乳清蛋白肽在制备增强免疫力药物、保健食品中的用途的制作方法
专利名称：乳清蛋白肽在制备增强免疫力药物、保健食品中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种乳清蛋白肽产品及其新用途，具体来说是以乳清蛋白为原料经酶 法降解生产的分子量集中在180-1000范围内的小分子生物活性肽的混合物在制备增强免 疫力药物、保健食品中的用途。属医药、食品保健领域。
背景技术：
近年来，免疫功能低下，包括原发性及继发性免疫功能缺陷、缺乏或受损，受到国 内外医学家们的广泛关注，因为它们本身及所诱发的各种并发症，特别是感染，常使病人的 病情严重，难以治疗，并可引起严重的后果，甚至危及生命。如果通过开发保健食品，来改善 机体免疫功能，经济实用，将对我国的卫生保健行业带来很大的前景。
乳清蛋白是一种混合蛋白的总称，是由乳蛋白分离除去酪蛋白后得到的乳清中所 含的蛋白质成分。乳清蛋白的功能性成分为β-乳球蛋白(β-lactoglobulin)占48%， α-乳白蛋白(a -Iactalbumin)占19 %左右，牛乳血清白蛋白(bovine serum albumin) 占5 %，免疫球蛋白占8 %，还含有乳铁蛋白(Iactoferrin)、乳过氧物酶及生长因子等多种 生物活性因子及酶等。
乳清蛋白的功能成分均可以提取出许多具有各种生理功能的活性肽段。乳清蛋白 肽是酶解乳清蛋白得到的分子量集中在180-1000范围内的小分子生物活性肽的混合物。 国内关于乳清蛋白肽的文献很少，仅查到6篇，其中，4篇为工艺方面的研究，即《乳清蛋白 肽脱苦工艺的研究》、《复合酶解法制备乳清蛋白肽工艺条件的研究》、《乳清蛋白肽苦味修 饰及其发酵饮料的研究》;2篇为降血压和抗氧化功能方面的研究，即《乳清蛋白肽对高血压 大鼠血压及血管紧张素转化酶(ACE)活性的影响》和《乳清蛋白肽的制备及羟自由基的清 除作用》。有关乳清蛋白肽免疫调节功能方面的研究，国内未见文献报道。国外虽有关于这 方面的研究较多，但主要集中于来源于α-乳白蛋白和乳铁蛋白的免疫调节肽的研究。关 于以乳清蛋白整体酶解的乳清蛋白肽在增强方面的作用国内外均未见文献报道。发明内容
本发明的目的是提供一种乳清蛋白肽产品及其在制备增强免疫力药物、保健食品 中的用途。
本发明提供的乳清蛋白肽是乳清蛋白为原料经酶法降解生产的，分子量集中在 180-1000范围内的小分子生物活性肽的混合物。
其中所述的药物、保健食品为粉剂、颗粒剂、胶囊、片剂、丸剂、口服液。 具体实施方案
下面结合具体实施方案对本发明作进一步的说明，这些实例应被理解为仅是举例 说明，而非以任何方式限制本发明的范围。
实施例乳清蛋白肽增强免疫力作用的实验研究
一、材料与方法
1.样品乳清蛋白肽是酶解乳清蛋白得到的分子量集中在180-1000范围内的小 分子生物活性肽的混合物。常温保存，供实验用。
2.实验动物由北京大学医学部实验动物中心提供的ICR健康雌性小鼠(清洁 级，合格证号=SCXK (京)2006-0008)，6 8周龄，18 22g，共200只，分为四批进行实验， 每批随机分为5组，每组10只。实验一批进行脏器/体重比值测定、迟发型变态反应实验、 抗体生成细胞数的测定和半数溶血值(HC5tl)的测定；实验二批进行ConA诱导的小鼠淋巴细 胞转化实验和NK细胞活性测定；实验三批进行碳粒廓清实验；实验四批进行小鼠腹腔巨噬 细胞吞噬鸡红细胞实验。实验动物饲养于北京大学医学部实验动物中心二级动物室。
3.剂量实验设5个组，一个阴性对照组和4个乳清蛋白肽剂量组，剂量分别为每 日 125mg/kgBW、250mg/kgBW、500mg/kgBW 和 1000mg/kgBW。受试物用水(已消毒)配制，每 日一次经口给予，每周称量体重调整灌胃量，连续灌胃30天后检测各项免疫指标。小鼠灌 胃体积为0. lmL/10g鼠重。对照组灌以与干预组等体积的蒸馏水。实验期间动物自由进食、 饮水。
4.主要仪器与试剂=Bio-Rad酶标仪(美国)，SANYO 二氧化碳培养箱(日本)， 游标卡尺；刀豆蛋白A(Con A)、MTT、SDS为Sigma产品；胎牛血清、RPMI1640细胞培养液为 Hyclone产品；SRBC由北京大学医学部实验动物中心提供；YAC-I细胞购自中国医学科学院 细胞中心；其余试剂均为分析纯。
5.实验方法
5. 1脏器体重比值的测定灌胃30天后，小鼠称重后颈椎脱臼处死，取脾脏和胸 腺，去尽筋膜，用滤纸吸干脏器表面血污，称重，计算脾脏体重比值和胸腺体重比值。
5. 2Con A诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验灌胃30天后，颈椎脱臼处死动物，无 菌取脾，磨碎，过滤QOO目)，洗涤，悬浮，制备成细胞浓度为5 X IO6脾细胞悬液。将上述脾 细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1ml，实验孔加75 μ 1 Con Α,另一孔不加Con A， 作为对照孔。置5% C02、37°C CO2培养箱中培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸弃上清 0. 7ml，加入0. 7ml不含胎牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT 50 μ 1，继续培养4h。培 养结束后，每孔加入Iml 3% SDS，吹打混勻，使紫色结晶完全溶解，于570nm波长处测定OD 值，以实验孔与对照孔OD值的差值代表淋巴细胞增殖能力。受试样品组的光密度差值显著 高于对照组的光密度差值，可判定该项实验结果阳性。
5. 3迟发型变态反应实验(DTH)灌胃30天后，以2% (v/v) SRBC免疫小鼠，4天 后，以游标卡尺测量左后足跖部厚度，然后在测量部位皮下注射20% (v/v) SRBC 20μ1，于 注射后24h测量左后足跖部厚度，以攻击前后足跖厚度的差值来表示DTH的程度。受试样 品组的差值显著高于对照组的差值，可判定该项实验结果阳性。
5. 4抗体生成细胞检测采用Jerne改良玻片法。灌胃30天后，以2% (v/v) SRBC 免疫小鼠，4天后，颈椎脱白处死动物，取脾，磨碎，过滤QOO目)，洗涤，悬浮，制备成细胞 浓度为5Χ IO6脾细胞悬液。将表层培养基(1%琼脂糖)加热溶解后，置45 50°C水浴 保温，与等量PH7. 2 7. 4、2倍浓度的Hank— s液混合，分装小管，每管0. 5ml,向管内加入 50 μ 1 10% SRBC(v/v) :25 μ 1脾细胞悬液，迅速混勻，倾倒于已刷有0. 5%琼脂糖薄层的玻 片上，凝固后将玻片扣置于片架上，置(X)2培养箱中孵育1. 5h，然后将SA缓冲液稀释的补体4(1 8)加入玻片架凹槽内，继续孵育1. ，计数溶血空斑数。以空斑数/全脾细胞表示， 受试样品组的空斑数显著高于对照组的空斑数，可判定该项实验结果阳性。
5. 5血清溶血素测定采用半数溶血值(HC5tl)法。灌胃4周后，以2% (v/v) SRBC 免疫小鼠，4天后，摘眼球取血，分离血清，用SA缓冲液稀释200倍，取稀释后血清Iml置试 管内，依次加入10% SRBC 0.5ml、l 8稀释豚鼠补体lml。另设不加血清的对照管。置 37°C恒温水浴中保温30min后，冰浴终止反应，离心，取上清1ml，加入都氏试剂:3ml，同时 取10% SRBC 0. 25ml加都氏试剂至鈿1，充分混勻，作为SRBC半数溶血管。上述各管放置 IOmin后，于540nm波长处测定OD值，溶血素的量以HC5tl表示，受试样品组的HC5tl显著高于 对照组的HC5tl，可判定该项实验结果阳性。HC5tl计算公式如下
权利要求
1.乳清蛋白肽在制备增强免疫力药物、保健食品中的用途。
2.如权利要求1，乳清蛋白肽是酶解乳清蛋白得到的分子量集中在180-1000范围内的 小分子生物活性肽的混合物。
3.如权利要求1，其中所述的药物、保健食品为粉剂、颗粒剂、胶囊、片剂、丸剂、口服液。
全文摘要
本发明涉及一种乳清蛋白肽产品及其在制备增强免疫力药物、保健食品或食品中的用途。本乳清蛋白肽是乳清蛋白为原料经酶法降解生产的，分子量集中在180-1000范围内的小分子生物活性肽的混合物。经实验证实，本乳清蛋白肽产品对ConA诱导的小鼠淋巴细胞增殖能力、迟发型变态反应(DTH)程度、抗体生成细胞功能(IgM-PFC)以及小鼠NK细胞活性均有显著提高，具有增强免疫力作用。
文档编号A61K38/02GK102028932SQ200910177408
公开日2011年4月27日 申请日期2009年9月29日 优先权日2009年9月29日
发明者李勇, 王军波 申请人:李勇, 黑龙江省索康营养科技有限公司
技术领域：
本发明涉及一种乳清蛋白肽产品及其新用途，具体来说是以乳清蛋白为原料经酶 法降解生产的分子量集中在180-1000范围内的小分子生物活性肽的混合物在制备增强免 疫力药物、保健食品中的用途。属医药、食品保健领域。
背景技术：
近年来，免疫功能低下，包括原发性及继发性免疫功能缺陷、缺乏或受损，受到国 内外医学家们的广泛关注，因为它们本身及所诱发的各种并发症，特别是感染，常使病人的 病情严重，难以治疗，并可引起严重的后果，甚至危及生命。如果通过开发保健食品，来改善 机体免疫功能，经济实用，将对我国的卫生保健行业带来很大的前景。
乳清蛋白是一种混合蛋白的总称，是由乳蛋白分离除去酪蛋白后得到的乳清中所 含的蛋白质成分。乳清蛋白的功能性成分为β-乳球蛋白(β-lactoglobulin)占48%， α-乳白蛋白(a -Iactalbumin)占19 %左右，牛乳血清白蛋白(bovine serum albumin) 占5 %，免疫球蛋白占8 %，还含有乳铁蛋白(Iactoferrin)、乳过氧物酶及生长因子等多种 生物活性因子及酶等。
乳清蛋白的功能成分均可以提取出许多具有各种生理功能的活性肽段。乳清蛋白 肽是酶解乳清蛋白得到的分子量集中在180-1000范围内的小分子生物活性肽的混合物。 国内关于乳清蛋白肽的文献很少，仅查到6篇，其中，4篇为工艺方面的研究，即《乳清蛋白 肽脱苦工艺的研究》、《复合酶解法制备乳清蛋白肽工艺条件的研究》、《乳清蛋白肽苦味修 饰及其发酵饮料的研究》;2篇为降血压和抗氧化功能方面的研究，即《乳清蛋白肽对高血压 大鼠血压及血管紧张素转化酶(ACE)活性的影响》和《乳清蛋白肽的制备及羟自由基的清 除作用》。有关乳清蛋白肽免疫调节功能方面的研究，国内未见文献报道。国外虽有关于这 方面的研究较多，但主要集中于来源于α-乳白蛋白和乳铁蛋白的免疫调节肽的研究。关 于以乳清蛋白整体酶解的乳清蛋白肽在增强方面的作用国内外均未见文献报道。发明内容
本发明的目的是提供一种乳清蛋白肽产品及其在制备增强免疫力药物、保健食品 中的用途。
本发明提供的乳清蛋白肽是乳清蛋白为原料经酶法降解生产的，分子量集中在 180-1000范围内的小分子生物活性肽的混合物。
其中所述的药物、保健食品为粉剂、颗粒剂、胶囊、片剂、丸剂、口服液。 具体实施方案
下面结合具体实施方案对本发明作进一步的说明，这些实例应被理解为仅是举例 说明，而非以任何方式限制本发明的范围。
实施例乳清蛋白肽增强免疫力作用的实验研究
一、材料与方法
1.样品乳清蛋白肽是酶解乳清蛋白得到的分子量集中在180-1000范围内的小 分子生物活性肽的混合物。常温保存，供实验用。
2.实验动物由北京大学医学部实验动物中心提供的ICR健康雌性小鼠(清洁 级，合格证号=SCXK (京)2006-0008)，6 8周龄，18 22g，共200只，分为四批进行实验， 每批随机分为5组，每组10只。实验一批进行脏器/体重比值测定、迟发型变态反应实验、 抗体生成细胞数的测定和半数溶血值(HC5tl)的测定；实验二批进行ConA诱导的小鼠淋巴细 胞转化实验和NK细胞活性测定；实验三批进行碳粒廓清实验；实验四批进行小鼠腹腔巨噬 细胞吞噬鸡红细胞实验。实验动物饲养于北京大学医学部实验动物中心二级动物室。
3.剂量实验设5个组，一个阴性对照组和4个乳清蛋白肽剂量组，剂量分别为每 日 125mg/kgBW、250mg/kgBW、500mg/kgBW 和 1000mg/kgBW。受试物用水(已消毒)配制，每 日一次经口给予，每周称量体重调整灌胃量，连续灌胃30天后检测各项免疫指标。小鼠灌 胃体积为0. lmL/10g鼠重。对照组灌以与干预组等体积的蒸馏水。实验期间动物自由进食、 饮水。
4.主要仪器与试剂=Bio-Rad酶标仪(美国)，SANYO 二氧化碳培养箱(日本)， 游标卡尺；刀豆蛋白A(Con A)、MTT、SDS为Sigma产品；胎牛血清、RPMI1640细胞培养液为 Hyclone产品；SRBC由北京大学医学部实验动物中心提供；YAC-I细胞购自中国医学科学院 细胞中心；其余试剂均为分析纯。
5.实验方法
5. 1脏器体重比值的测定灌胃30天后，小鼠称重后颈椎脱臼处死，取脾脏和胸 腺，去尽筋膜，用滤纸吸干脏器表面血污，称重，计算脾脏体重比值和胸腺体重比值。
5. 2Con A诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验灌胃30天后，颈椎脱臼处死动物，无 菌取脾，磨碎，过滤QOO目)，洗涤，悬浮，制备成细胞浓度为5 X IO6脾细胞悬液。将上述脾 细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1ml，实验孔加75 μ 1 Con Α,另一孔不加Con A， 作为对照孔。置5% C02、37°C CO2培养箱中培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸弃上清 0. 7ml，加入0. 7ml不含胎牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT 50 μ 1，继续培养4h。培 养结束后，每孔加入Iml 3% SDS，吹打混勻，使紫色结晶完全溶解，于570nm波长处测定OD 值，以实验孔与对照孔OD值的差值代表淋巴细胞增殖能力。受试样品组的光密度差值显著 高于对照组的光密度差值，可判定该项实验结果阳性。
5. 3迟发型变态反应实验(DTH)灌胃30天后，以2% (v/v) SRBC免疫小鼠，4天 后，以游标卡尺测量左后足跖部厚度，然后在测量部位皮下注射20% (v/v) SRBC 20μ1，于 注射后24h测量左后足跖部厚度，以攻击前后足跖厚度的差值来表示DTH的程度。受试样 品组的差值显著高于对照组的差值，可判定该项实验结果阳性。
5. 4抗体生成细胞检测采用Jerne改良玻片法。灌胃30天后，以2% (v/v) SRBC 免疫小鼠，4天后，颈椎脱白处死动物，取脾，磨碎，过滤QOO目)，洗涤，悬浮，制备成细胞 浓度为5Χ IO6脾细胞悬液。将表层培养基(1%琼脂糖)加热溶解后，置45 50°C水浴 保温，与等量PH7. 2 7. 4、2倍浓度的Hank— s液混合，分装小管，每管0. 5ml,向管内加入 50 μ 1 10% SRBC(v/v) :25 μ 1脾细胞悬液，迅速混勻，倾倒于已刷有0. 5%琼脂糖薄层的玻 片上，凝固后将玻片扣置于片架上，置(X)2培养箱中孵育1. 5h，然后将SA缓冲液稀释的补体4(1 8)加入玻片架凹槽内，继续孵育1. ，计数溶血空斑数。以空斑数/全脾细胞表示， 受试样品组的空斑数显著高于对照组的空斑数，可判定该项实验结果阳性。
5. 5血清溶血素测定采用半数溶血值(HC5tl)法。灌胃4周后，以2% (v/v) SRBC 免疫小鼠，4天后，摘眼球取血，分离血清，用SA缓冲液稀释200倍，取稀释后血清Iml置试 管内，依次加入10% SRBC 0.5ml、l 8稀释豚鼠补体lml。另设不加血清的对照管。置 37°C恒温水浴中保温30min后，冰浴终止反应，离心，取上清1ml，加入都氏试剂:3ml，同时 取10% SRBC 0. 25ml加都氏试剂至鈿1，充分混勻，作为SRBC半数溶血管。上述各管放置 IOmin后，于540nm波长处测定OD值，溶血素的量以HC5tl表示，受试样品组的HC5tl显著高于 对照组的HC5tl，可判定该项实验结果阳性。HC5tl计算公式如下
权利要求
1.乳清蛋白肽在制备增强免疫力药物、保健食品中的用途。
2.如权利要求1，乳清蛋白肽是酶解乳清蛋白得到的分子量集中在180-1000范围内的 小分子生物活性肽的混合物。
3.如权利要求1，其中所述的药物、保健食品为粉剂、颗粒剂、胶囊、片剂、丸剂、口服液。
全文摘要
本发明涉及一种乳清蛋白肽产品及其在制备增强免疫力药物、保健食品或食品中的用途。本乳清蛋白肽是乳清蛋白为原料经酶法降解生产的，分子量集中在180-1000范围内的小分子生物活性肽的混合物。经实验证实，本乳清蛋白肽产品对ConA诱导的小鼠淋巴细胞增殖能力、迟发型变态反应(DTH)程度、抗体生成细胞功能(IgM-PFC)以及小鼠NK细胞活性均有显著提高，具有增强免疫力作用。
文档编号A61K38/02GK102028932SQ200910177408
公开日2011年4月27日 申请日期2009年9月29日 优先权日2009年9月29日
发明者李勇, 王军波 申请人:李勇, 黑龙江省索康营养科技有限公司
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