，随后将合成的杂链聚胺氧化和烷化而获得的。这样获得的物质具有恰当的生理和药理学活性。
所述高分子水溶性免疫调节载体对疫苗抗原的修饰可增强亚单位的免疫原性。由于所述杂链聚胺衍生物与流感病毒的疫苗抗原之间形成稳定的共价或静电偶联(取决于制备化合物的方法)，所述抗原具有了高度稳定性并且它们的免疫原性得到增强，因此可以减少抗原的接种剂量。对流感病毒抗原形成免疫记忆变得更为有效。同时，机体对抗其他感染的保护性加强，其结果是疫苗的整体预防活性增强。此外，无毒水溶性载体的使用令疫苗的安全性增加，使其适于自6个月婴儿以上的儿童接种。
基于杂链聚胺衍生物与流感病毒的保护性抗原形成的缀合物的抗流感病毒疫苗的制备方法按如下方式进行。
-在对生产本发明的抗流感病毒疫苗的方法的描述中，为了明确起见，1，4-乙烯哌嗪N-氧化物和(N-羧乙基)-1，4-乙烯哌嗪鎓溴化物的共聚物(CPL)，商品名“polyoxidonium”，被选作杂链聚胺的起始衍生物。
首先，制备活化形式的杂链聚胺衍生物CPL。为此，将起始CPL用水合肼修饰。
将活化后获得的CPL酰肼与流感病毒保护性抗原按5-30∶1的比例混合并按叠氮化物法反应，结果流感病毒的疫苗抗原与高分子合成载体发生共价偶联，并在聚合载体的羧基与蛋白分子赖氨酸残基的伯氨基之间形成稳定的共价酰胺偶联。
所述的合成在严格控制的条件下进行，以获得具有规定结构和蛋白/聚合物比的制剂。叠氮化物法的使用和对反应条件的严格遵循可完全避免分子间和分子内交联、保存活性中心并获得目标产品的高产率和高质量。
基于杂链聚胺水溶性衍生物中的高分子聚合载体与流感病毒的保护性抗原形成的配位化合物，该抗流感病毒疫苗的制备方法按如下方式进行。
将CPL溶于pH5.8的磷酸缓冲液。将溶于相同缓冲液中的流感病毒的疫苗抗原溶液加入到所述CPL溶液中。
取决于对参与反应的特定杂链聚胺衍生物和保护性抗原的选择，络合物强度各异。为了形成强静电偶联，应当选择溶液中成分的最佳比例。通过向聚合物溶液中按抗原/载体比1∶5-30缓慢加入蛋白溶液来进行配位反应。在所指示的pH值下，聚合载体CPL和流感病毒表面抗原的大分子带有相反电荷，并且作为所述反应的结果，它们形成稳定的静电偶联。
制剂通过层析分离。
使用聚丙烯酰胺凝胶(PAAG)SDS电泳、电子显微镜、荧光光谱、圆二色性法等方法对所获得化合物的组成及其特性进行了分析，这些方法能定量评价蛋白与载体的偶联程度，确定偶联位置，并支持缀合物组成中蛋白的构象稳定性。
通过在实验动物中研究免疫系统和机体作为整体的反应，并通过在志愿者身上测试疫苗来评价所得化合物的免疫原性和保护性。
所进行的研究表明，按这里所述发明制备的缀合或络合物制剂形式的抗流感病毒疫苗具有如下优点-免疫原性比亚单位疫苗高10倍，-最佳活性pH为7.25，接近生理液体的pH值，提供高生物利用率，-制剂使用完全安全，因为只采用流感病毒的高度纯化的疫苗抗原，并且以蛋白计接种量比传统疫苗低3到5倍，-在整个流行季节单次免疫接种疫苗即有效，-在缀合或络合物制剂组成中疫苗抗原的稳定性超出天然蛋白的稳定性100倍以上，-基于杂链聚胺高分子水溶性衍生物的聚合载体具有显著的适宜的免疫调节活性，因此疫苗的免疫原性和预防活性显著增强。
对志愿者进行的研究是在流感和急性呼吸系统疾病(ARD)发病率季节性上升期间进行单次免疫接种。从对成人流感和ARD发病率的分析明显看出，外对照组中流感发病率为每千观察中92.3，大大高于接种了这里所述发明疫苗的个体的组(每千名接种个体中26.7)和内对照组(每千观察中36)。进行了流感病因诊断的血清学解释。
通过使用恰当的公式，可以由流行病学实验数据所得到的特征确定制剂作为疫苗的最重要特性，即-效力指数为3.4，-预防效力因子为77％，-在总体50％免疫中间层的存在下，抗流行保护因子为68％。
在以下讨论的本发明具体实施方案中，实施例1-12描述了制备抗流感病毒疫苗的方法的不同实施方案，实施例13-15呈现了对实施例1-12中获得制剂的效力的实验评估。对制剂效力的评估结果反映在表1-4中。
实施例1.在叠氮化物法缀合的帮助下，制备基于与流感病毒表面蛋白HA和NA形成的CPL缀合物的疫苗。
第一步合成活化形式的载体-CPL酰肼。
将500mg的CPL(n＝700，q＝0.2，z＝0.8，MW＝80000，MWD＝1.33)溶于25ml的甲醇。在20℃下加入0.2ml(2×10-3M)的水合肼。反应进行24小时。此后将甲醇通过旋转式蒸发器蒸馏掉，将残余物溶于水，进行醚萃取。使用“Millipore”膜通过超滤技术分离成品，随后冻干。
酰肼基团的含量通过使用2，4，6-三硝基苯磺酸滴定伯氨基的标准方法测定。酰肼基团的含量为15％。
第二步通过CPL酰肼与HA和NA的缩合反应制备缀合物。
将100mg的CPL酰肼溶于4ml 1N的HCl。将溶液冷却至0-2℃。然后在搅拌和冷却下加入1.15ml 3％的亚硝酸钠溶液。15分钟后加入2N NaOH调节溶液pH至8.5。
将HA和NA蛋白的20mg混合物(按95∶5的比例)溶于10ml0.05M pH8.5的缓冲溶液，并加入到CPL酰肼溶液中。通过加入2NNaOH保持反应pH值等于8.5。在搅拌并冷却至0-2℃条件下反应进行12小时。为了分离和纯化缀合物，将反应混合物装到SephadexG-100柱(2.6×90)上，洗脱剂为0.05M的磷酸缓冲液，pH7.5，含0.05M NaCl。通过流式分光光度计在λ＝226nm控制缀合物产率。通过荧光光谱和聚丙烯酰胺凝胶(PAAG)电泳测定抗原含量并分析缀合物。蛋白/CPL缀合物的摩尔比为1∶5。缀合物产率为97％。
通过NMR-光谱和IR-光谱技术测定共聚物组成，分子量和分子量分布通过小角度激光散射法测定。
实施例2.制备基于与流感病毒表面蛋白HA和NA形成的CPL络合物的疫苗。
将100mg的CPL(n＝1000，q＝0.4，z＝0.4，MW＝145000，MWD＝1.7)溶于10ml 0.05M pH＝5.8的磷酸缓冲液。在2-4℃下加入含10mg HA和NA混合物(比例95∶5)的2ml同样缓冲液。在所述pH值下聚合载体和抗原的大分子带相反电荷。
通过向聚合物溶液中缓慢加入抗原溶液进行配位反应，不使沉淀生成。反应混合物在2-4℃温度下保持24小时。反应一完成，加入氢氧化钠溶液将溶液pH值调到7.1。蛋白/CPL摩尔比为1∶10。目标产品的产率为96％。测定蛋白含量并通过荧光光谱和PAAG电泳分析化合物。
实施例3.过程同实施例1，用作为抗原载体的CPL具有以下特征n＝400，q＝0.3，z＝0.7，MW＝60000，MWD＝1.1，并用流感病毒的内部蛋白M-蛋白和NP-蛋白作为流感病毒的疫苗抗原。蛋白/CPL的摩尔比为1∶6。缀合物中的蛋白通过Lowry法分析。
实施例4.过程同实施例1，用作为载体的CPL具有以下特征n＝900，q＝0.35，z＝0.65，MW＝100000，MWD＝1.6，并用流感病毒的表面HA和NA蛋白与内部M-蛋白和NP-蛋白的混合物作为疫苗抗原。蛋白/CPL的摩尔比为1∶5。蛋白含量通过Bradford法测定。
实施例5.过程同实施例2，用作为载体的CPL具有以下特征n＝540，q＝0.25，z＝0.75，MW＝78000，MWD＝1.8，并用流感病毒的内部M-蛋白和NP-蛋白作为疫苗抗原。蛋白/CPL的摩尔比为1∶30。蛋白含量通过Bradford法测定。
实施例6.过程同实施例2，用作为载体的CPL具有以下特征n＝900，q＝0.3，z＝0.7，MW＝135000，MWD＝1.7，并用流感病毒的表面HA和NA蛋白与内部M-蛋白和NP-蛋白的混合物作为疫苗抗原。蛋白/CPL的摩尔比为1∶25。
实施例7.过程同实施例1，使用具有以下特征的1，2-乙烯哌啶N-氧化物和(N-羧乙基)-1，2-乙烯哌啶鎓溴化物的共聚物(CPL-A)作为流感病毒的疫苗抗原的载体n＝100，q＝0.4，z＝0.4，MW＝145000，MWD＝1.7，并用HA和NA作为抗原。抗原-载体比为1∶10。蛋白通过Lowry法分析。
实施例8.过程同实施例1，用作为载体的CPL-A具有以下特征n＝400，q＝0.3，z＝0.7，MW＝60000，MWD＝1.1，并用流感病毒的内部蛋白基质M-蛋白和NP-蛋白作为疫苗抗原。抗原-载体摩尔比为1∶8。蛋白通过Lowry法分析。
实施例9.过程同实施例1，用作为载体的CPL-A具有以下特征n＝900，q＝0.35，z＝0.65，MW＝110000，MWD＝1.6，并用流感病毒的表面HA和NA蛋白与内部M-蛋白和NP-蛋白的混合物作为疫苗抗原。抗原-载体摩尔比为1∶5。蛋白含量通过Bradford法测定。
实施例10.过程同实施例2，用作为载体的CPL-A具有以下特征n＝540，q＝0.25，z＝0.75，MW＝78000，MWD＝1.8，并用流感病毒的表面蛋白HA-蛋白和NA-蛋白作为疫苗抗原。抗原/载体摩尔比为1∶30。蛋白通过Lowry法分析。
实施例11.过程同实施例2，用作为载体的CPL-A具有以下特征n＝950，q＝0.3，z＝0.7，MW＝120000，MWD＝1.7，并用流感病毒的内部M-蛋白和NP-蛋白作为疫苗抗原。抗原/载体摩尔比为1∶25。制剂中的蛋白含量通过Lowry法测定。
实施例12.过程同实施例2，用作为载体的CPL-A具有以下特征n＝600，q＝0.4，z＝0.4，MW＝90000，MWD＝1.7，并用流感病毒的表面HA和NA蛋白与内部M和NP蛋白的混合物作为疫苗抗原。抗原/载体摩尔比为1∶20。蛋白含量通过Lowry法测定。
实施例13.研究疫苗抗流感病毒的效力。
为了建立特异性并测定特异性抗体滴度的增高，进行了小鼠血清和志愿者血清的血凝抑制反应(HAIR)试验来评价抗原活性。
在去除非特异性抑制物后，将两倍稀释的血清0.2ml置于Plexiglas板的各孔中。向每份稀释血清中加入4AU量的0.2ml同源抗原。摇动混合物并在20±2℃的温度下静置30分钟。此后向每孔中加入0.4ml1％的鸡红细胞悬液。再次摇动混合物并在20±2℃的温度下静置40-45分钟(直至对照中红细胞沉淀)。此后依照4-交叉系统计算反应结果。抗原滴度或一个凝集单位(1AU)被设定为造成显著的红细胞凝集的最大抗原稀释度。如果血清中存在特异性抗体，红细胞的凝集延迟发生。血清中的抗体滴度被定为完全抑制血凝的抗原的极限稀释度。
实验中使用的是体重18-20克的(CBA×C57B1/6)F1系性成熟小鼠。将从相应的H3N2、H1N1、B型流感病毒株分离获得的HA、NA、M-蛋白和NP-蛋白用作抗原，以及在其与聚合载体CPL和CPL-A形成的化合物的基础上生产的制剂。
抗原剂量根据小鼠预实验选择。每组包括8-10只小鼠。所有制剂都以0.5ml的量腹腔内给药。对照组的小鼠给予0.5ml的生理溶液。采用两周后再次接种的两次接种方案。第二次免疫接种后的12天，通过血凝抑制反应(HAIR)测定所研究制剂的免疫原性。
所获结果如表1所示，其中位置13显示对照组的抗原活性。
表1
表1显示的数据说明，在所有给予本发明制剂的实验组中，通过血凝抑制反应测得的抗体滴度都超出了对照组，即，观察到对施用制剂显著的抗原应答。
实施例14.评估抗流感病毒疫苗的免疫原性。
将制剂以不同的剂量并按不同的方案给予近交(CBA×C57B1)F1系小鼠。此后进行了对抗原特异性免疫反应的多参数研究，包括测定被免疫动物血清中HA-特异性抗体的含量。
将制剂于缓冲溶液中稀释并以蛋白计0.1到10mg/只小鼠的剂量经腹腔内或尾根部皮下给药。为诱导继发性免疫反应，在第一次给药后21天进行第二次注射。在免疫接种后限定的时间内将小鼠断头，取血并获得血清。
采用免疫-酶分析法(IEA)测定血清中HA-特异性抗体的含量。按常规步骤在96孔聚苯乙烯板内进行分析。
在第一次和第二次免疫接种后测定实验组和对照组的抗体IEA-滴度，并计算特异性免疫记忆因子Kim和特异性免疫刺激因子Kss。对照组小鼠未形成免疫记忆。
这些因子不依赖于滴度的绝对值，并且是疫苗制剂免疫原性的客观特征。分析结果如表2所示。
表2
表2显示的结果说明，根据本发明生产的所有制剂都具有免疫原性并形成免疫记忆。
实施例15.依照认可的测试记录单在志愿者中评估本发明疫苗的免疫原性。接受免疫接种的志愿者选自血清阴性个体(HAIR滴度小于10)，年龄30到40岁。每组包括10-12个人。肌内接种至左臂三角肌区域，使用一次性注射器注射单剂0.5ml。每剂含有(5±1)μg A型流感病毒(H1N1)的血凝素和相应于实施例1、2、4、6所述剂量的载体CPL-1。对照组个体给予0.5ml的生理溶液。
为评估所研究制剂的免疫原性，使用疫苗流感病毒株对被接种个体在接种前和接种一个月后取样的成对血清进行血凝抑制反应(HAIR)研究。通过产生保护性抗体滴度的个体所占的百分比评估制剂的有效性。如果HAIR中抗体滴度超过1∶40，则该个体被认为受到免疫保护。
对疫苗免疫原性的研究结果见表3。
表3
表3中的实验数据说明接种本发明制剂的个体中形成了高水平的免疫应答及高的保护性抗体滴度。
实施例16.在病毒中和实验中评估抗流感病毒疫苗的有效性。
按测定用所述制剂免疫的小鼠血清的病毒中和活性的步骤测定“保护性”抗体的滴度。
实验进行同实施例14。两次给予小鼠(间隔21天)最适免疫原剂量的疫苗后，取其血清并通过活流感病毒灭活实验研究疫苗活性。为了这一目的，将不同稀释度的血清与流感病毒的悬液混合，并按照普遍采用的方法评估病毒中和抗体的滴度。小鼠血清的病毒中和滴度被认为是消除50％胚胎中尿囊液血凝活性的最大稀释度。评估结果见表4。
表4
已知流感病毒中和实验中1∶400的滴度及血清转变因子等于40是抗流感病毒疫苗有效性的可靠特征，并被认为是“保护性”滴度。表4所示数据表明用本发明制剂免疫的小鼠血清与正常小鼠血清相比，含有至少40倍量的病毒中和抗体。
工业实用性本发明将可应用于生产新一代的抗流感疫苗，由于含聚合免疫调节载体，该疫苗特征为具有显著的免疫原性、高度安全性和预防有效性。这拓宽了它们在不同人群中用于预防流感的可能性，包括在儿童和高危人群中使用。
权利要求
1.一种抗流感病毒疫苗，其包含聚合载体与流感病毒的疫苗抗原的化合物，其特征在于使用以下通式的杂链聚胺衍生物作为聚合载体 其中n是基本单元的数目；q是烷化单元的数目；z是氧化单元的数目；A是CH或N。
2.根据权利要求1的疫苗，其特征为所述杂链聚胺衍生物的分子量为50000-150000Da。
3.根据权利要求1或2的疫苗，其特征为n＝350-1000，q＝(0.2-0.4)n，z＝(0.4-0.8)n，x＝2或4，y＝1或2。
4.根据权利要求1或2的疫苗，其特征为所述化合物的抗原/载体比等于1∶5-30。
5.根据权利要求1的疫苗，其特征为所述化合物包含流感病毒的疫苗抗原与杂链聚胺衍生物共价偶联的缀合物，其通式为 其中R表示流感病毒的疫苗抗原。
6.根据权利要求1的疫苗，其特征为所述化合物包含流感病毒的疫苗抗原与杂链聚胺衍生物通过形成静电偶联得到的络合物。
7.根据权利要求1的疫苗，其特征为使用以下通式的1，4-乙烯哌嗪N-氧化物和(N-羧乙基)-1，4-乙烯哌嗪鎓溴化物的共聚物作为杂链聚胺衍生物
8.根据权利要求1的疫苗，其特征为使用以下通式的1，4-乙烯哌啶N-氧化物和(N-羧乙基)-1，4-乙烯哌啶鎓溴化物的共聚物作为杂链聚胺衍生物
9.根据权利要求1的疫苗，其特征为使用流感病毒的表面蛋白作为流感病毒的疫苗抗原。
8.根据权利要求1的疫苗，其特征为使用血凝素和/或神经氨酸酶作为流感病毒的疫苗抗原。
9.根据权利要求1的疫苗，其特征为使用流感病毒的内部蛋白-基质蛋白和核蛋白作为流感病毒的疫苗抗原。
10.根据权利要求1的疫苗，其特征为使用流感病毒的表面和内部蛋白作为流感病毒的疫苗抗原。
11.一种制备抗流感病毒疫苗的方法，其包括使流感病毒的疫苗抗原与聚合载体反应，特征为使用杂链聚胺衍生物作为聚合载体，并且它们与流感病毒的疫苗抗原的反应通过叠氮化物法实现。
12.根据权利要求11的方法，其特征为所用杂链聚胺衍生物的分子量为50000-150000Da。
13.根据权利要求11的方法，其特征为杂链聚胺衍生物与流感病毒的疫苗抗原的反应在抗原/载体比为1∶5-30的条件下进行。
14.根据权利要求11的方法，其特征为杂链聚胺衍生物经过预活化。
15.根据权利要求14的方法，其特征为杂链聚胺衍生物的活化通过引入酰肼基团实现。
16.一种制备抗流感病毒疫苗的方法，其包括使流感病毒的疫苗抗原与聚合载体反应，特征为使用杂链聚胺衍生物作为聚合载体，且其与流感病毒的疫苗抗原的反应通过配位反应的方式进行。
17.根据权利要求16的方法，其特征为杂链聚胺衍生物与流感病毒的疫苗抗原的配位反应在抗原/载体比为1∶5-30的条件下进行。
18.根据权利要求16或17的方法，其特征为所述配位反应在带相反电荷的杂链聚胺衍生物和流感病毒的疫苗抗原的大分子之间进行。
19.根据权利要求16的方法，其特征为使用1，4-乙烯哌嗪N-氧化物和(N-羧乙基)-1，4-乙烯哌嗪鎓溴化物的共聚物作为杂链聚胺衍生物，并且使用流感病毒的表面蛋白血凝素和神经氨酸酶作为疫苗抗原，所述配位反应在pH5.8的磷酸缓冲液、2-4℃的温度条件下进行。
全文摘要
一种抗流感病毒的疫苗包括杂链聚胺衍生物与流感病毒的疫苗抗原的化合物。所述化合物可以通过叠氮化物法使流感病毒的疫苗抗原与杂链聚胺衍生物进行反应而制备，得到以上通式的缀合物，其中R表示流感病毒的疫苗抗原；n是基本单元的数目；q是烷化单元的数目；z是氧化单元的数目。该疫苗还可以制备成流感病毒的疫苗抗原与杂链聚胺衍生物的配位化合物的形式，通过进行配位反应形成强静电偶联而制备。
文档编号A61P31/16GK1464789SQ01814944
公开日2003年12月31日 申请日期2001年6月13日 优先权日2000年8月9日
发明者列姆·维克多罗维奇·彼得罗夫, 拉希姆·穆萨维奇·哈伊托夫, 阿尔卡蒂·瓦西里耶维奇·涅克拉索夫, 纳塔利亚·格里戈耶维纳·普赫考瓦, 阿尔贝塔·谢尔盖夫纳·伊瓦诺瓦 申请人:列姆·维克多罗维奇·彼得罗夫, 拉希姆·穆萨维奇·哈伊托夫, 阿尔卡蒂·瓦西里耶维奇·涅克拉索夫, 纳塔利亚·格里戈耶维纳·普赫考瓦, 阿尔贝塔·谢尔盖夫纳·伊瓦诺瓦
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