一种异黄酮类化合物的用途的制作方法
专利名称：一种异黄酮类化合物的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及从中药中提取有效成分，经药理试验证明对病毒性心肌炎治疗有 效，更具体指从黄芪或其它中药中提取分离获得一种异黄酮类有效成分——毛蕊异黄 酮-7-氧-β-D-批喃葡萄糖苷(Calycosin 7_0_β-D-glucoside)，它可在制备抗柯萨奇病 毒及治疗柯萨奇病毒引起的疾病的药物中应用。
背景技术：
柯萨奇病毒(Coxsackievirus)可引起多种疾病，如病毒性心肌炎，流行性胸痛， 无菌性脑炎、脑膜炎，克山病及病毒性癫痫等，严重危害人类健康。目前，西医临床治疗病毒性心肌炎等柯萨奇病毒性疾病的主要方法是使用普通抗 病毒药、免疫抑制剂、干扰素及心肌细胞营养剂等，但疗效并不理想。近年来大量研究表明，中药在病毒性心肌炎等柯萨奇病毒性疾病的临床治疗中显 示出很大优势，但目前大部分中药为医生自拟的处方汤药或复方粗提药物，如生脉饮、芪冬 颐心口服液等，缺乏有效成分清楚，作用机理明确，疗效肯定，剂型先进，服用携带方便的中 药制剂。中药黄芪补气固表，利尿托毒。从黄芪中提取的黄芪皂苷等成分有多种药理活 性。《第二军医大学学报，1999，20(9) :666-668》报道了黄芪皂苷对柯萨奇B3病毒性心 肌炎小鼠具有良好的治疗效果；《中国中药杂志，2001，26 (12) :850-853》报道，黄芪甲苷 能对抗组胺引起的脑微血管通透性增加；《中国药理学通报，2003，19(8) 892-895))报 道，黄芪总苷对体外激活肝星状细胞的增殖和产生胶原有明显抑制作用，这可能是其抗 肝纤维化的机制之一；《天然产物研究与开发，1994，6 (2) 1-5》报道，黄芪甲苷和毛蕊异 黄酮对孵化红细胞的饿变形能力有改善作用，这可能是黄芪改善血液流变学指标的重要 机理；专利CN01126608. 2公开了毛蕊异黄酮及其糖甙具有良好的抗心肌缺血作用；专利 CN00119451. 8公开了黄芪甲苷在治疗病毒性心肌炎药物中的应用；专利CN01126609. 0公 开了黄芪甲苷具有抗心肌纤维化作用。未见毛蕊异黄酮-7-氧- β -D-吡喃葡萄糖苷抗柯 萨奇病毒(Coxsackie Virus)及治疗病毒性心肌炎的报道。
发明内容
本发明目的是克服常规多味汤药存在的不足之处，采用化学方法从黄芪或其它中 药中分离出异黄酮类有效成分一毛蕊异黄酮-7-氧_ β -D-吡喃葡萄糖苷，经药理试验，使 该化合物在制备抗柯萨奇病毒和治疗病毒性心肌炎的药物中应用。本发明药物可通过以下方法制备黄芪或其它中药材粉碎后，以70%乙醇回流提 取三次(2小时，1小时，1小时)，过滤，合并滤液，减压回收溶剂，浓缩至无醇味，得黄芪醇提
3浸膏I。浸膏I加水混溶过滤，滤液用大孔树脂吸附，用水洗脱杂质，再用70%乙醇洗脱，洗 脱液减压浓缩得浸膏II。浸膏II再用硅胶柱层析分离，以氯仿_甲醇梯度洗脱，合并相同 流分，蒸干，甲醇热溶，静置，有白色絮状物析出，抽滤，得白色粉末状结晶，即得本发明化合 物毛蕊异黄酮-7-氧-β -D-吡喃葡萄糖苷(Calycosin 7-0- β -D-glucoside)。结构式如下它的分子式为C22H22Oltl，分子量为446，化学名为3'-羟基_4'-甲氧基异黄 酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷。本发明采用上述方法提取获得的毛蕊异黄酮-7-氧-β -D-吡喃葡萄糖苷首先进 行药效试验。在原代培养的心肌细胞上进行的体外抗病毒试验结果表明，本发明药物的TC5tl为 177. 84ug/ml，对CVB3病毒的IC5tl为17. 78ug/ml，治疗指数(Tl)为10. 00，表明本发明药物 体外对CVB3病毒有显著抑制作用。在Balb/c小鼠上用腹腔接种柯萨奇B3病毒的方法建立病毒性心肌炎模型，给药 高低剂量组分别灌胃给予本发明药物溶液40mg/kg和20mg/kg，模型对照组和正常对照组 灌胃给等量生理盐水，连续给药12天，观察到第15天，观察小鼠毛色、进食、死亡等各种情 况，结果两个剂量组均能显著降低由柯萨奇B3病毒引起的病毒性心肌炎小鼠的死亡率，显 著降低病毒性心肌炎小鼠的心指数，有效降低由柯萨奇B3病毒引起的病毒性心肌炎小鼠 血清中LDH和GOT的含量升高。注试验方法参考《现代药理实验方法》(下册，P1425，张均田主编，北京医科大学中 国协和医科大学联合出版社，1998年版)。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步阐述，但不对其有任何限制。实施例1.本发明药物的制备取黄芪药材，粉碎，以70%乙醇回流提取三次(2小时，1小时，1小时)，过滤，合并
滤液，减压回收溶剂，浓缩至无醇味，得黄芪醇提浸膏I。浸膏I加水混溶过滤，滤液用大孔 树脂(AB-SS)吸附，用水洗脱杂质，再用70%乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩得浸膏II。浸膏 II用200-300目硅胶柱层析，以氯仿-甲醇梯度洗脱，TLC检测，10%硫酸-乙醇显色，合并 相同流分，蒸干，甲醇热溶，静置，有白色絮状物析出，抽滤，得白色粉末状结晶，即得本发明 化合物。实施例2 本发明药物对柯萨奇B3病毒(CVB3)感染心肌细胞的影响试验(体外)
细胞毒性试验取SD大鼠新生1-3天的乳鼠15只，取出心脏，做心肌细胞原代培养，所得细胞悬 液在24孔培养板中培养24小时待其贴壁，24小时后弃去培养液。分组如下正常对照组每孔加入培养液1. Oml ；给药组加入梯度稀释的本发明药物溶液1. OmL/孔，每个稀释度四个复孔。在倒置相差显微镜下观察细胞生存情况，按照Reed-Muench法计算本发明药物对 原代培养心肌细胞的TC5Q。抗柯萨奇B3病毒试验取SD大鼠新生1-3天的乳鼠15只，取出心脏，做心肌细胞原代培养，所得细胞悬 液在24孔培养板中培养24小时待其贴壁，24小时后弃去培养液。分组如下正常对照组每孔加入培养液1. Oml ；病毒对照组每孔加入0. 2ml CVB3病毒液(TCID50 = 10_4.56，10_5稀释)，孵育1小 时，弃去上清，用PBS溶液清晰三次，加入培养液1. Oml培养；给药组每孔加入0. 2ml CVB3病毒液(TCID50 = 10_4.56，10_5稀释)，孵育1小时， 弃去上清，用PBS溶液清洗三次，加入梯度稀释的本发明药物溶液1. OmL/孔，每个稀释度四 个复孔。培养48小时后在倒置相差显微镜下观察。心肌细胞在培养中会慢慢死亡，伪足断 裂，细胞皱缩、变圆，折光度提高。被病毒感染后细胞死亡明显增多，且可看到大面积坏死 灶。给药后如药物有效，就可以降低被病毒感染细胞的死亡率。按照Reed-Muench法计算 本发明药物对原代培养心肌细胞的IC5(I。结果本发明药物的TC5tl为177.84ug/ml，对CVB3病毒IC5tl为17. 78ug/ml，治疗指 数(Tl)为10. 00，表明本发明药物体外对CVB3病毒有显著抑制作用。实施例3 本发明药物对病毒性心肌炎小鼠死亡率的影响试验(体内)将本发明药物分成两个剂量组，Balb/c小鼠随机分为4组正常对照组腹腔接种0. Iml生理盐水，每日给等量生理盐水；病毒对照组每只腹腔接种0. ImlCVB3病毒液(TCID5tl = 10_4 56，10_5稀释)，然后 每日给等量生理盐水；本发明药物组I-高剂量同上法接种CVB3病毒液，同日灌胃本发明药物溶液 40mg/kg · d，连续给药12天;本发明药物组II-低剂量同第3组方法，灌胃本发明药物溶液，剂量为20mg/ kg · d，连续给药12天；观察15天，观察小鼠毛色、进食等各种情况，统计各组小鼠的死亡率。结果本发明药物两个剂量组均能显著降低由柯萨奇B3病毒引起的病毒性心肌炎 小鼠的死亡率，见表1。表1本发明药物对病毒性心肌炎小鼠发病率和死亡率的影响
权利要求
一种黄芪提取物的用途，在制备治疗柯萨奇病毒引起的疾病的药物中的应用，所述黄芪提取物采用如下方法制备取黄芪药材，粉碎，以70％乙醇回流提取三次，分别为2小时、1小时、1小时；过滤，合并滤液，减压回收溶剂，浓缩至无醇味，得黄芪醇提浸膏I；浸膏I加水混溶过滤，滤液用大孔树脂AB 8型吸附，用水洗脱杂质，再用70％乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩得浸膏II；浸膏II 再用200 300目硅胶柱层析分离，以氯仿 甲醇梯度洗脱，TLC检测，10％硫酸 乙醇显色，合并相同流分，蒸干，甲醇热溶，静置，有白色絮状物析出，抽滤，得白色粉末状结晶，即所述黄芪提取物。
2.根据权利要求1所述的黄芪提取物的用途，其特征在于，在制备治疗由柯萨奇病毒 引起的包括病毒性心肌炎，流行性胸痛，无菌性脑炎、脑膜炎，克山病及病毒性癫痫等疾病 的药物中的应用。
3.根据权利要求1所述的黄芪提取物的用途，其特征在于，在制备治疗病毒性心肌炎 药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种黄芪提取物的药学用途，经药理试验证明该提取物具有抑制柯萨奇病毒(Coxsackievirus)及治疗病毒性心肌炎，可在制备抗柯萨奇病毒及治疗病毒性心肌炎药物中应用。
文档编号A61P31/14GK101940584SQ20091017935
公开日2011年1月12日 申请日期2005年11月23日 优先权日2005年11月23日
发明者叶冠, 唐意红, 孙兆林, 张媛媛, 朱海燕, 李志雄, 范明松, 马春辉, 黄成钢 申请人:中国科学院上海药物研究所
技术领域：
本发明涉及从中药中提取有效成分，经药理试验证明对病毒性心肌炎治疗有 效，更具体指从黄芪或其它中药中提取分离获得一种异黄酮类有效成分——毛蕊异黄 酮-7-氧-β-D-批喃葡萄糖苷(Calycosin 7_0_β-D-glucoside)，它可在制备抗柯萨奇病 毒及治疗柯萨奇病毒引起的疾病的药物中应用。
背景技术：
柯萨奇病毒(Coxsackievirus)可引起多种疾病，如病毒性心肌炎，流行性胸痛， 无菌性脑炎、脑膜炎，克山病及病毒性癫痫等，严重危害人类健康。目前，西医临床治疗病毒性心肌炎等柯萨奇病毒性疾病的主要方法是使用普通抗 病毒药、免疫抑制剂、干扰素及心肌细胞营养剂等，但疗效并不理想。近年来大量研究表明，中药在病毒性心肌炎等柯萨奇病毒性疾病的临床治疗中显 示出很大优势，但目前大部分中药为医生自拟的处方汤药或复方粗提药物，如生脉饮、芪冬 颐心口服液等，缺乏有效成分清楚，作用机理明确，疗效肯定，剂型先进，服用携带方便的中 药制剂。中药黄芪补气固表，利尿托毒。从黄芪中提取的黄芪皂苷等成分有多种药理活 性。《第二军医大学学报，1999，20(9) :666-668》报道了黄芪皂苷对柯萨奇B3病毒性心 肌炎小鼠具有良好的治疗效果；《中国中药杂志，2001，26 (12) :850-853》报道，黄芪甲苷 能对抗组胺引起的脑微血管通透性增加；《中国药理学通报，2003，19(8) 892-895))报 道，黄芪总苷对体外激活肝星状细胞的增殖和产生胶原有明显抑制作用，这可能是其抗 肝纤维化的机制之一；《天然产物研究与开发，1994，6 (2) 1-5》报道，黄芪甲苷和毛蕊异 黄酮对孵化红细胞的饿变形能力有改善作用，这可能是黄芪改善血液流变学指标的重要 机理；专利CN01126608. 2公开了毛蕊异黄酮及其糖甙具有良好的抗心肌缺血作用；专利 CN00119451. 8公开了黄芪甲苷在治疗病毒性心肌炎药物中的应用；专利CN01126609. 0公 开了黄芪甲苷具有抗心肌纤维化作用。未见毛蕊异黄酮-7-氧- β -D-吡喃葡萄糖苷抗柯 萨奇病毒(Coxsackie Virus)及治疗病毒性心肌炎的报道。
发明内容
本发明目的是克服常规多味汤药存在的不足之处，采用化学方法从黄芪或其它中 药中分离出异黄酮类有效成分一毛蕊异黄酮-7-氧_ β -D-吡喃葡萄糖苷，经药理试验，使 该化合物在制备抗柯萨奇病毒和治疗病毒性心肌炎的药物中应用。本发明药物可通过以下方法制备黄芪或其它中药材粉碎后，以70%乙醇回流提 取三次(2小时，1小时，1小时)，过滤，合并滤液，减压回收溶剂，浓缩至无醇味，得黄芪醇提
3浸膏I。浸膏I加水混溶过滤，滤液用大孔树脂吸附，用水洗脱杂质，再用70%乙醇洗脱，洗 脱液减压浓缩得浸膏II。浸膏II再用硅胶柱层析分离，以氯仿_甲醇梯度洗脱，合并相同 流分，蒸干，甲醇热溶，静置，有白色絮状物析出，抽滤，得白色粉末状结晶，即得本发明化合 物毛蕊异黄酮-7-氧-β -D-吡喃葡萄糖苷(Calycosin 7-0- β -D-glucoside)。结构式如下它的分子式为C22H22Oltl，分子量为446，化学名为3'-羟基_4'-甲氧基异黄 酮-7-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷。本发明采用上述方法提取获得的毛蕊异黄酮-7-氧-β -D-吡喃葡萄糖苷首先进 行药效试验。在原代培养的心肌细胞上进行的体外抗病毒试验结果表明，本发明药物的TC5tl为 177. 84ug/ml，对CVB3病毒的IC5tl为17. 78ug/ml，治疗指数(Tl)为10. 00，表明本发明药物 体外对CVB3病毒有显著抑制作用。在Balb/c小鼠上用腹腔接种柯萨奇B3病毒的方法建立病毒性心肌炎模型，给药 高低剂量组分别灌胃给予本发明药物溶液40mg/kg和20mg/kg，模型对照组和正常对照组 灌胃给等量生理盐水，连续给药12天，观察到第15天，观察小鼠毛色、进食、死亡等各种情 况，结果两个剂量组均能显著降低由柯萨奇B3病毒引起的病毒性心肌炎小鼠的死亡率，显 著降低病毒性心肌炎小鼠的心指数，有效降低由柯萨奇B3病毒引起的病毒性心肌炎小鼠 血清中LDH和GOT的含量升高。注试验方法参考《现代药理实验方法》(下册，P1425，张均田主编，北京医科大学中 国协和医科大学联合出版社，1998年版)。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步阐述，但不对其有任何限制。实施例1.本发明药物的制备取黄芪药材，粉碎，以70%乙醇回流提取三次(2小时，1小时，1小时)，过滤，合并
滤液，减压回收溶剂，浓缩至无醇味，得黄芪醇提浸膏I。浸膏I加水混溶过滤，滤液用大孔 树脂(AB-SS)吸附，用水洗脱杂质，再用70%乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩得浸膏II。浸膏 II用200-300目硅胶柱层析，以氯仿-甲醇梯度洗脱，TLC检测，10%硫酸-乙醇显色，合并 相同流分，蒸干，甲醇热溶，静置，有白色絮状物析出，抽滤，得白色粉末状结晶，即得本发明 化合物。实施例2 本发明药物对柯萨奇B3病毒(CVB3)感染心肌细胞的影响试验(体外)
细胞毒性试验取SD大鼠新生1-3天的乳鼠15只，取出心脏，做心肌细胞原代培养，所得细胞悬 液在24孔培养板中培养24小时待其贴壁，24小时后弃去培养液。分组如下正常对照组每孔加入培养液1. Oml ；给药组加入梯度稀释的本发明药物溶液1. OmL/孔，每个稀释度四个复孔。在倒置相差显微镜下观察细胞生存情况，按照Reed-Muench法计算本发明药物对 原代培养心肌细胞的TC5Q。抗柯萨奇B3病毒试验取SD大鼠新生1-3天的乳鼠15只，取出心脏，做心肌细胞原代培养，所得细胞悬 液在24孔培养板中培养24小时待其贴壁，24小时后弃去培养液。分组如下正常对照组每孔加入培养液1. Oml ；病毒对照组每孔加入0. 2ml CVB3病毒液(TCID50 = 10_4.56，10_5稀释)，孵育1小 时，弃去上清，用PBS溶液清晰三次，加入培养液1. Oml培养；给药组每孔加入0. 2ml CVB3病毒液(TCID50 = 10_4.56，10_5稀释)，孵育1小时， 弃去上清，用PBS溶液清洗三次，加入梯度稀释的本发明药物溶液1. OmL/孔，每个稀释度四 个复孔。培养48小时后在倒置相差显微镜下观察。心肌细胞在培养中会慢慢死亡，伪足断 裂，细胞皱缩、变圆，折光度提高。被病毒感染后细胞死亡明显增多，且可看到大面积坏死 灶。给药后如药物有效，就可以降低被病毒感染细胞的死亡率。按照Reed-Muench法计算 本发明药物对原代培养心肌细胞的IC5(I。结果本发明药物的TC5tl为177.84ug/ml，对CVB3病毒IC5tl为17. 78ug/ml，治疗指 数(Tl)为10. 00，表明本发明药物体外对CVB3病毒有显著抑制作用。实施例3 本发明药物对病毒性心肌炎小鼠死亡率的影响试验(体内)将本发明药物分成两个剂量组，Balb/c小鼠随机分为4组正常对照组腹腔接种0. Iml生理盐水，每日给等量生理盐水；病毒对照组每只腹腔接种0. ImlCVB3病毒液(TCID5tl = 10_4 56，10_5稀释)，然后 每日给等量生理盐水；本发明药物组I-高剂量同上法接种CVB3病毒液，同日灌胃本发明药物溶液 40mg/kg · d，连续给药12天;本发明药物组II-低剂量同第3组方法，灌胃本发明药物溶液，剂量为20mg/ kg · d，连续给药12天；观察15天，观察小鼠毛色、进食等各种情况，统计各组小鼠的死亡率。结果本发明药物两个剂量组均能显著降低由柯萨奇B3病毒引起的病毒性心肌炎 小鼠的死亡率，见表1。表1本发明药物对病毒性心肌炎小鼠发病率和死亡率的影响
权利要求
一种黄芪提取物的用途，在制备治疗柯萨奇病毒引起的疾病的药物中的应用，所述黄芪提取物采用如下方法制备取黄芪药材，粉碎，以70％乙醇回流提取三次，分别为2小时、1小时、1小时；过滤，合并滤液，减压回收溶剂，浓缩至无醇味，得黄芪醇提浸膏I；浸膏I加水混溶过滤，滤液用大孔树脂AB 8型吸附，用水洗脱杂质，再用70％乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩得浸膏II；浸膏II 再用200 300目硅胶柱层析分离，以氯仿 甲醇梯度洗脱，TLC检测，10％硫酸 乙醇显色，合并相同流分，蒸干，甲醇热溶，静置，有白色絮状物析出，抽滤，得白色粉末状结晶，即所述黄芪提取物。
2.根据权利要求1所述的黄芪提取物的用途，其特征在于，在制备治疗由柯萨奇病毒 引起的包括病毒性心肌炎，流行性胸痛，无菌性脑炎、脑膜炎，克山病及病毒性癫痫等疾病 的药物中的应用。
3.根据权利要求1所述的黄芪提取物的用途，其特征在于，在制备治疗病毒性心肌炎 药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种黄芪提取物的药学用途，经药理试验证明该提取物具有抑制柯萨奇病毒(Coxsackievirus)及治疗病毒性心肌炎，可在制备抗柯萨奇病毒及治疗病毒性心肌炎药物中应用。
文档编号A61P31/14GK101940584SQ20091017935
公开日2011年1月12日 申请日期2005年11月23日 优先权日2005年11月23日
发明者叶冠, 唐意红, 孙兆林, 张媛媛, 朱海燕, 李志雄, 范明松, 马春辉, 黄成钢 申请人:中国科学院上海药物研究所
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