一种用于调节肠道菌群和增强免疫力的含双歧杆菌的组合物的制作方法
专利名称：一种用于调节肠道菌群和增强免疫力的含双歧杆菌的组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种双歧杆菌制品，特别 是涉及一种用于调节肠道菌群和增强免疫 力的含双歧杆菌的组合物，属于双歧杆菌制品制备技术领域。
背景技术：
肠道微生态系统是人体最大、最复杂的微生态系统，也是人体微生态系统中最 主要和最活跃的部分。肠道菌群是肠道防御屏障的重要组成部分，平衡的肠道菌群对 人的健康十分重要。但是，由于机体衰老、环境污染、饮食改变、滥用抗生素等原因， 往往使人体肠道微生态系统受到破坏，引起肠道菌群失调，严重影响身体的免疫系统机 能，造成免疫功能低下，导致菌群易位，诱发内源感染，造成机体病变，从而引发多种 疾病，如肝硬化、胆结石、动脉硬化、冠心病、心肌梗塞、脑动脉硬化、脑中风等。双歧杆菌是1899年在法国巴斯德研究所由Tisser.H博士首次从健康的母乳哺育 婴儿的粪便中发现并分离出来的，是人体肠道内重要的生理性细菌，与人的一生始终保 持着和谐的共生关系，是健康个体肠道中的优势菌，其促进人体健康的有益作用远远超 过其它乳酸菌。基于双歧杆菌的生物化学屏障、抑制致病菌和腐败菌、提供营养、提高 免疫力功能及其临床功效的肯定，国内外研究者相继开发出多种双歧杆菌食品和微生态 药品用于保健功能和治疗各种因素引起的肠道菌群失调和免疫功能低下，通过外源方式 增加人体肠道中双歧杆菌数量，促进人体健康。虽然双歧杆菌制品的开发层出不穷，但在众多制品中存在的最为关键的问题是 产品在贮藏和消费过程中活菌含量下降。研究发现，双歧杆菌在人体内的存活和增殖能 力对其益生作用有着重要影响，要获得所期望的治疗效果，双歧杆菌必须达到足够的数 量，以确保进入人体后有足够的活菌发挥保健功能。然而，由于双歧杆菌对营养条件要 求较高，对氧极为敏感，对低pH值的抵抗力差，导致进入市场的产品中双歧杆菌的数量 急剧下降。另外，双歧杆菌对人体产生有益效果，必须在通过胃环境后仍有大量的存活 菌到达肠道并定殖于肠粘膜上。但在胃酸和胆盐环境中，双歧杆菌菌数会很快下降，使 得最终在人体内没有足够的双歧杆菌发挥作用。因此，如何提高产品中双歧杆菌活菌数 量，确保其在人体肠道内定殖而发挥疗效已成为我们亟待解决的问题。国内研究人员针对以上实际应用问题做了大量研究，主要体现在菌种基因改 造、高密度培养、微囊技术、保护剂研究等方面。专利CN 1056877C中公开了一种双 歧杆菌微胶囊及其制造方法，CN 1063051C中公开了一种双歧杆菌复合活菌制剂，CN 1149092C中公开了一种活性双歧联菌株耐酸肠溶微囊，三项专利均采用微胶囊技术，使 双歧杆菌能够抵抗外界环境的能力增强，可以抵挡胃酸及胆盐的侵蚀，在液态或常温状 态下长时间储存，仍可有效保护其活性，但是，一般经微胶囊包埋的双歧杆菌到达肠道 后却需要六小时以上才能溶解释出，效果有限。专利CN 1116410C公开了一种高存活 性的活菌制剂及其制备方法，该专利将双歧杆菌进行液体深层高密度培养，发酵液含活菌数5X108cfU/mL，菌体采用冻干粉、微胶囊、充氮气罐装胶囊、充氮气双铝包装四重 保护措施，制成活菌制剂，使得菌体存活率显著提高，制剂保存期常温下可达两年，但 是，该制剂工艺较繁琐、费时，经高密度培养后活菌数仍较低，后期采用微胶囊技术同 样存在有益效果发挥问题。专利CN 100519738C中公开了一种双歧杆菌活菌制剂及其专 用保护剂，CN 100497594C中公开了一种高活性双歧杆菌干粉制剂的复合保护剂，两项 专利采用特制保护剂，用其制成的冻干粉剂，活菌含量均达LOXlO^cfu/g以上，同时解 决了双歧杆菌制品常温保存困难的问题，但是，双歧杆菌有效定植肠道并发挥益生效果 的有效性问题并未解决。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高活性双歧杆菌及其制备方法，解决目前双歧杆菌 制品中存在的产品在贮藏和消费过程中活菌含量下降及双歧杆菌有效定植肠道并发挥益 生效果的有效性问题。本发明的另一目的在于提供一种含双歧杆菌的组合物及其在调节肠道菌群和增 强免疫力方面的应用。本发明给出的技术解决方案是这种用于调节肠道菌群和增强免疫力的含双歧 杆菌的组合物，其特点是所述组合物由经高密度培养和双层包埋的双歧杆菌、低聚糖、 维生素、金属元素和辅料混合配制而成。 为更好的完成本发明的目的，所述含双歧杆菌的组合物的组分，按重量百分比 计，双歧杆菌为0.01 10%，低聚糖为10 50%，维生素为0.01 10%，金属元素为 0.01 10%，其余为辅料。为更好的完成本发明的目的，所述双歧杆菌至少为婴儿双岐杆菌AS 1.2202、短 双歧杆菌AS 1.2213、长双歧杆菌CICC 6186、两歧双歧杆菌CICC 6071、青春双歧杆菌 CICC 6070 中的一种。上述双歧杆菌中的婴儿双岐杆菌AS 1.2202、短双歧杆菌AS 1.2213均由中国普 通微生物菌种保藏管理中心保藏，长双歧杆菌CICC 6186、两歧双歧杆菌CICC6071、青 春双歧杆菌CICC 6070均由中国微生物菌种保藏管理委员会工业微生物菌种保藏管理中 心保藏，属于现有的双歧杆菌菌种。为更好的完成本发明的目的，所述低聚糖至少为低聚果糖、低聚半乳糖、大豆 低聚糖、低聚木糖、低聚乳果糖、低聚异麦芽糖等中的一种。为更好的完成本发明的目的，所述维生素至少为维生素A、维生素氏、B2, B6, B12,维生素C、维生素D、维生素E等中的一种。为更好的完成本发明的目的，所述金属元素至少为锌、铁、钙、镁等中的一 种。为更好的完成本发明的目的，所述辅料至少为麦芽糊精、乳糖、淀粉等中的一 种。用于本发明的双歧杆菌的制备方法如下1、高密度培养(1)菌种活化无菌条件下，挑取安瓿管中菌体接种于液体培养基和琼脂平板上，在36 38°C条件下厌氧培养24 48小时，连续活化2 3代，即得活化菌种。其中，用于本发明的双歧杆菌培养基的配制方法如下胰蛋白胨5.0g、酵母提 取物lO.Og、大豆蛋白胨5.0g、葡萄糖lO.Og、L 半胱氨酸盐酸盐0.5g、吐温801.0mL、 盐溶液40mL、加水定容至lOOOmL，调节pH6.8 7.0，121°C灭菌20min。其中盐溶液 的成分为氯化钙0.2g、磷酸二氢钾l.Og、硫酸镁0.48g、碳酸氢钠lO.Og、磷酸氢二钾 l.Og、氯化钠2.0g、加水定容至lOOOmL。 (2)种子培养将活化菌种按5% 10%的接种量接入液体培养基中，在36 38°C条件下厌氧培养20 28小时，作为种子培养物。(3)发酵培养将种子培养物按5% 10%的接种量接入液体培养基中，在 36 38 °C条件下进行发酵罐高密度培养。(4)发酵终止培养基pH和葡萄糖含量均不再降低时终止发酵，获得双歧杆菌 高密度发酵液。2、双层包埋(1)离心浓缩将双歧杆菌高密度发酵液在4°C、6000 8000r/min的条件下离 心10 20min，无菌水洗涤2 3次，取下层沉淀即为活性菌泥。(2)添加保护剂按1 4 1 10(V保护剂/V发酵液)的比例在活性菌泥中加入菌 体冷冻干燥保护剂，无菌条件下150 250r/min搅拌15 30min至均勻，制备菌悬液。其中，用于本发明的冷冻干燥保护剂的配制方法如下脱脂奶粉8 12g、蔗糖 8 12g、谷氨酸钠0.5 1.5g、山梨醇0.5 1.5g，加水定容至lOOmL，加热搅拌使其溶 解，然后115°C灭菌15min。(3)1层包埋按1 1 1 5 (Vljg包埋液/V保护剂)的比例将I层包埋液加入菌悬 液中，无菌条件下150 250r/min搅拌15 30min至均勻。其中，用于本发明的I层包埋液为蛋白质溶液，包括酪蛋白、乳白蛋白、卵白蛋 白、卵黄磷蛋白、肌蛋白、大豆分离蛋白、中草药白蛋白等中的一种或几种。(4)11层包埋按1 1 1 5 (V11层包埋液/V保护剂)的比例将II层包埋液加入上 述混合液中，无菌条件下150 250r/min搅拌15 30min至均勻。其中，用于本发明的II层包埋液为为胶质溶液，包括卡拉胶、黄原胶、瓜尔 胶、果胶、木薯淀粉、琼脂、海藻酸钠、刺槐豆胶、魔芋胶等中的一种或几种。3、冷冻干燥将经双层包埋的双歧杆菌置于_70°C冰箱中预冻2 6h后，在冷阱温 度-45 -55°C，真空度0.1 10帕下真空冷冻干燥，即得双歧杆菌菌粉。用于本发明的组合物可以制成胶囊剂、冲剂、颗粒剂、片剂等形式，应用于食 品、保健品、药品领域，具有调节肠道菌群和增强免疫力的功能。与现有技术相比，本发明的有益效果是(1)高密度培养使菌体密度较传统培养方式有显著提高，从而达到减少培养体 积，还可以缩短生产周期，最终提高特定产物的比生产速率，减少设备投资从而降低生 产成本，提高在市场上的竞争力。(2)双层包埋的外层胶体在酸性环境中不溶解，保护菌体安全通过胃部，不受胃 酸及胆盐的破坏。到达肠道后外层胶体溶解，暴露出内层蛋白质，协助菌体黏附在肠壁绒毛上而在肠道内定 殖，同时提供营养，促进菌体增殖。(3)真空冷冻干燥技术在低温、低压下进行，基本隔绝空气，有效抑制产品发生 理化性质改变，可以较好地保存活性物质，并赋予产品良好的稳定性，便于长期贮存。(4)低聚糖不易被人体胃肠道消化吸收，作为双歧杆菌的增殖因子，能有效地促 进其生长繁殖，抑制腐败菌生长。
具体实施方案下面实施例是对本发明的进一步说明，而不是限制本发明的保护范围。实施例1 双歧杆菌菌粉的制备1、高密度培养(1)菌种活化无菌条件下，挑取安瓿管中菌体接种于液体培养基和琼脂平板 上，在37°C条件下厌氧培养48小时，连续活化3代，即得活化菌种。其中，用于本发明的双歧杆菌培养基的配制方法如下胰蛋白胨5.0g、酵母提 取物lO.Og、大豆蛋白胨5.0g、葡萄糖lO.Og、L 半胱氨酸盐酸盐0.5g、吐温801.0mL、 盐溶液40mL、加水定容至lOOOmL，调节pH6.8 7.0，121°C灭菌20min。其中盐溶液 的成分为氯化钙0.2g、磷酸二氢钾l.Og、硫酸镁0.48g、碳酸氢钠lO.Og、磷酸氢二钾 l.Og、氯化钠2.0g、加水定容至1000mL。(2)种子培养将活化菌种按5%的接种量接入液体培养基中，在37°C条件下厌 氧培养24小时，作为种子培养物。(3)发酵培养将种子培养物按5%的接种量接入液体培养基中，在37°C条件下 进行发酵罐高密度培养。发酵过程主要参数控制为pH控制接种后NaOH调节培养基初始pH至7.0，发酵期间流加NaOH维持 pH>5.0 ；葡萄糖控制发酵期间监测培养基中葡萄糖浓度，流加葡萄糖维持葡萄糖含量 >4g/L0(4)发酵终止培养基pH和葡萄糖含量均不再降低时终止发酵，获得双歧杆菌 高密度发酵液。2、双层包埋(1)离心浓缩将双歧杆菌高密度发酵液在4°C、eOOOr/min的条件下离心 15min,无菌水洗涤2次，取下层沉淀即为活性菌泥。(2)添加保护剂按V保护剂/V发酵液=1 8的比例在活性菌泥中加入菌体冷冻干 燥保护剂，无菌条件下200r/min搅拌15min至均勻，制备菌悬液。其中，用于本发明的冷冻干燥保护剂的配制方法如下脱脂奶粉10g、蔗糖 log、谷氨酸钠l.Og、山梨醇l.Og，加水定容至lOOmL，加热搅拌使其溶解，然后115°C 灭菌15min。(3) I层包埋按％层包_/乂保护剂=1 2的比例将I层包埋液加入菌悬液中，无 菌条件下200r/min搅拌15min至均勻。其中，用于本发明的I层包埋液为5%的大豆分离蛋白溶液。(4)11层包埋按V11层包埋液V保护剂=1 2的比例将II层包埋液加入上述混合液中，无菌条件下200r/min搅拌15min至均勻。其中，用于本发明的II层包埋液为0.04%的κ-卡拉胶和0.06%的魔芋胶的胶体
混合溶液。3、冷冻干燥将经双层包埋的双歧杆菌置于_70°C冰箱中预冻4h后，在冷阱温度_50°C，真空
度0.1 10帕下真空冷冻干燥，即得双歧杆菌菌粉，活菌数可达1.0X lO^cfu/g以上。实施例2 组合物配方
权利要求
1.一种用于调节肠道菌群和增强免疫力的含双歧杆菌的组合物，其特征在于所述组 合物由经高密度培养和双层包埋的双歧杆菌、低聚糖、维生素、金属元素和辅料混合配 制而成。
2.根据权利要求1所述的用于调节肠道菌群和增强免疫力的含双歧杆菌的组合物，其 特征在于所述含双歧杆菌的组合物的组分，按重量百分比计双歧杆菌为0.01 10%， 低聚糖为10 50%，维生素为0.01 10%，金属元素为0.01 10%，其余为辅料。
3.根据权利要求1所述的用于调节肠道菌群和增强免疫力的含双歧杆菌的组合物，其 特征在于所述双歧杆菌至少为婴儿双岐杆菌AS 1.2202、短双歧杆菌AS 1.2213、长双歧 杆菌CICC 6186、两歧双歧杆菌CICC 6071、青春双歧杆菌CICC 6070中的一种。
4.根据权利要求1所述的用于调节肠道菌群和增强免疫力的含双歧杆菌的组合物，其 特征在于所述低聚糖至少为低聚果糖、低聚半乳糖、大豆低聚糖、低聚木糖、低聚乳果 糖、低聚异麦芽糖等中的一种。
5.根据权利要求1所述的用于调节肠道菌群和增强免疫力的含双歧杆菌的组合物，其 特征在于所述维生素至少为维生素A、维生素氏、B2, B6, B12,维生素C、维生素D、 维生素E中的一种。
6.根据权利要求1所述的用于调节肠道菌群和增强免疫力的含双歧杆菌的组合物，其 特征在于所述金属元素至少为锌、铁、钙、镁中的一种。
7.根据权利要求1所述的用于调节肠道菌群和增强免疫力的含双歧杆菌的组合物，其 特征在于所述辅料至少为麦芽糊精、乳糖、淀粉中的一种。
8.根据权利要求1所述的用于调节肠道菌群和增强免疫力的含双歧杆菌的组合物，其 特征在于所述经高密度培养和双层包埋的双歧杆菌的制备方法为A、高密度培养(1)菌种活化无菌条件下，挑取安瓿管中菌体接种于液体培养基和琼脂平板上， 在36 38°C条件下厌氧培养24 48小时，连续活化2 3代，即得活化菌种；(2)种子培养将活化菌种按5% 10%的接种量接入液体培养基中，在36 38°C 条件下厌氧培养20 28小时，作为种子培养物；(3)发酵培养将种子培养物按5% 10%的接种量接入液体培养基中，在36 38 °C条件下进行发酵罐高密度培养；(4)发酵终止培养基pH和葡萄糖含量均不再降低时终止发酵，获得双歧杆菌高密 度发酵液；B、双层包埋(1)离心浓缩将双歧杆菌高密度发酵液在4°C、6000 8000r/min的条件下离心 10 20min，无菌水洗涤2 3次，取下层沉淀即为活性菌泥；(2)添加保护剂按1 4 1 10(V保护剂/V发酵液)的比例在活性菌泥中加入菌体 冷冻干燥保护剂，无菌条件下150 250r/min搅拌15 30min至均勻，制备菌悬液；(3)1层包埋按1 1 1 5 (Vljg包埋液/V保护剂)的比例将I层包埋液加入菌悬液 中，无菌条件下150 250r/min搅拌15 30min至均勻；⑷II层包埋按1 1 1 5 (V11层包埋液/V保护剂)的比例将II层包埋液加入上述混 合液中，无菌条件下150 250r/min搅拌15 30min至均勻；C、冷冻干燥将经双层包埋的双歧杆菌置于-70 0C冰箱中预冻2 6h后，在冷阱温 度-45 -55°C，真空度0.1 10帕下真空冷冻干燥，即得双歧杆菌菌粉。
9.根据权利要求8所述的用于调节肠道菌群和增强免疫力的含双歧杆菌的组合物，其 特征在于双歧杆菌培养基的配制方法如下胰蛋白胨5.0g、酵母提取物lO.Og、大豆蛋白胨5.0g、葡萄糖lO.Og、L-半胱氨酸盐 酸盐0.5g、吐温801.0mL、盐溶液40mL、加水定容至lOOOmL，调节pH6.8_7.0，121°C灭 菌20min。其中盐溶液的成分为氯化钙0.2g、磷酸二氢钾l.Og、硫酸镁0.48g、碳酸氢 钠lO.Og、磷酸氢二钾l.Og、氯化钠2.0g、加水定容至IOOOmL0
10.根据权利要求8所述的用于调节肠道菌群和增强免疫力的含双歧杆菌的组合物， 其特征在于冷冻干燥保护剂的配制方法如下脱脂奶粉8 12g、蔗糖8 12g、谷氨酸钠0.5 1.5g、山梨醇0.5 1.5g，加水定 容至IOOmL,加热搅拌使其溶解，然后115°C灭菌15min。
11.根据权利要求8所述的用于调节肠道菌群和增强免疫力的含双歧杆菌的组合物， 其特征在于I层包埋液为蛋白质溶液，至少为酪蛋白、乳白蛋白、卵白蛋白、卵黄磷蛋 白、肌蛋白、大豆分离蛋白、中草药白蛋白中的一种。
12.根据权利要求8所述的用于调节肠道菌群和增强免疫力的含双歧杆菌的组合物， 其特征在于II层包埋液为胶质溶液，至少为κ-卡拉胶、黄原胶、瓜尔胶、果胶、木薯淀 粉、琼脂、海藻酸钠、刺槐豆胶、魔芋胶等中的一种。
13.根据权利要求1所述的用于调节肠道菌群和增强免疫力的含双歧杆菌的组合物， 其特征在于该组合物的剂型为胶囊剂或冲剂或颗粒剂或片剂。
14.权利要求1所述的用于调节肠道菌群和增强免疫力的含双歧杆菌的组合物的用 途，其特征在于作为调节肠道菌群和增强免疫力的食品或保健品或药品应用。
全文摘要
一种用于调节肠道菌群和增强免疫力的含双歧杆菌的组合物，其特点是所述组合物由经高密度培养和双层包埋的双歧杆菌、低聚糖、维生素、金属元素和辅料混合配制而成，其中该组合物的组分为双歧杆菌为0.01～10％，低聚糖为10～50％，维生素为0.01～10％，金属元素为0.01～10％，其余为辅料。本发明给出的含双歧杆菌的组合物具有调节肠道菌群和增强免疫力的功能，可以制成胶囊剂、冲剂、颗粒剂、片剂等形式，应用于食品、保健品和药品领域。
文档编号A61P37/04GK102018216SQ200910175658
公开日2011年4月20日 申请日期2009年9月19日 优先权日2009年9月19日
发明者曾星 申请人:菲伯纳生物医药有限责任公司
技术领域：
本发明涉及一种双歧杆菌制品，特别 是涉及一种用于调节肠道菌群和增强免疫 力的含双歧杆菌的组合物，属于双歧杆菌制品制备技术领域。
背景技术：
肠道微生态系统是人体最大、最复杂的微生态系统，也是人体微生态系统中最 主要和最活跃的部分。肠道菌群是肠道防御屏障的重要组成部分，平衡的肠道菌群对 人的健康十分重要。但是，由于机体衰老、环境污染、饮食改变、滥用抗生素等原因， 往往使人体肠道微生态系统受到破坏，引起肠道菌群失调，严重影响身体的免疫系统机 能，造成免疫功能低下，导致菌群易位，诱发内源感染，造成机体病变，从而引发多种 疾病，如肝硬化、胆结石、动脉硬化、冠心病、心肌梗塞、脑动脉硬化、脑中风等。双歧杆菌是1899年在法国巴斯德研究所由Tisser.H博士首次从健康的母乳哺育 婴儿的粪便中发现并分离出来的，是人体肠道内重要的生理性细菌，与人的一生始终保 持着和谐的共生关系，是健康个体肠道中的优势菌，其促进人体健康的有益作用远远超 过其它乳酸菌。基于双歧杆菌的生物化学屏障、抑制致病菌和腐败菌、提供营养、提高 免疫力功能及其临床功效的肯定，国内外研究者相继开发出多种双歧杆菌食品和微生态 药品用于保健功能和治疗各种因素引起的肠道菌群失调和免疫功能低下，通过外源方式 增加人体肠道中双歧杆菌数量，促进人体健康。虽然双歧杆菌制品的开发层出不穷，但在众多制品中存在的最为关键的问题是 产品在贮藏和消费过程中活菌含量下降。研究发现，双歧杆菌在人体内的存活和增殖能 力对其益生作用有着重要影响，要获得所期望的治疗效果，双歧杆菌必须达到足够的数 量，以确保进入人体后有足够的活菌发挥保健功能。然而，由于双歧杆菌对营养条件要 求较高，对氧极为敏感，对低pH值的抵抗力差，导致进入市场的产品中双歧杆菌的数量 急剧下降。另外，双歧杆菌对人体产生有益效果，必须在通过胃环境后仍有大量的存活 菌到达肠道并定殖于肠粘膜上。但在胃酸和胆盐环境中，双歧杆菌菌数会很快下降，使 得最终在人体内没有足够的双歧杆菌发挥作用。因此，如何提高产品中双歧杆菌活菌数 量，确保其在人体肠道内定殖而发挥疗效已成为我们亟待解决的问题。国内研究人员针对以上实际应用问题做了大量研究，主要体现在菌种基因改 造、高密度培养、微囊技术、保护剂研究等方面。专利CN 1056877C中公开了一种双 歧杆菌微胶囊及其制造方法，CN 1063051C中公开了一种双歧杆菌复合活菌制剂，CN 1149092C中公开了一种活性双歧联菌株耐酸肠溶微囊，三项专利均采用微胶囊技术，使 双歧杆菌能够抵抗外界环境的能力增强，可以抵挡胃酸及胆盐的侵蚀，在液态或常温状 态下长时间储存，仍可有效保护其活性，但是，一般经微胶囊包埋的双歧杆菌到达肠道 后却需要六小时以上才能溶解释出，效果有限。专利CN 1116410C公开了一种高存活 性的活菌制剂及其制备方法，该专利将双歧杆菌进行液体深层高密度培养，发酵液含活菌数5X108cfU/mL，菌体采用冻干粉、微胶囊、充氮气罐装胶囊、充氮气双铝包装四重 保护措施，制成活菌制剂，使得菌体存活率显著提高，制剂保存期常温下可达两年，但 是，该制剂工艺较繁琐、费时，经高密度培养后活菌数仍较低，后期采用微胶囊技术同 样存在有益效果发挥问题。专利CN 100519738C中公开了一种双歧杆菌活菌制剂及其专 用保护剂，CN 100497594C中公开了一种高活性双歧杆菌干粉制剂的复合保护剂，两项 专利采用特制保护剂，用其制成的冻干粉剂，活菌含量均达LOXlO^cfu/g以上，同时解 决了双歧杆菌制品常温保存困难的问题，但是，双歧杆菌有效定植肠道并发挥益生效果 的有效性问题并未解决。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高活性双歧杆菌及其制备方法，解决目前双歧杆菌 制品中存在的产品在贮藏和消费过程中活菌含量下降及双歧杆菌有效定植肠道并发挥益 生效果的有效性问题。本发明的另一目的在于提供一种含双歧杆菌的组合物及其在调节肠道菌群和增 强免疫力方面的应用。本发明给出的技术解决方案是这种用于调节肠道菌群和增强免疫力的含双歧 杆菌的组合物，其特点是所述组合物由经高密度培养和双层包埋的双歧杆菌、低聚糖、 维生素、金属元素和辅料混合配制而成。 为更好的完成本发明的目的，所述含双歧杆菌的组合物的组分，按重量百分比 计，双歧杆菌为0.01 10%，低聚糖为10 50%，维生素为0.01 10%，金属元素为 0.01 10%，其余为辅料。为更好的完成本发明的目的，所述双歧杆菌至少为婴儿双岐杆菌AS 1.2202、短 双歧杆菌AS 1.2213、长双歧杆菌CICC 6186、两歧双歧杆菌CICC 6071、青春双歧杆菌 CICC 6070 中的一种。上述双歧杆菌中的婴儿双岐杆菌AS 1.2202、短双歧杆菌AS 1.2213均由中国普 通微生物菌种保藏管理中心保藏，长双歧杆菌CICC 6186、两歧双歧杆菌CICC6071、青 春双歧杆菌CICC 6070均由中国微生物菌种保藏管理委员会工业微生物菌种保藏管理中 心保藏，属于现有的双歧杆菌菌种。为更好的完成本发明的目的，所述低聚糖至少为低聚果糖、低聚半乳糖、大豆 低聚糖、低聚木糖、低聚乳果糖、低聚异麦芽糖等中的一种。为更好的完成本发明的目的，所述维生素至少为维生素A、维生素氏、B2, B6, B12,维生素C、维生素D、维生素E等中的一种。为更好的完成本发明的目的，所述金属元素至少为锌、铁、钙、镁等中的一 种。为更好的完成本发明的目的，所述辅料至少为麦芽糊精、乳糖、淀粉等中的一 种。用于本发明的双歧杆菌的制备方法如下1、高密度培养(1)菌种活化无菌条件下，挑取安瓿管中菌体接种于液体培养基和琼脂平板上，在36 38°C条件下厌氧培养24 48小时，连续活化2 3代，即得活化菌种。其中，用于本发明的双歧杆菌培养基的配制方法如下胰蛋白胨5.0g、酵母提 取物lO.Og、大豆蛋白胨5.0g、葡萄糖lO.Og、L 半胱氨酸盐酸盐0.5g、吐温801.0mL、 盐溶液40mL、加水定容至lOOOmL，调节pH6.8 7.0，121°C灭菌20min。其中盐溶液 的成分为氯化钙0.2g、磷酸二氢钾l.Og、硫酸镁0.48g、碳酸氢钠lO.Og、磷酸氢二钾 l.Og、氯化钠2.0g、加水定容至lOOOmL。 (2)种子培养将活化菌种按5% 10%的接种量接入液体培养基中，在36 38°C条件下厌氧培养20 28小时，作为种子培养物。(3)发酵培养将种子培养物按5% 10%的接种量接入液体培养基中，在 36 38 °C条件下进行发酵罐高密度培养。(4)发酵终止培养基pH和葡萄糖含量均不再降低时终止发酵，获得双歧杆菌 高密度发酵液。2、双层包埋(1)离心浓缩将双歧杆菌高密度发酵液在4°C、6000 8000r/min的条件下离 心10 20min，无菌水洗涤2 3次，取下层沉淀即为活性菌泥。(2)添加保护剂按1 4 1 10(V保护剂/V发酵液)的比例在活性菌泥中加入菌 体冷冻干燥保护剂，无菌条件下150 250r/min搅拌15 30min至均勻，制备菌悬液。其中，用于本发明的冷冻干燥保护剂的配制方法如下脱脂奶粉8 12g、蔗糖 8 12g、谷氨酸钠0.5 1.5g、山梨醇0.5 1.5g，加水定容至lOOmL，加热搅拌使其溶 解，然后115°C灭菌15min。(3)1层包埋按1 1 1 5 (Vljg包埋液/V保护剂)的比例将I层包埋液加入菌悬 液中，无菌条件下150 250r/min搅拌15 30min至均勻。其中，用于本发明的I层包埋液为蛋白质溶液，包括酪蛋白、乳白蛋白、卵白蛋 白、卵黄磷蛋白、肌蛋白、大豆分离蛋白、中草药白蛋白等中的一种或几种。(4)11层包埋按1 1 1 5 (V11层包埋液/V保护剂)的比例将II层包埋液加入上 述混合液中，无菌条件下150 250r/min搅拌15 30min至均勻。其中，用于本发明的II层包埋液为为胶质溶液，包括卡拉胶、黄原胶、瓜尔 胶、果胶、木薯淀粉、琼脂、海藻酸钠、刺槐豆胶、魔芋胶等中的一种或几种。3、冷冻干燥将经双层包埋的双歧杆菌置于_70°C冰箱中预冻2 6h后，在冷阱温 度-45 -55°C，真空度0.1 10帕下真空冷冻干燥，即得双歧杆菌菌粉。用于本发明的组合物可以制成胶囊剂、冲剂、颗粒剂、片剂等形式，应用于食 品、保健品、药品领域，具有调节肠道菌群和增强免疫力的功能。与现有技术相比，本发明的有益效果是(1)高密度培养使菌体密度较传统培养方式有显著提高，从而达到减少培养体 积，还可以缩短生产周期，最终提高特定产物的比生产速率，减少设备投资从而降低生 产成本，提高在市场上的竞争力。(2)双层包埋的外层胶体在酸性环境中不溶解，保护菌体安全通过胃部，不受胃 酸及胆盐的破坏。到达肠道后外层胶体溶解，暴露出内层蛋白质，协助菌体黏附在肠壁绒毛上而在肠道内定 殖，同时提供营养，促进菌体增殖。(3)真空冷冻干燥技术在低温、低压下进行，基本隔绝空气，有效抑制产品发生 理化性质改变，可以较好地保存活性物质，并赋予产品良好的稳定性，便于长期贮存。(4)低聚糖不易被人体胃肠道消化吸收，作为双歧杆菌的增殖因子，能有效地促 进其生长繁殖，抑制腐败菌生长。
具体实施方案下面实施例是对本发明的进一步说明，而不是限制本发明的保护范围。实施例1 双歧杆菌菌粉的制备1、高密度培养(1)菌种活化无菌条件下，挑取安瓿管中菌体接种于液体培养基和琼脂平板 上，在37°C条件下厌氧培养48小时，连续活化3代，即得活化菌种。其中，用于本发明的双歧杆菌培养基的配制方法如下胰蛋白胨5.0g、酵母提 取物lO.Og、大豆蛋白胨5.0g、葡萄糖lO.Og、L 半胱氨酸盐酸盐0.5g、吐温801.0mL、 盐溶液40mL、加水定容至lOOOmL，调节pH6.8 7.0，121°C灭菌20min。其中盐溶液 的成分为氯化钙0.2g、磷酸二氢钾l.Og、硫酸镁0.48g、碳酸氢钠lO.Og、磷酸氢二钾 l.Og、氯化钠2.0g、加水定容至1000mL。(2)种子培养将活化菌种按5%的接种量接入液体培养基中，在37°C条件下厌 氧培养24小时，作为种子培养物。(3)发酵培养将种子培养物按5%的接种量接入液体培养基中，在37°C条件下 进行发酵罐高密度培养。发酵过程主要参数控制为pH控制接种后NaOH调节培养基初始pH至7.0，发酵期间流加NaOH维持 pH>5.0 ；葡萄糖控制发酵期间监测培养基中葡萄糖浓度，流加葡萄糖维持葡萄糖含量 >4g/L0(4)发酵终止培养基pH和葡萄糖含量均不再降低时终止发酵，获得双歧杆菌 高密度发酵液。2、双层包埋(1)离心浓缩将双歧杆菌高密度发酵液在4°C、eOOOr/min的条件下离心 15min,无菌水洗涤2次，取下层沉淀即为活性菌泥。(2)添加保护剂按V保护剂/V发酵液=1 8的比例在活性菌泥中加入菌体冷冻干 燥保护剂，无菌条件下200r/min搅拌15min至均勻，制备菌悬液。其中，用于本发明的冷冻干燥保护剂的配制方法如下脱脂奶粉10g、蔗糖 log、谷氨酸钠l.Og、山梨醇l.Og，加水定容至lOOmL，加热搅拌使其溶解，然后115°C 灭菌15min。(3) I层包埋按％层包_/乂保护剂=1 2的比例将I层包埋液加入菌悬液中，无 菌条件下200r/min搅拌15min至均勻。其中，用于本发明的I层包埋液为5%的大豆分离蛋白溶液。(4)11层包埋按V11层包埋液V保护剂=1 2的比例将II层包埋液加入上述混合液中，无菌条件下200r/min搅拌15min至均勻。其中，用于本发明的II层包埋液为0.04%的κ-卡拉胶和0.06%的魔芋胶的胶体
混合溶液。3、冷冻干燥将经双层包埋的双歧杆菌置于_70°C冰箱中预冻4h后，在冷阱温度_50°C，真空
度0.1 10帕下真空冷冻干燥，即得双歧杆菌菌粉，活菌数可达1.0X lO^cfu/g以上。实施例2 组合物配方
权利要求
1.一种用于调节肠道菌群和增强免疫力的含双歧杆菌的组合物，其特征在于所述组 合物由经高密度培养和双层包埋的双歧杆菌、低聚糖、维生素、金属元素和辅料混合配 制而成。
2.根据权利要求1所述的用于调节肠道菌群和增强免疫力的含双歧杆菌的组合物，其 特征在于所述含双歧杆菌的组合物的组分，按重量百分比计双歧杆菌为0.01 10%， 低聚糖为10 50%，维生素为0.01 10%，金属元素为0.01 10%，其余为辅料。
3.根据权利要求1所述的用于调节肠道菌群和增强免疫力的含双歧杆菌的组合物，其 特征在于所述双歧杆菌至少为婴儿双岐杆菌AS 1.2202、短双歧杆菌AS 1.2213、长双歧 杆菌CICC 6186、两歧双歧杆菌CICC 6071、青春双歧杆菌CICC 6070中的一种。
4.根据权利要求1所述的用于调节肠道菌群和增强免疫力的含双歧杆菌的组合物，其 特征在于所述低聚糖至少为低聚果糖、低聚半乳糖、大豆低聚糖、低聚木糖、低聚乳果 糖、低聚异麦芽糖等中的一种。
5.根据权利要求1所述的用于调节肠道菌群和增强免疫力的含双歧杆菌的组合物，其 特征在于所述维生素至少为维生素A、维生素氏、B2, B6, B12,维生素C、维生素D、 维生素E中的一种。
6.根据权利要求1所述的用于调节肠道菌群和增强免疫力的含双歧杆菌的组合物，其 特征在于所述金属元素至少为锌、铁、钙、镁中的一种。
7.根据权利要求1所述的用于调节肠道菌群和增强免疫力的含双歧杆菌的组合物，其 特征在于所述辅料至少为麦芽糊精、乳糖、淀粉中的一种。
8.根据权利要求1所述的用于调节肠道菌群和增强免疫力的含双歧杆菌的组合物，其 特征在于所述经高密度培养和双层包埋的双歧杆菌的制备方法为A、高密度培养(1)菌种活化无菌条件下，挑取安瓿管中菌体接种于液体培养基和琼脂平板上， 在36 38°C条件下厌氧培养24 48小时，连续活化2 3代，即得活化菌种；(2)种子培养将活化菌种按5% 10%的接种量接入液体培养基中，在36 38°C 条件下厌氧培养20 28小时，作为种子培养物；(3)发酵培养将种子培养物按5% 10%的接种量接入液体培养基中，在36 38 °C条件下进行发酵罐高密度培养；(4)发酵终止培养基pH和葡萄糖含量均不再降低时终止发酵，获得双歧杆菌高密 度发酵液；B、双层包埋(1)离心浓缩将双歧杆菌高密度发酵液在4°C、6000 8000r/min的条件下离心 10 20min，无菌水洗涤2 3次，取下层沉淀即为活性菌泥；(2)添加保护剂按1 4 1 10(V保护剂/V发酵液)的比例在活性菌泥中加入菌体 冷冻干燥保护剂，无菌条件下150 250r/min搅拌15 30min至均勻，制备菌悬液；(3)1层包埋按1 1 1 5 (Vljg包埋液/V保护剂)的比例将I层包埋液加入菌悬液 中，无菌条件下150 250r/min搅拌15 30min至均勻；⑷II层包埋按1 1 1 5 (V11层包埋液/V保护剂)的比例将II层包埋液加入上述混 合液中，无菌条件下150 250r/min搅拌15 30min至均勻；C、冷冻干燥将经双层包埋的双歧杆菌置于-70 0C冰箱中预冻2 6h后，在冷阱温 度-45 -55°C，真空度0.1 10帕下真空冷冻干燥，即得双歧杆菌菌粉。
9.根据权利要求8所述的用于调节肠道菌群和增强免疫力的含双歧杆菌的组合物，其 特征在于双歧杆菌培养基的配制方法如下胰蛋白胨5.0g、酵母提取物lO.Og、大豆蛋白胨5.0g、葡萄糖lO.Og、L-半胱氨酸盐 酸盐0.5g、吐温801.0mL、盐溶液40mL、加水定容至lOOOmL，调节pH6.8_7.0，121°C灭 菌20min。其中盐溶液的成分为氯化钙0.2g、磷酸二氢钾l.Og、硫酸镁0.48g、碳酸氢 钠lO.Og、磷酸氢二钾l.Og、氯化钠2.0g、加水定容至IOOOmL0
10.根据权利要求8所述的用于调节肠道菌群和增强免疫力的含双歧杆菌的组合物， 其特征在于冷冻干燥保护剂的配制方法如下脱脂奶粉8 12g、蔗糖8 12g、谷氨酸钠0.5 1.5g、山梨醇0.5 1.5g，加水定 容至IOOmL,加热搅拌使其溶解，然后115°C灭菌15min。
11.根据权利要求8所述的用于调节肠道菌群和增强免疫力的含双歧杆菌的组合物， 其特征在于I层包埋液为蛋白质溶液，至少为酪蛋白、乳白蛋白、卵白蛋白、卵黄磷蛋 白、肌蛋白、大豆分离蛋白、中草药白蛋白中的一种。
12.根据权利要求8所述的用于调节肠道菌群和增强免疫力的含双歧杆菌的组合物， 其特征在于II层包埋液为胶质溶液，至少为κ-卡拉胶、黄原胶、瓜尔胶、果胶、木薯淀 粉、琼脂、海藻酸钠、刺槐豆胶、魔芋胶等中的一种。
13.根据权利要求1所述的用于调节肠道菌群和增强免疫力的含双歧杆菌的组合物， 其特征在于该组合物的剂型为胶囊剂或冲剂或颗粒剂或片剂。
14.权利要求1所述的用于调节肠道菌群和增强免疫力的含双歧杆菌的组合物的用 途，其特征在于作为调节肠道菌群和增强免疫力的食品或保健品或药品应用。
全文摘要
一种用于调节肠道菌群和增强免疫力的含双歧杆菌的组合物，其特点是所述组合物由经高密度培养和双层包埋的双歧杆菌、低聚糖、维生素、金属元素和辅料混合配制而成，其中该组合物的组分为双歧杆菌为0.01～10％，低聚糖为10～50％，维生素为0.01～10％，金属元素为0.01～10％，其余为辅料。本发明给出的含双歧杆菌的组合物具有调节肠道菌群和增强免疫力的功能，可以制成胶囊剂、冲剂、颗粒剂、片剂等形式，应用于食品、保健品和药品领域。
文档编号A61P37/04GK102018216SQ200910175658
公开日2011年4月20日 申请日期2009年9月19日 优先权日2009年9月19日
发明者曾星 申请人:菲伯纳生物医药有限责任公司
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