长期稳定溶液制剂的制作方法
专利名称：长期稳定溶液制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及G-CSF(粒细胞集落刺激因子)溶液制剂，尤其是涉及长期保存后的活性成分也没有损失，并且G-CSF的蛋氨酸残基氧化体生成率低的稳定的G-CSF制剂。
本发明人通过培养由口腔癌患者的肿瘤细胞中采取的细胞株，精制得到高纯度的人G-CSF后，以此为契机，成功的进行了人G-CSF遗传基因的克隆，现在通过遗传基因工程的方法已经可以用微生物细胞或动物细胞大量重组生产人G-CSF。另外，本发明人成功地对该精制G-CSF进行制剂，将此作为预防感染药投放市场(专利第2116515号)。
G-CSF的使用量极微量，通常成年人每人给药为将含0.1～1000μg(优选5～500μg)G-CSF的制剂以1～7次/周的比例给药。尽管如此，该G-CSF对诸如注射用安瓶、注射器等器壁有吸咐性。另外，G-CSF不稳定，易受外界因素的影响，因为温度、湿度、氧、紫外线等产生缔合、聚合或者氧化等物理或化学变化，结果导致活性大幅降低。
过去，为了防止这些影响，剂型主要选择冷冻干燥制剂，进行各种处方设计。例如提出了一种制剂，其含有至少由(a)从苏氨酸、色氨酸、赖氨酸、羟赖氨酸、组氨酸、精氨酸、半光氨酸、光氨酸和蛋氨酸的组成中选出的至少1种氨基酸，(b)至少1种含硫还原剂或者(c)至少1种防氧化剂的组成中选出的至少1种(专利第2577744号)等。另外，还有含稳定剂是聚山梨酸酯等表面活性剂的G-CSF制剂(特开昭63-146826号)。
另外，还有含麦芽糖、棉子糖、蔗糖、海藻糖或氨基糖的G-CSF冷冻干燥制剂的报道(特表平8-504784号)。
但是，在冷冻干燥工序中存在的问题是引起工业生产成本增加，由于机械问题导致危险性增大。而且，使用冷冻干燥制剂时必须用纯水(注射用灭菌水)溶解，很麻烦。
另一方面，过去市场上的制品中，为了抑制化学或物理变化，一般添加作为稳定剂使用的人血清白蛋白或者精制明胶等蛋白质。尽管如此，添加蛋白质作为稳定剂存在的问题是为了去除病毒的感染等需要非常复杂的工序等。
然而，没有添加这类蛋白质时存在问题是G-CSF的蛋氨酸残基氧化物变多，导致质量下降。
基于上述原因，要求不含作为稳定剂的蛋白质，并且即使长期保存也稳定，能够代替冷冻干燥制剂的G-CSF溶液制剂。
即，本发明提供一种G-CSF溶液制剂，作为稳定剂实质上不含蛋白质，另外作为稳定剂，含有至少1种氨基酸或其盐。
本发明进而还提供一种上述的G-CSF溶液制剂，其中，氨基酸为从甘氨酸、谷氨酸钠、精氨酸及组氨酸或者它们盐的组成中选出的1种以上。
本发明进而还提供一种上述的G-CSF溶液制剂，其中，氨基酸为从精氨酸及组氨酸或者它们的盐的组成选出的1种以上。
本发明进而还提供一种上述的G-CSF溶液制剂，其中，氨基酸为组氨酸或者其盐。
本发明进而还提供一种上述的G-CSF溶液制剂，其中，还含有蛋氨酸。
本发明进而还提供一种上述的G-CSF溶液制剂，其中，氨基酸的添加量为0.01重量％～10重量％。
本发明进而还提供一种上述的G-CSF溶液制剂，其中，组氨酸或者其盐的添加量为0.01重量％～10重量％。
本发明进而还提供一种上述的G-CSF溶液制剂，其中，还含有甘露糖醇和/或氯化钠。
本发明进而还提供一种上述的G-CSF溶液制剂，其中，还含有表面活性剂。
本发明进而还提供一种上述的G-CSF溶液制剂，其中，表面活性剂为聚氧乙烯山梨糖醇酐烷基酯。
本发明进而还提供一种上述的G-CSF溶液制剂，其中，表面活性剂为聚山梨酸酯20和/或80。
本发明进而还提供一种上述的G-CSF溶液制剂，其中，pH为5～7。
本发明进而还提供一种上述的G-CSF溶液制剂，其中，pH为5.5～6.8。
本发明进而还提供一种上述的G-CSF溶液制剂，其中，G-CSF为由CHO细胞产生的G-CSF。
本发明进而还提供一种上述的G-CSF制剂，其中，为瓶制剂或者预充注射(プレフイルドシリンジ)制剂。
本发明进而还提供一种稳定的G-CSF溶液制剂，其中，在40℃、2周的加速试验后，G-CSF残存率在90％以上，或者25℃、6个月的稳定性试验后，G-CSF的残存率在97％以上，或者10℃、1年的稳定性试验后，G-CSF的残存率在97％以上，并且40℃、2周的加速试验后，G-CSF蛋氨酸残基氧化物的生成率在1％以下。
本发明进而提供一种稳定的G-CSF溶液制剂，实质上不含G-CSF蛋氨酸残基氧化物。此处所说的“实质上不含G-CSF蛋氨酸残基氧化物”是指上述G-CSF的蛋氨酸残基氧化物在检测限以下。
本发明进而提供一种G-CSF溶液制剂的稳定化方法，其中，作为稳定剂实质上不含蛋白质，另外作为稳定剂，添加至少1种氨基酸或其盐。
本发明进而提供通过至少一种氨基酸及其盐来制备稳定的G-CSF溶液制剂的使用。
作为本发明的溶液制剂为不含制备工序中的冷冻干燥工序，在溶液状态能够长期保存的制剂。
本发明的G-CSF溶液制剂，优选实质上不含有作为稳定剂的人血清白蛋白或精制明胶等蛋白质。
本发明的G-CSF溶液制剂，作为稳定剂，含有至少1种氨基酸或其盐。作为上述氨基酸，优选为从甘氨酸、谷氨酸纳、精氨酸及组氨酸或者它们盐的组成中选出的1种以上，更优选为从精氨酸及组氨酸或者它们的盐的组成中选出的1种以上，最优选含有组氨酸或其盐。
本发明所用的氨基酸，包括游离氨基酸及其钠盐、钾盐、盐酸盐等盐。本发明的制剂中，含有这些氨基酸的D-、L-及DL-体，更优选的为L-体及其盐。
本发明的制剂中添加的氨基酸的添加量由所用氨基酸的种类而定，用后述的试验方法可以确定优选的范围。一般为0.001～10重量％，优选为0.01～5重量％，更优选为0.1～3重量％。组氨酸或其盐通常为0.01～10重量％，优选为0.05～3重量％，最优选为0.1～2重量％。组氨酸盐酸盐的情况下，在40℃、2周加速试验中，在试验的0.1～1.6重量％范围，具有极高的G-CSF残存率，在0.4重量％的残存率最高。
本发明的G-CSF溶液制剂优选含有蛋氨酸。蛋氨酸的添加量优选为0.001～5重量％，更优选为0.01～1重量％，最优选为0.1重量％。通过添加蛋氨酸，可以观察到G-CSF的蛋氨酸残基氧化物生成率在检测限以下。本发明人等虽然没拘于特定的理论，但可以推断通过将添加的蛋氨酸氧化，而不是添加G-CSF的蛋氨酸残基，使G-CSF的蛋氨酸残基氧化物生成率下降。
作为本发明的制剂中的等渗化剂，可以使用聚乙二醇；糊精、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、葡萄糖、果糖、乳糖、木糖、甘露糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖等糖类或氯化钠、氯化钾等无机盐类，优选使用甘露糖醇或者氯化钠，特别优选使用甘露糖醇。甘露糖醇等糖类的添加量在制剂中为0.1～10重量％，更优选为0.5～6重量％。氯化钠等无机盐类的添加量在制剂中为20～200mM，优选为50～150mM。
本发明的制剂中还可以含有表面活性剂。作为表面活性剂可以举出非离子表面活性剂如山梨糖醇酐单辛酸酯、山梨糖醇酐单月桂酸酯、山梨糖醇酐单棕榈酸酯等山梨糖醇酐脂肪酸酯；甘油单辛酸酯、甘油单肉豆蔻酸酯、甘油单硬脂酸酯等甘油脂肪酸酯；十甘油基单硬脂酸酯、十甘油基二硬脂酸酯、十甘油基单亚油酸酯等聚甘油脂肪酸酯；聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸脂、聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐单硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐三油酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐三硬脂酸酯等聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯；聚氧乙烯山梨糖醇四硬脂酸酯、聚环氧乙山梨糖醇四油脂酸酯等聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯；聚氧乙烯甘油基单硬脂酸等聚氧乙烯甘油脂肪酸酯；聚乙二醇二硬脂酸酯等聚乙二醇脂肪酸酯；聚氧乙烯月桂基醚等聚氧乙烯烷基醚；聚氧乙烯聚氧丙烯乙二醇醚(polyoxyethylene polyoxypropylene glycol ether)、聚氧乙烯聚氧丙烯丙基醚、聚氧乙烯聚氧丙烯十六烷基醚等聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚；聚氧乙烯壬基苯基醚等聚氧乙烯烷基苯基醚；聚氧乙烯蓖麻子油、聚氧乙烯固化蓖麻子油(聚氧乙烯氢蓖麻子油)等聚氧乙烯固化蓖麻子油；聚氧乙烯山梨糖醇蜂蜡等聚氧乙烯蜂蜡衍生物；聚氧乙烯羊毛脂等聚氧乙烯羊毛脂衍生物；聚氧乙烯硬脂酰胺等聚氧乙烯脂肪酰胺等HLB6～18的物质；阴离子表面活性剂可以举出如十六烷基硫酸钠、月桂烷基硫酸纳、油基硫酸钠等具有碳原子数为10～18的烷基的烷基硫酸钠；聚氧乙烯月桂硫酸钠等环氧乙烯的平均加成摩尔数为2～4的烷基的碳原子数为10～18的聚氧乙烯烷基醚硫酸盐；月桂烷基硫代琥珀酸酯钠等烷基的碳原子数为8～18的烷基硫代琥珀酸酯盐；天然表面活性剂可以举出如卵磷脂、甘油磷脂质；鞘髓磷脂等鞘磷脂酯；碳原子数为12～18的脂肪酸的蔗糖脂肪酸脂等典型例子。本发明的制剂中，可以添加这些表面活性剂的1种或者2种以上的组合。
优选的表面活性剂是聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯，特别优选的是聚山梨酸酯20、21、40、60、65、80、81、85，最优选的是聚山梨酸酯20和80。
本发明的含G-CSF制剂中所添加的表面活性剂的添加量一般相对于G-CSF1重最份为0.0001～10重量份，优选相对于G-CSF1重量份为0.01～5重量份，最优选相对于G-CSF1重量份为0.2～2重量份。具体的可以适当选择表面活性剂添加量在0.0001～0.5重量％的范围。
本发明的G-CSF溶液制剂pH优选为5～7，更优选pH为5.5～6.8，再优选pH为6～6.7，最优选pH为6.5。
本发明的G-CSF溶液制剂中，根据需要进而可以含有稀释剂、溶解助剂、赋形剂、pH调节剂、无痛化剂、缓冲剂、含硫还原剂、防氧化剂等。例如作为含硫还原剂可以举出如N-乙酰半光氨酸、N-乙酰高半光氨酸、硫辛酸、硫撑二乙醇、硫代乙醇胺、硫代甘油、硫代山梨糖醇、巯基乙酸及其盐、硫代硫酸钠、谷光甘肽及碳原子数1～7的硫代链烷酸等具有巯基的物质。作为防氧化剂可以举出异抗坏血酸、二丁基羟基甲苯、丁基羟基联茴香醚、α一生育酚、醋酸生育酚、L-抗坏血酸及其盐、L-抗环血酸棕榈酸酯、L-抗坏血酸硬脂酸酯、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、没食子酸三戊基酯、没食子酸丙酯或者乙二胺四醋酸二钠(EDTA)、焦磷酸钠、偏磷酸钠等鳌合剂。进而还可以含有氯化钠、氯代钾、氯化钙、磷酸钠、磷酸钾、碳酸氢钠等无机盐；柠檬酸钠、柠檬酸钾、醋酸钠等有机盐等通常添加的成分。
本发明的溶液制剂，可以通过将这些成分溶解在磷酸缓冲液(优选为磷酸氢二钠一磷酸二氢钠)及/或柠檬酸缓冲液(优选为柠檬酸钠缓冲液)等溶液制剂领域公知的水性缓冲液中来制备。
本发明的稳定化G-CSF溶液制剂通常通过非经口给药途径例如注射剂(皮下、静注、肌注等)、透皮、经粘膜、经鼻、经肺等给予，也可以经口给予。
本发明的G-CSF溶液制剂，通常装在经密封、灭菌的塑料或者玻璃容器中。容器可以为安瓶、注射瓶(Vial)或者可处置注射器之类的以规定用量的形状供给的容器，也可以为注射用袋或者瓶之类的大容量形状的。
本发明的制剂中所含的G-CSF的量由应该治疗的疾病种类、疾病的严重程度、患者的年龄等来决定，一般最后给药浓度为1～1000μg/ml，优选10～800μg/ml，更优选50～500μg/ml。
在感染或癌证的化疗中，在给予抗生素、抗菌药、抗癌药等药物同时给予本发明的制剂，可以改善患者的抵抗力、活性等以免疫应答能力为基础的防御机能，在临床上非常有用。因此，本发明的制剂可以与这些药物合用。
本发明的G-CSF溶液制剂如后述的实施例所示，即使在40℃、进行2周的加速试验后，也具有极好的G-CSF残存率。另外，即使在40℃、进行2周的加速试验后，G-CSF的蛋氨酸残基氧化物生成率几乎没有。
本发明的G-CSF溶液制剂，在40℃、进行2周的加速试验后，G-CSF残存率在90％以上，优选为93％以上，最优选在95％以上，或者25℃、6个月的稳定性试验后，G-CSF的残存率在97％以上，或者10℃、1年的稳定性试验后，G-CSF的残存率在97％以上，并且40℃、2周的加速试验后，G-CSF的蛋氨酸残基氧化物的生成率在1％以下，优选在检测限以下，与过去已知的G-CSF溶液制剂相比非常稳定。
本发明的研究过程中，由于封装溶液制剂的瓶(vial)、注射器等容器条件(制备批之间的差异等)，添加组氨酸时可以观察到蛋氨酸残基氧化物增加现像，该现像以注射器尤为显著。该蛋氨酸残基氧化物的产生可以通过添加蛋氨酸来完全抑制。因此，制成预充(prefilled)注射器制剂来供给时，通过添加组氨酸等氨基酸和蛋氨酸或者已知的防氧化剂等抑制蛋氨酸残基氧化物生成的药物，可以极大地提高G-CSF的残存率，G-CSF的蛋氨酸残基氧化物生成率低，可以作为长期稳定的制剂。
本发明的G-CSF溶液制剂，即使在短期加速试验后长期保存，无论何种等渗剂或者容器形状，G-CSF的残存率都极高，是可以基本完全抑制G-CSF蛋氨酸残基氧化物的生成率的稳定制剂。
本发明通过以下实施例进行更详细说明，本发明的范围不限于此，本领域的技术人员可以基于本发明的记载进行各种变更和修饰，这些变更和修饰也包括在本发明的范围内。
实施例实施例1对各种氨基酸稳定性的作用将规定量的氨基酸、含0.01重量％的聚山梨酸酯20的250μg/ml的G-CSF、pH6.5调节剂灭菌过滤后，配成表1所载处方，将上述调节液以每瓶1ml无菌装入玻璃瓶，盖上栓。
表1受试试药序号G-CSF添加的氨基酸 (％)聚山梨酸酯 pH(μg/ml)20(％)1 250 甘氨酸 5 0.016.52 250 丙氨酸 4 0.016.53 250 脯氨酸 0.6 0.016.54 250 酪氨酸 0.320.016.55 250 谷氨酸钠 0.320.016.56 250 羟脯氨酸 0.080.016.57 250 精氨酸盐酸盐 0.4 0.016.58 250 赖氨酸盐酸盐 1 0.016.59 250 组氨酸盐酸盐 0.4 0.016.5经这样无菌配制、过滤所制备的表1所示的G-CSF制剂，在40℃的恒温槽进行2周的加速试验，用下述评价法1，通过未加速的试药和40℃、2周加速的试药，计算40℃、2周加速试验后的残存率(％)。
评价法1用C4反相柱(4.6mm×250mm、300埃)，以纯水、乙腈、三氟醋酸为流动相，用反相高效液相色谱法测定G-CSF的含量。G-CSF以5μg注入，通过乙腈的梯度洗脱使G-CSF洗脱出来，在215nm的波长下进行分光测定，测定G-CSF的含量。
利用通过本方法测定的G-CSF含量，按照下式计算40℃、2周加速试验后的残存率(％)。 其结果如表2表示。
表2受试试药序号 氨基酸40℃、2周加速试验后的残存率(％)1 甘氨酸 92.32 丙氨酸 89.63 脯氨酸 87.14 酪氨酸 83.75 谷氨酸钠 90.26 羟脯氨酸 89.17 精氨酸盐酸盐 96.38 赖氨酸盐酸盐 85.59 组氨酸盐酸盐 97.0从表中可以看出，通过添加甘氨酸、谷氨酸钠、精氨酸盐酸盐及组氨酸盐酸盐，40℃、2周加速试验后有良好的残存率。尤其是通过添加精氨盐酸盐及组氨酸盐酸盐，使残存率显著提高。
实施例2对添加了蛋氨酸的G-CSF氧化物产生的作用将规定量的蛋氨酸、含0.01重量％的聚山梨酸酯20的100μg/ml的G-CSF、pH6.5调节剂灭菌过滤后，配成表3所载的处方，将上述调节液以每瓶1ml无菌装入玻璃瓶，盖上栓。
表3受试试药序号G-CSF Met 聚山梨酸酯-20 pH(％)(μg/ml)(％)(％)10 100 0 0.01 6.511 100 0.1 0.01 6.5Met蛋氨酸经这样无菌配制、过滤所制备的表3所示的G-CSF制剂，在25℃的恒温槽保存5日后，用下述评价法2计算G-CSF氧化物的含量。
评价法2用C4反相柱(4.6mm×250mm、300埃)，以纯水、乙腈、三氟醋酸为流动相，用反相高效液相色谱法测定G-CSF的含量。G-CSF以5μg注入，通过乙腈的梯度洗脱使G-CSF洗脱出来，在215nm的波长下进行分光测定，测定G-CSF氧化物的峰面积、G-CSF未变化体的峰面积。含量。
利用通过本方法测定的各峰面积，按照下式计算G-CSF氧化物的含量(％)。 其结果如表4所示。
表4受试试药序号G-CSF(μg/ml) Met(％)G-CSF氧化物含量(％)10 1000 2.711 1000.1N.D.Met蛋氨酸N.D.未检出可以看出，通过添加蛋氨酸，抑制了G-CSF氧化物的产生。
实施例3组氨酸添加量对稳定性的作用将规定量的盐酸组氨酸、0.1重量％的蛋氨酸、含0.01重量％的聚山梨酸酯20的250μg/ml的G-CSF、pH6.5调节剂经灭菌过滤后，配成表5所载处方，将上述调节液以每瓶1ml无菌装入玻璃瓶，盖上栓。
表5受试试药序号 G-CSFHisMetNaCl 聚山梨酸酯-20 pH(μg/ml) (％)(％) (mM) (％)12 250 0 0.11000.01 6.513 250 0.1 0.11000.01 6.514 250 0.4 0.11000.01 6.515 250 0.8 0.11000.01 6.516 250 1.6 0.11000.01 6.5His组氨酸盐酸盐Met蛋氨酸NaCl氯化钠经这样无菌配制、过滤所制备的表5所示的G-CSF制剂，在40℃的恒温槽进行2周的加速试验，用上述评价法1，通过未加速试验的试药和40℃、2周加速试验的试验，计算40℃、2周加速试验后的残存率(％)。其结果如表6所示。
表6受试试药序号 His(％) 40℃、2周加速试验后的残存率(％)12 085.513 0.1 97.214 0.4 99.115 0.8 97.616 1.6 98.1His组氨酸盐酸盐随着添加组氨酸，使残存率有飞越性提高，短期加速试验的稳定可以提高。
另外，受试试药序号第12-16的G-CSF的蛋氨酸残基氧化物均在检测限以下。
实施例4容器形状对稳定性的作用将0.4重量％的盐酸组氨酸、0.1重量％的蛋氨酸、含0.01重量％的聚山梨酸酯20的250μg/ml的G-CSF、pH6.5调节剂灭菌过滤后，配成表7所载处方，以每瓶1ml无菌装入下述容器形态的玻璃瓶，盖上栓。
表7受试试G-CSF His Met NaCl聚山梨酸酯pH容器形态药序号(μg/ml) (％) (％) (mM)-20(％)17250 0 0 100 0.01 6.5 瓶18250 0 0 100 0.01 6.5 注射器19250 0.4 0.1 100 0.01 6.5 瓶20250 0.4 0.1 100 0.01 6.5 注射器His组氨酸盐酸盐Met蛋氨酸Nacl氯化钠注射器在Becton Dickinson社制玻璃注射器(Hypak S CF1ml长)中填充上述调剂液，用Becton Dickinson社制活塞(Hypak SCF)密封栓拄。瓶将上述调剂液填充到未处理白色玻璃瓶中，用橡胶栓栓住。
经这样无菌配制、过滤所制备的表7所示的G-CSF制剂，在40℃的恒温槽进行2周的加速试验，用上述的评价法1，通过未加速试验的试药和40℃、2周加速试验的试药，计算40℃、2周加速试验后，25℃、6个月保存后，10℃、1年保存后的残存率(％)。其结果如表8所示。
表8受试试药序号His(％)容器形状残存率(％)40℃、2周加 25℃、6个月 10℃、1年保速试验后 保存后 存后17 0 瓶 92.3 95.4 96.318 0 注射器 90.8 93.1 93.319 0.4瓶 98.0 97.7 98.120 0.4注射器 99.1 97.9 98.1不仅40℃的短期加速试验，在25℃和10℃的长期保存试验中，添加组氨酸后的效果也很显著，通过添加组氨酸可以看出，能确保G-CSF制剂的长期保存稳定性。另外，受试试药第19和20号的G-CSF的蛋氨酸残基氧化物均在检测限以下。由结果可以认为无论容器形状如何，都可以提供稳定的G-CSF制剂。
在本研究中，由于封入溶液制剂的瓶或者注射器的制造批之间的差异，仅添加0.4％的组氨酸时蛋氨酸残基氧化物出现增加的情况，尤其是注射器的情况显著。通过添加0.1％的蛋氨酸，蛋氨酸残基氧化物在检测限以下。
实施例5等渗剂对稳定性作用将规定量的等渗剂(氯代钠或者D-甘露糖醇)、0.4重量％的盐酸组氨酸、0.1重量％的蛋氨酸、含0.01重量％的聚山梨酸酯20的250μg/ml的G-CSF、pH6.5调节剂灭菌过滤后，配成表9所载处方，以每瓶1ml无菌装入玻璃瓶中，盖上栓。
表9受试试G-CSF His Met 等渗剂 聚山梨酸酯-20 pH药序号(μg/ml) (％)(％) (％)21250 0.4 0.1100mMNaCL 0.01 6.522250 0.4 0.12.5％甘露糖醇 0.01 6.5His组氨酸盐酸盐Met蛋氨酸NaCL氯化钠经这样无菌配制、过滤所制备的表9所示的G-CSF制剂，在40℃的恒温槽进行2周的加速试验，用上述的评价法1，通过未加速试验的试药和40℃、2周加速试验的试药，计算25℃、4个月保存后，25℃、6个月保存后，10℃、1年保存后的残存率(％)。其结果如表10所示。
表10受试试 残存率(％)药序号 等渗剂25℃、4个月保存后 25℃、6个月保存后 10℃、1年保存后21 NaCl 97.796.497.622 甘露糖醇 97.497.196.7另外，受试试药第21和22号的G-CSF蛋氨酸残基氧化物均检测限以下。
由结果可以看出，无论何种等渗剂，都可以确保良好的稳定性。
权利要求
1.一种G-CSF溶液制剂，其中，作为稳定剂实质上不含蛋白质，另外作为稳定剂，含有至少1种氨基酸或其盐。
2.权利要求1所述的G-CSF溶液制剂，其中，氨基酸为从甘氨酸、谷氨酸钠、精氨酸及组氨酸或者它们的盐的组成中选出的1种以上。
3.权利要求2所述的G-CSF溶液制剂，其中，氨基酸为从精氨酸及组氨酸或者它们的盐的组成中选出的1种以上。
4.权利要求3所述的G-CSF溶液制剂，其中，氨基酸为组氨酸或者其盐。
5.权利要求1-4的任一项所述的G-CSF溶液制剂，其中，还含有蛋氨酸。
6.权利要求1-5的任一项所述的G-CSF溶液制剂，其中，氨基酸的添加量为0.01重量％-10重量％。
7.权利要求6所述的G-CSF溶液制剂，其中，组氨酸或者其盐的添加量为0.01重量％-10重量％。
8.权利要求1-7的任一项所述的G-CSF溶液制剂，其中，还含有甘露糖醇和/或氯化钠。
9.权利要求1-8的任一项所述的G-CSF溶液制剂，其中，还含有表面活性剂。
10.权利要求9所述的G-CSF溶液制剂，其中，表面活性剂为聚氧乙烯山梨糖醇酐烷基酯。
11.权利要求10所述的G-CSF溶液制剂，其中，表面活性剂为聚山梨酸酯20和/或80。
12.权利要求1-11的任一项所述的G-CSF溶液制剂，其中，pH为5-7。
13.权利要求12所述的G-CSF溶液制剂，其中，pH为5.5-6.8。
14.权利要求1-13的任一项所述的G-CSF溶液制剂，其中，G-CSF为由CHO细胞产生的G-CSF。
15.权利要求1-14任一项所述的G-CSF溶液制剂，其中，为瓶制剂或者预充注射器制剂。
16.权利要求15所述的G-CSF溶液制剂，其中，为预充注射器制剂。
17.一种稳定的G-CSF溶液制剂，其中，在40℃、2周加速试验后，G-CSF的残存率在90％以上，或者25℃、6个月的稳定性试验后，G-CSF的残存率在97％以上，或者10℃、1年的稳定性试验后，G-CSF的残存率在97％以上，并且40℃、2周加速试验后，G-CSF的蛋氨酸残基氧化物的生成率在1％以下。
18.一种稳定的G-CSF溶液制剂，其中，实质上不含G-CSF蛋氨酸残基氧化物。
19.一种G-CSF溶液制剂的稳定化方法，其中包括作为稳定剂实质上不含蛋白质，另外作为稳定剂，添加至少1种氨基酸或其盐。
20.至少一种氨基酸或其盐的用途，其用于制备稳定化的G-CSF溶液制剂。
全文摘要
一种G－CSF溶液制剂，其中，作为稳定剂实质上不含蛋白质，另外作为稳定剂，含有至少1种氨基酸或其盐。
文档编号A61K38/19GK1449292SQ01814993
公开日2003年10月15日 申请日期2001年9月3日 优先权日2000年9月1日
发明者佐藤泰 申请人:中外制药株式会社
技术领域：
本发明涉及G-CSF(粒细胞集落刺激因子)溶液制剂，尤其是涉及长期保存后的活性成分也没有损失，并且G-CSF的蛋氨酸残基氧化体生成率低的稳定的G-CSF制剂。
本发明人通过培养由口腔癌患者的肿瘤细胞中采取的细胞株，精制得到高纯度的人G-CSF后，以此为契机，成功的进行了人G-CSF遗传基因的克隆，现在通过遗传基因工程的方法已经可以用微生物细胞或动物细胞大量重组生产人G-CSF。另外，本发明人成功地对该精制G-CSF进行制剂，将此作为预防感染药投放市场(专利第2116515号)。
G-CSF的使用量极微量，通常成年人每人给药为将含0.1～1000μg(优选5～500μg)G-CSF的制剂以1～7次/周的比例给药。尽管如此，该G-CSF对诸如注射用安瓶、注射器等器壁有吸咐性。另外，G-CSF不稳定，易受外界因素的影响，因为温度、湿度、氧、紫外线等产生缔合、聚合或者氧化等物理或化学变化，结果导致活性大幅降低。
过去，为了防止这些影响，剂型主要选择冷冻干燥制剂，进行各种处方设计。例如提出了一种制剂，其含有至少由(a)从苏氨酸、色氨酸、赖氨酸、羟赖氨酸、组氨酸、精氨酸、半光氨酸、光氨酸和蛋氨酸的组成中选出的至少1种氨基酸，(b)至少1种含硫还原剂或者(c)至少1种防氧化剂的组成中选出的至少1种(专利第2577744号)等。另外，还有含稳定剂是聚山梨酸酯等表面活性剂的G-CSF制剂(特开昭63-146826号)。
另外，还有含麦芽糖、棉子糖、蔗糖、海藻糖或氨基糖的G-CSF冷冻干燥制剂的报道(特表平8-504784号)。
但是，在冷冻干燥工序中存在的问题是引起工业生产成本增加，由于机械问题导致危险性增大。而且，使用冷冻干燥制剂时必须用纯水(注射用灭菌水)溶解，很麻烦。
另一方面，过去市场上的制品中，为了抑制化学或物理变化，一般添加作为稳定剂使用的人血清白蛋白或者精制明胶等蛋白质。尽管如此，添加蛋白质作为稳定剂存在的问题是为了去除病毒的感染等需要非常复杂的工序等。
然而，没有添加这类蛋白质时存在问题是G-CSF的蛋氨酸残基氧化物变多，导致质量下降。
基于上述原因，要求不含作为稳定剂的蛋白质，并且即使长期保存也稳定，能够代替冷冻干燥制剂的G-CSF溶液制剂。
即，本发明提供一种G-CSF溶液制剂，作为稳定剂实质上不含蛋白质，另外作为稳定剂，含有至少1种氨基酸或其盐。
本发明进而还提供一种上述的G-CSF溶液制剂，其中，氨基酸为从甘氨酸、谷氨酸钠、精氨酸及组氨酸或者它们盐的组成中选出的1种以上。
本发明进而还提供一种上述的G-CSF溶液制剂，其中，氨基酸为从精氨酸及组氨酸或者它们的盐的组成选出的1种以上。
本发明进而还提供一种上述的G-CSF溶液制剂，其中，氨基酸为组氨酸或者其盐。
本发明进而还提供一种上述的G-CSF溶液制剂，其中，还含有蛋氨酸。
本发明进而还提供一种上述的G-CSF溶液制剂，其中，氨基酸的添加量为0.01重量％～10重量％。
本发明进而还提供一种上述的G-CSF溶液制剂，其中，组氨酸或者其盐的添加量为0.01重量％～10重量％。
本发明进而还提供一种上述的G-CSF溶液制剂，其中，还含有甘露糖醇和/或氯化钠。
本发明进而还提供一种上述的G-CSF溶液制剂，其中，还含有表面活性剂。
本发明进而还提供一种上述的G-CSF溶液制剂，其中，表面活性剂为聚氧乙烯山梨糖醇酐烷基酯。
本发明进而还提供一种上述的G-CSF溶液制剂，其中，表面活性剂为聚山梨酸酯20和/或80。
本发明进而还提供一种上述的G-CSF溶液制剂，其中，pH为5～7。
本发明进而还提供一种上述的G-CSF溶液制剂，其中，pH为5.5～6.8。
本发明进而还提供一种上述的G-CSF溶液制剂，其中，G-CSF为由CHO细胞产生的G-CSF。
本发明进而还提供一种上述的G-CSF制剂，其中，为瓶制剂或者预充注射(プレフイルドシリンジ)制剂。
本发明进而还提供一种稳定的G-CSF溶液制剂，其中，在40℃、2周的加速试验后，G-CSF残存率在90％以上，或者25℃、6个月的稳定性试验后，G-CSF的残存率在97％以上，或者10℃、1年的稳定性试验后，G-CSF的残存率在97％以上，并且40℃、2周的加速试验后，G-CSF蛋氨酸残基氧化物的生成率在1％以下。
本发明进而提供一种稳定的G-CSF溶液制剂，实质上不含G-CSF蛋氨酸残基氧化物。此处所说的“实质上不含G-CSF蛋氨酸残基氧化物”是指上述G-CSF的蛋氨酸残基氧化物在检测限以下。
本发明进而提供一种G-CSF溶液制剂的稳定化方法，其中，作为稳定剂实质上不含蛋白质，另外作为稳定剂，添加至少1种氨基酸或其盐。
本发明进而提供通过至少一种氨基酸及其盐来制备稳定的G-CSF溶液制剂的使用。
作为本发明的溶液制剂为不含制备工序中的冷冻干燥工序，在溶液状态能够长期保存的制剂。
本发明的G-CSF溶液制剂，优选实质上不含有作为稳定剂的人血清白蛋白或精制明胶等蛋白质。
本发明的G-CSF溶液制剂，作为稳定剂，含有至少1种氨基酸或其盐。作为上述氨基酸，优选为从甘氨酸、谷氨酸纳、精氨酸及组氨酸或者它们盐的组成中选出的1种以上，更优选为从精氨酸及组氨酸或者它们的盐的组成中选出的1种以上，最优选含有组氨酸或其盐。
本发明所用的氨基酸，包括游离氨基酸及其钠盐、钾盐、盐酸盐等盐。本发明的制剂中，含有这些氨基酸的D-、L-及DL-体，更优选的为L-体及其盐。
本发明的制剂中添加的氨基酸的添加量由所用氨基酸的种类而定，用后述的试验方法可以确定优选的范围。一般为0.001～10重量％，优选为0.01～5重量％，更优选为0.1～3重量％。组氨酸或其盐通常为0.01～10重量％，优选为0.05～3重量％，最优选为0.1～2重量％。组氨酸盐酸盐的情况下，在40℃、2周加速试验中，在试验的0.1～1.6重量％范围，具有极高的G-CSF残存率，在0.4重量％的残存率最高。
本发明的G-CSF溶液制剂优选含有蛋氨酸。蛋氨酸的添加量优选为0.001～5重量％，更优选为0.01～1重量％，最优选为0.1重量％。通过添加蛋氨酸，可以观察到G-CSF的蛋氨酸残基氧化物生成率在检测限以下。本发明人等虽然没拘于特定的理论，但可以推断通过将添加的蛋氨酸氧化，而不是添加G-CSF的蛋氨酸残基，使G-CSF的蛋氨酸残基氧化物生成率下降。
作为本发明的制剂中的等渗化剂，可以使用聚乙二醇；糊精、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、葡萄糖、果糖、乳糖、木糖、甘露糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖等糖类或氯化钠、氯化钾等无机盐类，优选使用甘露糖醇或者氯化钠，特别优选使用甘露糖醇。甘露糖醇等糖类的添加量在制剂中为0.1～10重量％，更优选为0.5～6重量％。氯化钠等无机盐类的添加量在制剂中为20～200mM，优选为50～150mM。
本发明的制剂中还可以含有表面活性剂。作为表面活性剂可以举出非离子表面活性剂如山梨糖醇酐单辛酸酯、山梨糖醇酐单月桂酸酯、山梨糖醇酐单棕榈酸酯等山梨糖醇酐脂肪酸酯；甘油单辛酸酯、甘油单肉豆蔻酸酯、甘油单硬脂酸酯等甘油脂肪酸酯；十甘油基单硬脂酸酯、十甘油基二硬脂酸酯、十甘油基单亚油酸酯等聚甘油脂肪酸酯；聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸脂、聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐单硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐三油酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐三硬脂酸酯等聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯；聚氧乙烯山梨糖醇四硬脂酸酯、聚环氧乙山梨糖醇四油脂酸酯等聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯；聚氧乙烯甘油基单硬脂酸等聚氧乙烯甘油脂肪酸酯；聚乙二醇二硬脂酸酯等聚乙二醇脂肪酸酯；聚氧乙烯月桂基醚等聚氧乙烯烷基醚；聚氧乙烯聚氧丙烯乙二醇醚(polyoxyethylene polyoxypropylene glycol ether)、聚氧乙烯聚氧丙烯丙基醚、聚氧乙烯聚氧丙烯十六烷基醚等聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚；聚氧乙烯壬基苯基醚等聚氧乙烯烷基苯基醚；聚氧乙烯蓖麻子油、聚氧乙烯固化蓖麻子油(聚氧乙烯氢蓖麻子油)等聚氧乙烯固化蓖麻子油；聚氧乙烯山梨糖醇蜂蜡等聚氧乙烯蜂蜡衍生物；聚氧乙烯羊毛脂等聚氧乙烯羊毛脂衍生物；聚氧乙烯硬脂酰胺等聚氧乙烯脂肪酰胺等HLB6～18的物质；阴离子表面活性剂可以举出如十六烷基硫酸钠、月桂烷基硫酸纳、油基硫酸钠等具有碳原子数为10～18的烷基的烷基硫酸钠；聚氧乙烯月桂硫酸钠等环氧乙烯的平均加成摩尔数为2～4的烷基的碳原子数为10～18的聚氧乙烯烷基醚硫酸盐；月桂烷基硫代琥珀酸酯钠等烷基的碳原子数为8～18的烷基硫代琥珀酸酯盐；天然表面活性剂可以举出如卵磷脂、甘油磷脂质；鞘髓磷脂等鞘磷脂酯；碳原子数为12～18的脂肪酸的蔗糖脂肪酸脂等典型例子。本发明的制剂中，可以添加这些表面活性剂的1种或者2种以上的组合。
优选的表面活性剂是聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯，特别优选的是聚山梨酸酯20、21、40、60、65、80、81、85，最优选的是聚山梨酸酯20和80。
本发明的含G-CSF制剂中所添加的表面活性剂的添加量一般相对于G-CSF1重最份为0.0001～10重量份，优选相对于G-CSF1重量份为0.01～5重量份，最优选相对于G-CSF1重量份为0.2～2重量份。具体的可以适当选择表面活性剂添加量在0.0001～0.5重量％的范围。
本发明的G-CSF溶液制剂pH优选为5～7，更优选pH为5.5～6.8，再优选pH为6～6.7，最优选pH为6.5。
本发明的G-CSF溶液制剂中，根据需要进而可以含有稀释剂、溶解助剂、赋形剂、pH调节剂、无痛化剂、缓冲剂、含硫还原剂、防氧化剂等。例如作为含硫还原剂可以举出如N-乙酰半光氨酸、N-乙酰高半光氨酸、硫辛酸、硫撑二乙醇、硫代乙醇胺、硫代甘油、硫代山梨糖醇、巯基乙酸及其盐、硫代硫酸钠、谷光甘肽及碳原子数1～7的硫代链烷酸等具有巯基的物质。作为防氧化剂可以举出异抗坏血酸、二丁基羟基甲苯、丁基羟基联茴香醚、α一生育酚、醋酸生育酚、L-抗坏血酸及其盐、L-抗环血酸棕榈酸酯、L-抗坏血酸硬脂酸酯、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、没食子酸三戊基酯、没食子酸丙酯或者乙二胺四醋酸二钠(EDTA)、焦磷酸钠、偏磷酸钠等鳌合剂。进而还可以含有氯化钠、氯代钾、氯化钙、磷酸钠、磷酸钾、碳酸氢钠等无机盐；柠檬酸钠、柠檬酸钾、醋酸钠等有机盐等通常添加的成分。
本发明的溶液制剂，可以通过将这些成分溶解在磷酸缓冲液(优选为磷酸氢二钠一磷酸二氢钠)及/或柠檬酸缓冲液(优选为柠檬酸钠缓冲液)等溶液制剂领域公知的水性缓冲液中来制备。
本发明的稳定化G-CSF溶液制剂通常通过非经口给药途径例如注射剂(皮下、静注、肌注等)、透皮、经粘膜、经鼻、经肺等给予，也可以经口给予。
本发明的G-CSF溶液制剂，通常装在经密封、灭菌的塑料或者玻璃容器中。容器可以为安瓶、注射瓶(Vial)或者可处置注射器之类的以规定用量的形状供给的容器，也可以为注射用袋或者瓶之类的大容量形状的。
本发明的制剂中所含的G-CSF的量由应该治疗的疾病种类、疾病的严重程度、患者的年龄等来决定，一般最后给药浓度为1～1000μg/ml，优选10～800μg/ml，更优选50～500μg/ml。
在感染或癌证的化疗中，在给予抗生素、抗菌药、抗癌药等药物同时给予本发明的制剂，可以改善患者的抵抗力、活性等以免疫应答能力为基础的防御机能，在临床上非常有用。因此，本发明的制剂可以与这些药物合用。
本发明的G-CSF溶液制剂如后述的实施例所示，即使在40℃、进行2周的加速试验后，也具有极好的G-CSF残存率。另外，即使在40℃、进行2周的加速试验后，G-CSF的蛋氨酸残基氧化物生成率几乎没有。
本发明的G-CSF溶液制剂，在40℃、进行2周的加速试验后，G-CSF残存率在90％以上，优选为93％以上，最优选在95％以上，或者25℃、6个月的稳定性试验后，G-CSF的残存率在97％以上，或者10℃、1年的稳定性试验后，G-CSF的残存率在97％以上，并且40℃、2周的加速试验后，G-CSF的蛋氨酸残基氧化物的生成率在1％以下，优选在检测限以下，与过去已知的G-CSF溶液制剂相比非常稳定。
本发明的研究过程中，由于封装溶液制剂的瓶(vial)、注射器等容器条件(制备批之间的差异等)，添加组氨酸时可以观察到蛋氨酸残基氧化物增加现像，该现像以注射器尤为显著。该蛋氨酸残基氧化物的产生可以通过添加蛋氨酸来完全抑制。因此，制成预充(prefilled)注射器制剂来供给时，通过添加组氨酸等氨基酸和蛋氨酸或者已知的防氧化剂等抑制蛋氨酸残基氧化物生成的药物，可以极大地提高G-CSF的残存率，G-CSF的蛋氨酸残基氧化物生成率低，可以作为长期稳定的制剂。
本发明的G-CSF溶液制剂，即使在短期加速试验后长期保存，无论何种等渗剂或者容器形状，G-CSF的残存率都极高，是可以基本完全抑制G-CSF蛋氨酸残基氧化物的生成率的稳定制剂。
本发明通过以下实施例进行更详细说明，本发明的范围不限于此，本领域的技术人员可以基于本发明的记载进行各种变更和修饰，这些变更和修饰也包括在本发明的范围内。
实施例实施例1对各种氨基酸稳定性的作用将规定量的氨基酸、含0.01重量％的聚山梨酸酯20的250μg/ml的G-CSF、pH6.5调节剂灭菌过滤后，配成表1所载处方，将上述调节液以每瓶1ml无菌装入玻璃瓶，盖上栓。
表1受试试药序号G-CSF添加的氨基酸 (％)聚山梨酸酯 pH(μg/ml)20(％)1 250 甘氨酸 5 0.016.52 250 丙氨酸 4 0.016.53 250 脯氨酸 0.6 0.016.54 250 酪氨酸 0.320.016.55 250 谷氨酸钠 0.320.016.56 250 羟脯氨酸 0.080.016.57 250 精氨酸盐酸盐 0.4 0.016.58 250 赖氨酸盐酸盐 1 0.016.59 250 组氨酸盐酸盐 0.4 0.016.5经这样无菌配制、过滤所制备的表1所示的G-CSF制剂，在40℃的恒温槽进行2周的加速试验，用下述评价法1，通过未加速的试药和40℃、2周加速的试药，计算40℃、2周加速试验后的残存率(％)。
评价法1用C4反相柱(4.6mm×250mm、300埃)，以纯水、乙腈、三氟醋酸为流动相，用反相高效液相色谱法测定G-CSF的含量。G-CSF以5μg注入，通过乙腈的梯度洗脱使G-CSF洗脱出来，在215nm的波长下进行分光测定，测定G-CSF的含量。
利用通过本方法测定的G-CSF含量，按照下式计算40℃、2周加速试验后的残存率(％)。 其结果如表2表示。
表2受试试药序号 氨基酸40℃、2周加速试验后的残存率(％)1 甘氨酸 92.32 丙氨酸 89.63 脯氨酸 87.14 酪氨酸 83.75 谷氨酸钠 90.26 羟脯氨酸 89.17 精氨酸盐酸盐 96.38 赖氨酸盐酸盐 85.59 组氨酸盐酸盐 97.0从表中可以看出，通过添加甘氨酸、谷氨酸钠、精氨酸盐酸盐及组氨酸盐酸盐，40℃、2周加速试验后有良好的残存率。尤其是通过添加精氨盐酸盐及组氨酸盐酸盐，使残存率显著提高。
实施例2对添加了蛋氨酸的G-CSF氧化物产生的作用将规定量的蛋氨酸、含0.01重量％的聚山梨酸酯20的100μg/ml的G-CSF、pH6.5调节剂灭菌过滤后，配成表3所载的处方，将上述调节液以每瓶1ml无菌装入玻璃瓶，盖上栓。
表3受试试药序号G-CSF Met 聚山梨酸酯-20 pH(％)(μg/ml)(％)(％)10 100 0 0.01 6.511 100 0.1 0.01 6.5Met蛋氨酸经这样无菌配制、过滤所制备的表3所示的G-CSF制剂，在25℃的恒温槽保存5日后，用下述评价法2计算G-CSF氧化物的含量。
评价法2用C4反相柱(4.6mm×250mm、300埃)，以纯水、乙腈、三氟醋酸为流动相，用反相高效液相色谱法测定G-CSF的含量。G-CSF以5μg注入，通过乙腈的梯度洗脱使G-CSF洗脱出来，在215nm的波长下进行分光测定，测定G-CSF氧化物的峰面积、G-CSF未变化体的峰面积。含量。
利用通过本方法测定的各峰面积，按照下式计算G-CSF氧化物的含量(％)。 其结果如表4所示。
表4受试试药序号G-CSF(μg/ml) Met(％)G-CSF氧化物含量(％)10 1000 2.711 1000.1N.D.Met蛋氨酸N.D.未检出可以看出，通过添加蛋氨酸，抑制了G-CSF氧化物的产生。
实施例3组氨酸添加量对稳定性的作用将规定量的盐酸组氨酸、0.1重量％的蛋氨酸、含0.01重量％的聚山梨酸酯20的250μg/ml的G-CSF、pH6.5调节剂经灭菌过滤后，配成表5所载处方，将上述调节液以每瓶1ml无菌装入玻璃瓶，盖上栓。
表5受试试药序号 G-CSFHisMetNaCl 聚山梨酸酯-20 pH(μg/ml) (％)(％) (mM) (％)12 250 0 0.11000.01 6.513 250 0.1 0.11000.01 6.514 250 0.4 0.11000.01 6.515 250 0.8 0.11000.01 6.516 250 1.6 0.11000.01 6.5His组氨酸盐酸盐Met蛋氨酸NaCl氯化钠经这样无菌配制、过滤所制备的表5所示的G-CSF制剂，在40℃的恒温槽进行2周的加速试验，用上述评价法1，通过未加速试验的试药和40℃、2周加速试验的试验，计算40℃、2周加速试验后的残存率(％)。其结果如表6所示。
表6受试试药序号 His(％) 40℃、2周加速试验后的残存率(％)12 085.513 0.1 97.214 0.4 99.115 0.8 97.616 1.6 98.1His组氨酸盐酸盐随着添加组氨酸，使残存率有飞越性提高，短期加速试验的稳定可以提高。
另外，受试试药序号第12-16的G-CSF的蛋氨酸残基氧化物均在检测限以下。
实施例4容器形状对稳定性的作用将0.4重量％的盐酸组氨酸、0.1重量％的蛋氨酸、含0.01重量％的聚山梨酸酯20的250μg/ml的G-CSF、pH6.5调节剂灭菌过滤后，配成表7所载处方，以每瓶1ml无菌装入下述容器形态的玻璃瓶，盖上栓。
表7受试试G-CSF His Met NaCl聚山梨酸酯pH容器形态药序号(μg/ml) (％) (％) (mM)-20(％)17250 0 0 100 0.01 6.5 瓶18250 0 0 100 0.01 6.5 注射器19250 0.4 0.1 100 0.01 6.5 瓶20250 0.4 0.1 100 0.01 6.5 注射器His组氨酸盐酸盐Met蛋氨酸Nacl氯化钠注射器在Becton Dickinson社制玻璃注射器(Hypak S CF1ml长)中填充上述调剂液，用Becton Dickinson社制活塞(Hypak SCF)密封栓拄。瓶将上述调剂液填充到未处理白色玻璃瓶中，用橡胶栓栓住。
经这样无菌配制、过滤所制备的表7所示的G-CSF制剂，在40℃的恒温槽进行2周的加速试验，用上述的评价法1，通过未加速试验的试药和40℃、2周加速试验的试药，计算40℃、2周加速试验后，25℃、6个月保存后，10℃、1年保存后的残存率(％)。其结果如表8所示。
表8受试试药序号His(％)容器形状残存率(％)40℃、2周加 25℃、6个月 10℃、1年保速试验后 保存后 存后17 0 瓶 92.3 95.4 96.318 0 注射器 90.8 93.1 93.319 0.4瓶 98.0 97.7 98.120 0.4注射器 99.1 97.9 98.1不仅40℃的短期加速试验，在25℃和10℃的长期保存试验中，添加组氨酸后的效果也很显著，通过添加组氨酸可以看出，能确保G-CSF制剂的长期保存稳定性。另外，受试试药第19和20号的G-CSF的蛋氨酸残基氧化物均在检测限以下。由结果可以认为无论容器形状如何，都可以提供稳定的G-CSF制剂。
在本研究中，由于封入溶液制剂的瓶或者注射器的制造批之间的差异，仅添加0.4％的组氨酸时蛋氨酸残基氧化物出现增加的情况，尤其是注射器的情况显著。通过添加0.1％的蛋氨酸，蛋氨酸残基氧化物在检测限以下。
实施例5等渗剂对稳定性作用将规定量的等渗剂(氯代钠或者D-甘露糖醇)、0.4重量％的盐酸组氨酸、0.1重量％的蛋氨酸、含0.01重量％的聚山梨酸酯20的250μg/ml的G-CSF、pH6.5调节剂灭菌过滤后，配成表9所载处方，以每瓶1ml无菌装入玻璃瓶中，盖上栓。
表9受试试G-CSF His Met 等渗剂 聚山梨酸酯-20 pH药序号(μg/ml) (％)(％) (％)21250 0.4 0.1100mMNaCL 0.01 6.522250 0.4 0.12.5％甘露糖醇 0.01 6.5His组氨酸盐酸盐Met蛋氨酸NaCL氯化钠经这样无菌配制、过滤所制备的表9所示的G-CSF制剂，在40℃的恒温槽进行2周的加速试验，用上述的评价法1，通过未加速试验的试药和40℃、2周加速试验的试药，计算25℃、4个月保存后，25℃、6个月保存后，10℃、1年保存后的残存率(％)。其结果如表10所示。
表10受试试 残存率(％)药序号 等渗剂25℃、4个月保存后 25℃、6个月保存后 10℃、1年保存后21 NaCl 97.796.497.622 甘露糖醇 97.497.196.7另外，受试试药第21和22号的G-CSF蛋氨酸残基氧化物均检测限以下。
由结果可以看出，无论何种等渗剂，都可以确保良好的稳定性。
权利要求
1.一种G-CSF溶液制剂，其中，作为稳定剂实质上不含蛋白质，另外作为稳定剂，含有至少1种氨基酸或其盐。
2.权利要求1所述的G-CSF溶液制剂，其中，氨基酸为从甘氨酸、谷氨酸钠、精氨酸及组氨酸或者它们的盐的组成中选出的1种以上。
3.权利要求2所述的G-CSF溶液制剂，其中，氨基酸为从精氨酸及组氨酸或者它们的盐的组成中选出的1种以上。
4.权利要求3所述的G-CSF溶液制剂，其中，氨基酸为组氨酸或者其盐。
5.权利要求1-4的任一项所述的G-CSF溶液制剂，其中，还含有蛋氨酸。
6.权利要求1-5的任一项所述的G-CSF溶液制剂，其中，氨基酸的添加量为0.01重量％-10重量％。
7.权利要求6所述的G-CSF溶液制剂，其中，组氨酸或者其盐的添加量为0.01重量％-10重量％。
8.权利要求1-7的任一项所述的G-CSF溶液制剂，其中，还含有甘露糖醇和/或氯化钠。
9.权利要求1-8的任一项所述的G-CSF溶液制剂，其中，还含有表面活性剂。
10.权利要求9所述的G-CSF溶液制剂，其中，表面活性剂为聚氧乙烯山梨糖醇酐烷基酯。
11.权利要求10所述的G-CSF溶液制剂，其中，表面活性剂为聚山梨酸酯20和/或80。
12.权利要求1-11的任一项所述的G-CSF溶液制剂，其中，pH为5-7。
13.权利要求12所述的G-CSF溶液制剂，其中，pH为5.5-6.8。
14.权利要求1-13的任一项所述的G-CSF溶液制剂，其中，G-CSF为由CHO细胞产生的G-CSF。
15.权利要求1-14任一项所述的G-CSF溶液制剂，其中，为瓶制剂或者预充注射器制剂。
16.权利要求15所述的G-CSF溶液制剂，其中，为预充注射器制剂。
17.一种稳定的G-CSF溶液制剂，其中，在40℃、2周加速试验后，G-CSF的残存率在90％以上，或者25℃、6个月的稳定性试验后，G-CSF的残存率在97％以上，或者10℃、1年的稳定性试验后，G-CSF的残存率在97％以上，并且40℃、2周加速试验后，G-CSF的蛋氨酸残基氧化物的生成率在1％以下。
18.一种稳定的G-CSF溶液制剂，其中，实质上不含G-CSF蛋氨酸残基氧化物。
19.一种G-CSF溶液制剂的稳定化方法，其中包括作为稳定剂实质上不含蛋白质，另外作为稳定剂，添加至少1种氨基酸或其盐。
20.至少一种氨基酸或其盐的用途，其用于制备稳定化的G-CSF溶液制剂。
全文摘要
一种G－CSF溶液制剂，其中，作为稳定剂实质上不含蛋白质，另外作为稳定剂，含有至少1种氨基酸或其盐。
文档编号A61K38/19GK1449292SQ01814993
公开日2003年10月15日 申请日期2001年9月3日 优先权日2000年9月1日
发明者佐藤泰 申请人:中外制药株式会社
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