槐杞黄颗粒复方制剂在治疗肾病中的应用的制作方法
专利名称：槐杞黄颗粒复方制剂在治疗肾病中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种中药复方，具体涉及槐杞黄颗粒复方制剂，特别涉及槐杞黄颗粒复方制剂在治疗肾病中的应用。
背景技术：
肾病严重的危害人类的生命健康，每年有数千万的病人死于肾脏疾病，其中原发性肾病综合征是儿科常见的泌尿系统疾病，临床主要表现为蛋白尿、低蛋白血症、高脂血症和不同程度的水肿，每年因原发性肾病综合征而死亡的儿童呈上升趋势，目前治疗原发性肾病综合征主要以肾上腺糖皮质激素为基础药物，且治疗周期长，长期使用该类药物会引起机体免疫功能的低下，从而影响疾病的治疗，且长期使用糖皮质激素药物会带来很多不良反应。临床及动物实验研究显示，原发性肾病综合征的发病机制与机体免疫功能紊乱相关，同时，肾小球肾炎也是危害人类生命健康的主要疾病，每年因肾小球肾炎疾病死亡的人数逐年升高，目前治疗肾小球肾炎主要以化学药为主，但长期使用化学药会产生多种不良反应，且有些药物通过肾脏排泄对肾脏产生严重的毒副作用。槐杞黄颗粒复方制剂由槐耳菌质、枸杞子和黄精三味药组成，具有补益精气、滋补润养心肺和强壮筋骨之功效，临床上主要应用于治疗呼吸道感染疾病。
发明内容
发明目的本发明的目的是为了充分利用中药资源，在原有槐杞黄颗粒复方制剂的基础上，开发其新的临床用途，提供槐杞黄颗粒复方制剂在治疗肾脏疾病中的应用。
技术方案为实现以上目的，本发明提供的槐杞黄颗粒复方制剂由下列重量百分比的原料药制成槐耳菌质36-50％、枸杞子20-35％、黄精15-30％。
作为优选方案，本发明提供的槐杞黄颗粒复方制剂由下列重量百分比的原料药制成槐耳菌质40-50％、枸杞子25-35％、黄精20-30％。
作为另一优选方案本发明提供的槐杞黄颗粒复方制剂由下列重量百分比的原料药制成槐耳46％、枸杞子30％、黄精24％。
本发明提供的槐杞黄颗粒复方制剂做成制剂时将各原料药提取后得到的提取物和药学上可接受的载体制备成口服液、颗粒剂、胶囊剂、片剂、粉针剂或注射液剂型的药物。
将本发明提供的槐杞黄颗粒复方制剂制成口服液时，将各原料的提取物加蒸馏水溶解，过滤，加入糖浆，调节pH，制成口服液。
将本发明提供的槐杞黄颗粒复方制剂制成片剂时，把各原料和乳糖或玉米淀粉，需要时加入润滑剂硬脂酸镁，混合均匀，然后压片制成片剂。
本发明提供的槐杞黄颗粒复方制剂制成胶囊剂时把各原料的提取物和载体乳糖或玉米淀粉混合均匀，整粒，然后装胶囊制成胶囊剂。
本发明提供的槐杞黄颗粒复方制剂制成颗粒剂时，把各原料的提取物和稀释剂乳糖或玉米淀粉混合均匀，整粒，干燥，制成颗粒剂。
本发明提供的槐杞黄颗粒复方制剂制成注射液时，取各原料的提取物加入生理盐水溶解然后加入活性碳，搅拌均匀，80℃加热30分钟，过滤，调节pH值，用垂熔玻璃漏斗或其它滤器过滤至澄明，灌装，在100至115℃灭菌30分钟制成注射液。
以上提供的槐杞黄颗粒复方制剂在治疗肾脏疾病中的应用，也可以用于治疗原发性肾病综合症药物中的应用，并且槐杞黄颗粒复方制剂也可以在治疗肾小球肾炎药物中的应用。
本发明提供的槐杞黄颗粒复方制剂，根据中医药理论，采用辨证论治的理论制定成本方，经药理学研究显示，方中槐耳富含槐耳菌质多糖，为活性很高的生物反应调节剂，能激发机体免疫系统的诸多环节，从而提高机体的免疫力，枸杞具有滋补作用、归肾经、能改善肾脏的生理功能，黄精具有滋阴作用，研究显示也具有补肾的作用。
有益效果本发明在原有复方槐杞黄颗粒复方制剂的基础上进行新的用途开发，实验表明该中药复方制剂具有很好的治疗肾病的作用，尤其对原发性肾病综合症具有很好的治疗作用，并且该中药复方制剂对肾小球肾炎也有很好的治疗作用，且不良反应小，有望开发成为新一代的治疗肾病的药物，同时本发明涉及的三味中药原料均为常用中药，原药材易得。
具体实施例方式 根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比及其实验结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1槐杞黄颗粒复方制剂对原发性肾病综合征的药理作用。
1、实验材料 雄性清洁级SD系大鼠30只，体重160～180g，购自上海斯莱克动物中心。阿霉素(美国楷莱)、地塞米松注射液由南京儿童医院提供，槐杞黄颗粒复方制剂由江苏启东盖天力药业有限公司提供，ED-1单克隆抗体购自英国serotec公司，FITC标记的羊抗小鼠IgG购自北京中山生物技术公司。TNF-α和IL-1βELISA试剂盒分别购自晶美生物工程有限公司和美国invitrogen公司。
2、阿霉素肾病模型的构造及实验分组 SD大鼠适应性喂养1周，随机分为5组每组6只大鼠①阿霉素肾病组阿霉素5mg/kg，尾静脉单次注射；②正常对照组注射相等容量生理盐水；③槐杞黄颗粒复方制剂(批号01至03)治疗组尾静脉单次注射阿霉素5mg/kg，次日起予槐杞黄颗粒复方制剂2mg/kg灌胃，1次/d；④地塞米松治疗组尾静脉单次注射阿霉素5mg/kg，次日起予地塞米松0.2mg/kg腹腔注射，1次/d；⑤联合治疗组注射阿霉素后，次日起同时给予槐杞黄颗粒复方制剂及地塞米松治疗，2mg/kg、灌胃，1次/d。造模期间所有大鼠均自由饮水和进食，造模后第十五天，大鼠腹腔注射20％乌拉坦，5mg/kg；麻醉成功后经心脏取血分离血清，并留取双侧肾组织行病理组织学等检查。
3、实验观察指标 3.1一般情况及给药后24小时尿蛋白含量的测定 造模期间观察各组小鼠的饮食饮水量、体重改变、毛发、精神活动等一般情况。同时予造模前及开始后第7、14天将大鼠置于代谢笼中，收集24小时尿液，采用考马斯亮蓝法检测尿蛋白含量。
3.2肾脏病理组织学检查 光镜所有标本于4％多聚甲醛固定、石蜡包埋、切片(3μm)，分别行苏木素-伊红(HE)和希夫氏(PAS)染色，光镜下观察肾组织。
电镜戊二醛固定后，常规制作标本，用透射电镜观察肾组织。
3.3免疫荧光检测 肾组织冰冻切片(5μm)于丙酮固定10min，PBS漂洗。加入ED-1单克隆抗体(1∶100)，37℃孵育1h，PBS漂洗后加入FITC标记二抗(1∶30)，37℃孵育45min，再用PBS漂洗后甘油封片，荧光显微镜下观察。PBS液代替一抗做空白对照。
3.4血清TNF-α、IL-1β的含量测定 取大鼠新鲜血液，于4℃静置8h，在4℃下、3000r/min离心10min分离血清。按照ELISA试剂盒说明，采用双抗体夹心法测定血清中细胞因子TNF-α和IL-1β的含量。
3.5实验结果 3.5.1造模第二天开始，大鼠出现不同程度的腹泻、饮食和饮水量减少、毛发蓬松，尤以模型组显著。正常对照组未出现明显不适。如表一所示，阿霉素模型组于造模结束后体重明显减轻，槐杞黄颗粒复方制剂组则部分缓解阿霉素造成的体重减轻，并显著改善大鼠的一般情况。
表一各组别大鼠给药后体重变化情况 3.5.2各组大鼠于造模前尿蛋白均低于15mg/24h，各组间无显著差异。造模后第7天，阿霉鼠尿蛋白则于7天后开始下降，第14天与阿霉素肾病模型组相比具有显著差异(P＜0.05)，具体实验结果如表二所示。
表二各组别大鼠给药后尿蛋白含量测定结果 3.5.3光镜结果显示阿霉素模型组的大鼠部分肾小球体积增大，系膜细胞及基质局灶节段性轻度增多；槐杞黄颗粒复方制剂治疗组、联合治疗组的肾小球较正常对照组无明显改变。
电镜结果示阿霉素模型组大鼠肾小球基底膜偶见增厚，肾小球脏层上皮细胞(即足细胞)足突广泛融合、部分足突消失；槐杞黄颗粒复方制剂治疗组、地塞米松治疗组和联合治疗组的基底膜平滑，足细胞损伤则较模型组明显缓解。
3.5.4槐杞黄颗粒复方制剂对肾小管间质损伤的影响 阿霉素模型组的大鼠的肾小管上皮细胞出现灶性颗粒样、空泡样变性，部分管腔可见蛋白管型；间质呈灶性炎性细胞浸润并伴少量纤维组织增生。槐杞黄颗粒复方制剂治疗组、地塞米松治疗组和联合治疗组的肾间质炎性细胞浸润面积及范围则均较阿霉素模型组明显减少。
3.5.5免疫荧光结果显示，阿霉素模型组可显著诱导肾间质单核、巨噬细胞活化、浸润；槐杞黄颗粒复方制剂治疗组能够显著的抑制阿霉素所诱导的肾间质单核、巨噬细胞活化和浸润。
3.5.6对血清细胞因子TNF-α和IL-1β的影响 实验结果显示阿霉素模型组能显著上调大鼠血清中细胞因子TNF-α和IL-1β表达，和正常组比较具有统计学意义(P＜0.05)。给予槐杞黄颗粒复方制剂、地塞米松或联合治疗后，大鼠血清中TNF-α、IL-1β的上调明显受到抑制和正常组比较无有统计学意义(P＞0.05)。
以上实验结果均显示本发明提供的槐杞黄颗粒复方制剂能显著改善阿霉素诱导的原发性肾病综合征，能显著降低阿霉素肾病尿蛋白的排泄，保护肾小球足细胞，缓解肾小管间质损伤，调节机体免疫紊乱，实验结果显示槐杞黄颗粒复方制剂对肾脏具有很好的保护作用，能增强机体的免疫功能，其药理活性和地塞米松相近，且不良反应较地塞米松低，有望开发成为新一代治疗肾病的药物，并且通过药理实验得出槐杞黄颗粒复方制剂和地塞米松联合治疗的效果也很好，不良反应也降低，因此本发明提供的槐杞黄颗粒复方制剂和地塞米松的混合制剂也可以开发成为新一代治疗原发性肾病综合征的药物。
实施例2槐杞黄颗粒复方制剂对肾小球肾炎的药理作用。
1、实验材料 健康雄性SD大鼠24只，4周龄，体重160g左右，购自江苏省实验动物中心；槐杞黄颗粒复方制剂由江苏启东盖天力药业有限公司提供；完全弗氏佐剂、FITC标记的羊抗兔IgG及Schiff试剂购自美国Sigma公司，转化生长因子(TGF-β1)多克隆抗体购自美国Sant Cruz公司，增殖细胞核抗原(PCNA)单克隆抗体和单核细胞趋化因子-1(MCP-1)单克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG、正常山羊血清封闭液、DAB显色剂购自北京中山生物技术公司。
2、实验方法和实验分组 2.1抗大鼠胸腺细胞抗血清(ATS)的制备取4周龄SD大鼠，剥取其胸腺并制备成一定浓度的单胸腺细胞悬液，与完全弗氏佐剂等体积混匀后，按5×107细胞皮下多点注射给免疫新西兰大白兔，其后每隔2周按1×107胸腺细胞经耳缘静脉注射加强免疫3次。7周后颈动脉取血并分离血清，大鼠胸腺细胞涂片及大鼠肾组织冰冻切片测定ATS效价，间接免疫荧光法测抗体效价达1∶1280。
2.2大鼠抗Thy1.1系膜增生性肾小球肾炎模型的制备及实验分组大鼠抗Thy-1.1的抗体肾炎(anti-thy-1.1 antibody induced glomerulonephritis)模型是一种经典的系膜增生性肾小球肾炎模型。取SD大鼠24只，随机分为4组，每组6只，对照组经尾静脉一次性注射10ml/kg的正常兔血清，模型组、槐杞黄颗粒复方制剂治疗组经尾静脉一次性注射10ml/kg的ATS。从注射ATS当天起，槐杞黄颗粒复方制剂治疗组每天灌服中药复方制剂2mg/kg，1次/d；对照组和模型组分别灌服等量的生理盐水。从ATS注射当天(第0天)起，用代谢笼隔日(分别为第1、3、5、7天)收集大鼠24h尿液，检测24h尿蛋白总量，第8天集中处死所有大鼠，留取肾脏。
3、检测指标 3.1大鼠24小时尿蛋白含量测定应用Bradford法测定24h尿蛋白总量(mg/24h)。
3.2、肾脏病理形态学观察所有标本于4％多聚甲醛固定、石蜡包埋、切片(3μm)，分别用苏木素-伊红(HE)和希夫氏(PAS)染色，光镜下观察肾组织，每张切片高倍镜下随机选取10个肾小球，对肾小球内有核细胞进行计数，并采用捷达病理图像分析系统软件测定肾小球系膜区面积及肾小球面积。
3.3、肾组织PCNA、TGF-β1、MCP-1的表达肾组织中PCNA表达采用免疫组化方法检测；肾组织中TGF-β1、MCP-1的表达采用Western Blot检测。
4、统计学方法结果以均数±标准差表示，采用SPSS 11.5统计软件进行统计学分析。组间比较采用单因素方差分析，多个均数之间的比较采用q检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。
5、实验结果 5.1槐杞黄颗粒复方制剂对大鼠MsPGN模型24h尿蛋白总量的影响模型组ATS注射后24h，尿蛋白随即升高，至第3天含量达到最高值，尿蛋白总量达48.26mg/24h；治疗组在灌服中药复方制剂2天后对大鼠MsPGN模型有明显降低大鼠尿蛋白排泄的作用(P＜0.05)具体实验结果如表三所示。
表三各组大鼠24h尿蛋白总量变化(n＝6，mg/24h)
与对照组比较，*P＜0.01；与模型组相比较，◆P＜0.01。
5.2肾脏病理形态学观察PAS染色光镜下，正常对照组肾小球无明显改变；模型组肾小球内细胞数明显增多，肾小球系膜细胞和系膜基质弥漫性重度增生，系膜区明显扩大，肾小球毛细血管腔广泛受压变窄、闭塞，部分小球可见球囊粘连、细胞性新月体形成及肾小球硬化，肾小管上皮细胞灶性颗粒样、空泡样变性，部分小管管腔内见蛋白管型，间质可见弥漫性炎性细胞浸润；槐杞黄颗粒复方制剂治疗组的大部分肾小球已基本接近正常，少数小球可见系膜细胞及系膜基质节段性轻度增生，毛细血管管腔开放良好，偶见球囊粘连，未见新月体形成及肾小球硬化，偶见肾小管上皮细胞灶性颗粒样变性，间质内无明显炎性细胞浸润。
图像分析显示模型组肾小球内有核细胞总数、系膜区面积及肾小球面积均明显高于对照组(P＜0.01)，治疗组肾小球内有核细胞总数、系膜区面积及肾小球面积均明显低于模型组(P＜0.01)具体实验结果如表四所示。
表四各组大鼠肾小球病理形态学指标变化(n＝6)
与对这种比较，*P＜0.01；与模型组比较，◆P＜0.01。
5.3肾组织中PCNA的表达变化免疫组化结果显示，正常大鼠肾小球内有少量固有细胞PCNA核阳性，与对照组相比，模型组肾小球内PCNA核阳性细胞数目明显增多，且PCNA主要表达于增生的系膜细胞核内(P＜0.01)；槐杞黄颗粒复方制剂治疗组肾小球内PCNA核阳性细胞数较模型组有显著下降(P＜0.01)具体实验结果如表五所示。
表五各组大鼠肾小球内PCNA核阳性细胞数比较
与对照组比较，*P＜0.01；与模型组比较，◆P＜0.01。
5.4肾组织中TGF-β1和MCP-1表达Western Blot检测结果显示，正常大鼠肾组织表达少量的TGF-β1和MCP-1。模型组大鼠肾组织中TGF-β1和MCP-1表达显著增加，分别是对照组的2.14倍和3.62倍。槐杞黄颗粒复方制剂治疗后，大鼠肾组织中TGF-β1和MCP-1表达均显著降低，其抑制率分别达到76％和84％。
通过以上研究结果显示，本发明提供的槐杞黄颗粒复方制剂能阻止大鼠MsPGN疾病模型的进一步发展，给予大鼠槐杞黄颗粒复方制剂灌服2天后，大鼠24小时尿蛋白总量较模型组即有显著下降，灌服7天后，槐杞黄颗粒复方制剂治疗组的肾小球内系膜细胞增殖及系膜基质增生较模型组均有显著减轻，间质中炎性细胞浸润程度较模型组明显下降，证实槐杞黄颗粒复方制剂对MsPGN模型具有确切的保护作用，进一步的研究显示，MsPGN模型组在第8天肾皮质中TGF-β1和MCP-1表达明显增强，槐杞黄颗粒复方制剂治疗后，肾组织内TGF-β1和MCP-1的含量均明显减少，进一步证明本发明提供的槐杞黄颗粒复方制剂具有很好的防治肾小球肾炎的作用。
通过以上实验表明槐杞黄颗粒复方制剂对肾脏具有明显的保护作用，尤其对原发性肾病综合征和肾小球肾炎具有很好的防治作用，因此，槐杞黄颗粒复方制剂有望用于治疗肾脏疾病。
权利要求
1、槐杞黄颗粒复方制剂在治疗肾病中的应用。
2、根据权利要求1所述的槐杞黄颗粒复方制剂在治疗肾病中的应用，其特征在于，槐杞黄颗粒复方制剂在治疗原发性肾病综合症中的应用。
3、根据权利要求1所述的槐杞黄颗粒复方制剂在治疗肾病中的应用，其特征在于，槐杞黄颗粒复方制剂在治疗肾小球肾炎中的应用。
全文摘要
本发明公开了槐杞黄颗粒复方制剂在治疗肾病中的应用，经药理实验研究表明，槐杞黄颗粒复方制剂具有很好的保护肾脏的作用，对阿霉素诱导的原发性肾病综合症具有和糖皮质激素相近的治疗作用，并且该中药复方制剂对肾小球肾炎也有很好的治疗作用，且本发明提供的中药复方制剂的原材料易得，药理活性强，不良反应低，有望成为新一代的治疗肾病的药物。
文档编号A61K36/8969GK101623438SQ200910181580
公开日2010年1月13日 申请日期2009年7月28日 优先权日2009年7月28日
发明者黄松明, 张爱华, 朱春华, 陆正鑫 申请人:启东盖天力药业有限公司
技术领域：
本发明涉及一种中药复方，具体涉及槐杞黄颗粒复方制剂，特别涉及槐杞黄颗粒复方制剂在治疗肾病中的应用。
背景技术：
肾病严重的危害人类的生命健康，每年有数千万的病人死于肾脏疾病，其中原发性肾病综合征是儿科常见的泌尿系统疾病，临床主要表现为蛋白尿、低蛋白血症、高脂血症和不同程度的水肿，每年因原发性肾病综合征而死亡的儿童呈上升趋势，目前治疗原发性肾病综合征主要以肾上腺糖皮质激素为基础药物，且治疗周期长，长期使用该类药物会引起机体免疫功能的低下，从而影响疾病的治疗，且长期使用糖皮质激素药物会带来很多不良反应。临床及动物实验研究显示，原发性肾病综合征的发病机制与机体免疫功能紊乱相关，同时，肾小球肾炎也是危害人类生命健康的主要疾病，每年因肾小球肾炎疾病死亡的人数逐年升高，目前治疗肾小球肾炎主要以化学药为主，但长期使用化学药会产生多种不良反应，且有些药物通过肾脏排泄对肾脏产生严重的毒副作用。槐杞黄颗粒复方制剂由槐耳菌质、枸杞子和黄精三味药组成，具有补益精气、滋补润养心肺和强壮筋骨之功效，临床上主要应用于治疗呼吸道感染疾病。
发明内容
发明目的本发明的目的是为了充分利用中药资源，在原有槐杞黄颗粒复方制剂的基础上，开发其新的临床用途，提供槐杞黄颗粒复方制剂在治疗肾脏疾病中的应用。
技术方案为实现以上目的，本发明提供的槐杞黄颗粒复方制剂由下列重量百分比的原料药制成槐耳菌质36-50％、枸杞子20-35％、黄精15-30％。
作为优选方案，本发明提供的槐杞黄颗粒复方制剂由下列重量百分比的原料药制成槐耳菌质40-50％、枸杞子25-35％、黄精20-30％。
作为另一优选方案本发明提供的槐杞黄颗粒复方制剂由下列重量百分比的原料药制成槐耳46％、枸杞子30％、黄精24％。
本发明提供的槐杞黄颗粒复方制剂做成制剂时将各原料药提取后得到的提取物和药学上可接受的载体制备成口服液、颗粒剂、胶囊剂、片剂、粉针剂或注射液剂型的药物。
将本发明提供的槐杞黄颗粒复方制剂制成口服液时，将各原料的提取物加蒸馏水溶解，过滤，加入糖浆，调节pH，制成口服液。
将本发明提供的槐杞黄颗粒复方制剂制成片剂时，把各原料和乳糖或玉米淀粉，需要时加入润滑剂硬脂酸镁，混合均匀，然后压片制成片剂。
本发明提供的槐杞黄颗粒复方制剂制成胶囊剂时把各原料的提取物和载体乳糖或玉米淀粉混合均匀，整粒，然后装胶囊制成胶囊剂。
本发明提供的槐杞黄颗粒复方制剂制成颗粒剂时，把各原料的提取物和稀释剂乳糖或玉米淀粉混合均匀，整粒，干燥，制成颗粒剂。
本发明提供的槐杞黄颗粒复方制剂制成注射液时，取各原料的提取物加入生理盐水溶解然后加入活性碳，搅拌均匀，80℃加热30分钟，过滤，调节pH值，用垂熔玻璃漏斗或其它滤器过滤至澄明，灌装，在100至115℃灭菌30分钟制成注射液。
以上提供的槐杞黄颗粒复方制剂在治疗肾脏疾病中的应用，也可以用于治疗原发性肾病综合症药物中的应用，并且槐杞黄颗粒复方制剂也可以在治疗肾小球肾炎药物中的应用。
本发明提供的槐杞黄颗粒复方制剂，根据中医药理论，采用辨证论治的理论制定成本方，经药理学研究显示，方中槐耳富含槐耳菌质多糖，为活性很高的生物反应调节剂，能激发机体免疫系统的诸多环节，从而提高机体的免疫力，枸杞具有滋补作用、归肾经、能改善肾脏的生理功能，黄精具有滋阴作用，研究显示也具有补肾的作用。
有益效果本发明在原有复方槐杞黄颗粒复方制剂的基础上进行新的用途开发，实验表明该中药复方制剂具有很好的治疗肾病的作用，尤其对原发性肾病综合症具有很好的治疗作用，并且该中药复方制剂对肾小球肾炎也有很好的治疗作用，且不良反应小，有望开发成为新一代的治疗肾病的药物，同时本发明涉及的三味中药原料均为常用中药，原药材易得。
具体实施例方式 根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比及其实验结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1槐杞黄颗粒复方制剂对原发性肾病综合征的药理作用。
1、实验材料 雄性清洁级SD系大鼠30只，体重160～180g，购自上海斯莱克动物中心。阿霉素(美国楷莱)、地塞米松注射液由南京儿童医院提供，槐杞黄颗粒复方制剂由江苏启东盖天力药业有限公司提供，ED-1单克隆抗体购自英国serotec公司，FITC标记的羊抗小鼠IgG购自北京中山生物技术公司。TNF-α和IL-1βELISA试剂盒分别购自晶美生物工程有限公司和美国invitrogen公司。
2、阿霉素肾病模型的构造及实验分组 SD大鼠适应性喂养1周，随机分为5组每组6只大鼠①阿霉素肾病组阿霉素5mg/kg，尾静脉单次注射；②正常对照组注射相等容量生理盐水；③槐杞黄颗粒复方制剂(批号01至03)治疗组尾静脉单次注射阿霉素5mg/kg，次日起予槐杞黄颗粒复方制剂2mg/kg灌胃，1次/d；④地塞米松治疗组尾静脉单次注射阿霉素5mg/kg，次日起予地塞米松0.2mg/kg腹腔注射，1次/d；⑤联合治疗组注射阿霉素后，次日起同时给予槐杞黄颗粒复方制剂及地塞米松治疗，2mg/kg、灌胃，1次/d。造模期间所有大鼠均自由饮水和进食，造模后第十五天，大鼠腹腔注射20％乌拉坦，5mg/kg；麻醉成功后经心脏取血分离血清，并留取双侧肾组织行病理组织学等检查。
3、实验观察指标 3.1一般情况及给药后24小时尿蛋白含量的测定 造模期间观察各组小鼠的饮食饮水量、体重改变、毛发、精神活动等一般情况。同时予造模前及开始后第7、14天将大鼠置于代谢笼中，收集24小时尿液，采用考马斯亮蓝法检测尿蛋白含量。
3.2肾脏病理组织学检查 光镜所有标本于4％多聚甲醛固定、石蜡包埋、切片(3μm)，分别行苏木素-伊红(HE)和希夫氏(PAS)染色，光镜下观察肾组织。
电镜戊二醛固定后，常规制作标本，用透射电镜观察肾组织。
3.3免疫荧光检测 肾组织冰冻切片(5μm)于丙酮固定10min，PBS漂洗。加入ED-1单克隆抗体(1∶100)，37℃孵育1h，PBS漂洗后加入FITC标记二抗(1∶30)，37℃孵育45min，再用PBS漂洗后甘油封片，荧光显微镜下观察。PBS液代替一抗做空白对照。
3.4血清TNF-α、IL-1β的含量测定 取大鼠新鲜血液，于4℃静置8h，在4℃下、3000r/min离心10min分离血清。按照ELISA试剂盒说明，采用双抗体夹心法测定血清中细胞因子TNF-α和IL-1β的含量。
3.5实验结果 3.5.1造模第二天开始，大鼠出现不同程度的腹泻、饮食和饮水量减少、毛发蓬松，尤以模型组显著。正常对照组未出现明显不适。如表一所示，阿霉素模型组于造模结束后体重明显减轻，槐杞黄颗粒复方制剂组则部分缓解阿霉素造成的体重减轻，并显著改善大鼠的一般情况。
表一各组别大鼠给药后体重变化情况 3.5.2各组大鼠于造模前尿蛋白均低于15mg/24h，各组间无显著差异。造模后第7天，阿霉鼠尿蛋白则于7天后开始下降，第14天与阿霉素肾病模型组相比具有显著差异(P＜0.05)，具体实验结果如表二所示。
表二各组别大鼠给药后尿蛋白含量测定结果 3.5.3光镜结果显示阿霉素模型组的大鼠部分肾小球体积增大，系膜细胞及基质局灶节段性轻度增多；槐杞黄颗粒复方制剂治疗组、联合治疗组的肾小球较正常对照组无明显改变。
电镜结果示阿霉素模型组大鼠肾小球基底膜偶见增厚，肾小球脏层上皮细胞(即足细胞)足突广泛融合、部分足突消失；槐杞黄颗粒复方制剂治疗组、地塞米松治疗组和联合治疗组的基底膜平滑，足细胞损伤则较模型组明显缓解。
3.5.4槐杞黄颗粒复方制剂对肾小管间质损伤的影响 阿霉素模型组的大鼠的肾小管上皮细胞出现灶性颗粒样、空泡样变性，部分管腔可见蛋白管型；间质呈灶性炎性细胞浸润并伴少量纤维组织增生。槐杞黄颗粒复方制剂治疗组、地塞米松治疗组和联合治疗组的肾间质炎性细胞浸润面积及范围则均较阿霉素模型组明显减少。
3.5.5免疫荧光结果显示，阿霉素模型组可显著诱导肾间质单核、巨噬细胞活化、浸润；槐杞黄颗粒复方制剂治疗组能够显著的抑制阿霉素所诱导的肾间质单核、巨噬细胞活化和浸润。
3.5.6对血清细胞因子TNF-α和IL-1β的影响 实验结果显示阿霉素模型组能显著上调大鼠血清中细胞因子TNF-α和IL-1β表达，和正常组比较具有统计学意义(P＜0.05)。给予槐杞黄颗粒复方制剂、地塞米松或联合治疗后，大鼠血清中TNF-α、IL-1β的上调明显受到抑制和正常组比较无有统计学意义(P＞0.05)。
以上实验结果均显示本发明提供的槐杞黄颗粒复方制剂能显著改善阿霉素诱导的原发性肾病综合征，能显著降低阿霉素肾病尿蛋白的排泄，保护肾小球足细胞，缓解肾小管间质损伤，调节机体免疫紊乱，实验结果显示槐杞黄颗粒复方制剂对肾脏具有很好的保护作用，能增强机体的免疫功能，其药理活性和地塞米松相近，且不良反应较地塞米松低，有望开发成为新一代治疗肾病的药物，并且通过药理实验得出槐杞黄颗粒复方制剂和地塞米松联合治疗的效果也很好，不良反应也降低，因此本发明提供的槐杞黄颗粒复方制剂和地塞米松的混合制剂也可以开发成为新一代治疗原发性肾病综合征的药物。
实施例2槐杞黄颗粒复方制剂对肾小球肾炎的药理作用。
1、实验材料 健康雄性SD大鼠24只，4周龄，体重160g左右，购自江苏省实验动物中心；槐杞黄颗粒复方制剂由江苏启东盖天力药业有限公司提供；完全弗氏佐剂、FITC标记的羊抗兔IgG及Schiff试剂购自美国Sigma公司，转化生长因子(TGF-β1)多克隆抗体购自美国Sant Cruz公司，增殖细胞核抗原(PCNA)单克隆抗体和单核细胞趋化因子-1(MCP-1)单克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG、正常山羊血清封闭液、DAB显色剂购自北京中山生物技术公司。
2、实验方法和实验分组 2.1抗大鼠胸腺细胞抗血清(ATS)的制备取4周龄SD大鼠，剥取其胸腺并制备成一定浓度的单胸腺细胞悬液，与完全弗氏佐剂等体积混匀后，按5×107细胞皮下多点注射给免疫新西兰大白兔，其后每隔2周按1×107胸腺细胞经耳缘静脉注射加强免疫3次。7周后颈动脉取血并分离血清，大鼠胸腺细胞涂片及大鼠肾组织冰冻切片测定ATS效价，间接免疫荧光法测抗体效价达1∶1280。
2.2大鼠抗Thy1.1系膜增生性肾小球肾炎模型的制备及实验分组大鼠抗Thy-1.1的抗体肾炎(anti-thy-1.1 antibody induced glomerulonephritis)模型是一种经典的系膜增生性肾小球肾炎模型。取SD大鼠24只，随机分为4组，每组6只，对照组经尾静脉一次性注射10ml/kg的正常兔血清，模型组、槐杞黄颗粒复方制剂治疗组经尾静脉一次性注射10ml/kg的ATS。从注射ATS当天起，槐杞黄颗粒复方制剂治疗组每天灌服中药复方制剂2mg/kg，1次/d；对照组和模型组分别灌服等量的生理盐水。从ATS注射当天(第0天)起，用代谢笼隔日(分别为第1、3、5、7天)收集大鼠24h尿液，检测24h尿蛋白总量，第8天集中处死所有大鼠，留取肾脏。
3、检测指标 3.1大鼠24小时尿蛋白含量测定应用Bradford法测定24h尿蛋白总量(mg/24h)。
3.2、肾脏病理形态学观察所有标本于4％多聚甲醛固定、石蜡包埋、切片(3μm)，分别用苏木素-伊红(HE)和希夫氏(PAS)染色，光镜下观察肾组织，每张切片高倍镜下随机选取10个肾小球，对肾小球内有核细胞进行计数，并采用捷达病理图像分析系统软件测定肾小球系膜区面积及肾小球面积。
3.3、肾组织PCNA、TGF-β1、MCP-1的表达肾组织中PCNA表达采用免疫组化方法检测；肾组织中TGF-β1、MCP-1的表达采用Western Blot检测。
4、统计学方法结果以均数±标准差表示，采用SPSS 11.5统计软件进行统计学分析。组间比较采用单因素方差分析，多个均数之间的比较采用q检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。
5、实验结果 5.1槐杞黄颗粒复方制剂对大鼠MsPGN模型24h尿蛋白总量的影响模型组ATS注射后24h，尿蛋白随即升高，至第3天含量达到最高值，尿蛋白总量达48.26mg/24h；治疗组在灌服中药复方制剂2天后对大鼠MsPGN模型有明显降低大鼠尿蛋白排泄的作用(P＜0.05)具体实验结果如表三所示。
表三各组大鼠24h尿蛋白总量变化(n＝6，mg/24h)
与对照组比较，*P＜0.01；与模型组相比较，◆P＜0.01。
5.2肾脏病理形态学观察PAS染色光镜下，正常对照组肾小球无明显改变；模型组肾小球内细胞数明显增多，肾小球系膜细胞和系膜基质弥漫性重度增生，系膜区明显扩大，肾小球毛细血管腔广泛受压变窄、闭塞，部分小球可见球囊粘连、细胞性新月体形成及肾小球硬化，肾小管上皮细胞灶性颗粒样、空泡样变性，部分小管管腔内见蛋白管型，间质可见弥漫性炎性细胞浸润；槐杞黄颗粒复方制剂治疗组的大部分肾小球已基本接近正常，少数小球可见系膜细胞及系膜基质节段性轻度增生，毛细血管管腔开放良好，偶见球囊粘连，未见新月体形成及肾小球硬化，偶见肾小管上皮细胞灶性颗粒样变性，间质内无明显炎性细胞浸润。
图像分析显示模型组肾小球内有核细胞总数、系膜区面积及肾小球面积均明显高于对照组(P＜0.01)，治疗组肾小球内有核细胞总数、系膜区面积及肾小球面积均明显低于模型组(P＜0.01)具体实验结果如表四所示。
表四各组大鼠肾小球病理形态学指标变化(n＝6)
与对这种比较，*P＜0.01；与模型组比较，◆P＜0.01。
5.3肾组织中PCNA的表达变化免疫组化结果显示，正常大鼠肾小球内有少量固有细胞PCNA核阳性，与对照组相比，模型组肾小球内PCNA核阳性细胞数目明显增多，且PCNA主要表达于增生的系膜细胞核内(P＜0.01)；槐杞黄颗粒复方制剂治疗组肾小球内PCNA核阳性细胞数较模型组有显著下降(P＜0.01)具体实验结果如表五所示。
表五各组大鼠肾小球内PCNA核阳性细胞数比较
与对照组比较，*P＜0.01；与模型组比较，◆P＜0.01。
5.4肾组织中TGF-β1和MCP-1表达Western Blot检测结果显示，正常大鼠肾组织表达少量的TGF-β1和MCP-1。模型组大鼠肾组织中TGF-β1和MCP-1表达显著增加，分别是对照组的2.14倍和3.62倍。槐杞黄颗粒复方制剂治疗后，大鼠肾组织中TGF-β1和MCP-1表达均显著降低，其抑制率分别达到76％和84％。
通过以上研究结果显示，本发明提供的槐杞黄颗粒复方制剂能阻止大鼠MsPGN疾病模型的进一步发展，给予大鼠槐杞黄颗粒复方制剂灌服2天后，大鼠24小时尿蛋白总量较模型组即有显著下降，灌服7天后，槐杞黄颗粒复方制剂治疗组的肾小球内系膜细胞增殖及系膜基质增生较模型组均有显著减轻，间质中炎性细胞浸润程度较模型组明显下降，证实槐杞黄颗粒复方制剂对MsPGN模型具有确切的保护作用，进一步的研究显示，MsPGN模型组在第8天肾皮质中TGF-β1和MCP-1表达明显增强，槐杞黄颗粒复方制剂治疗后，肾组织内TGF-β1和MCP-1的含量均明显减少，进一步证明本发明提供的槐杞黄颗粒复方制剂具有很好的防治肾小球肾炎的作用。
通过以上实验表明槐杞黄颗粒复方制剂对肾脏具有明显的保护作用，尤其对原发性肾病综合征和肾小球肾炎具有很好的防治作用，因此，槐杞黄颗粒复方制剂有望用于治疗肾脏疾病。
权利要求
1、槐杞黄颗粒复方制剂在治疗肾病中的应用。
2、根据权利要求1所述的槐杞黄颗粒复方制剂在治疗肾病中的应用，其特征在于，槐杞黄颗粒复方制剂在治疗原发性肾病综合症中的应用。
3、根据权利要求1所述的槐杞黄颗粒复方制剂在治疗肾病中的应用，其特征在于，槐杞黄颗粒复方制剂在治疗肾小球肾炎中的应用。
全文摘要
本发明公开了槐杞黄颗粒复方制剂在治疗肾病中的应用，经药理实验研究表明，槐杞黄颗粒复方制剂具有很好的保护肾脏的作用，对阿霉素诱导的原发性肾病综合症具有和糖皮质激素相近的治疗作用，并且该中药复方制剂对肾小球肾炎也有很好的治疗作用，且本发明提供的中药复方制剂的原材料易得，药理活性强，不良反应低，有望成为新一代的治疗肾病的药物。
文档编号A61K36/8969GK101623438SQ200910181580
公开日2010年1月13日 申请日期2009年7月28日 优先权日2009年7月28日
发明者黄松明, 张爱华, 朱春华, 陆正鑫 申请人:启东盖天力药业有限公司
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