微波促进固相合成苦瓜mc-jj62多肽类似物及其应用的制作方法

专利名称：：微波促进固相合成苦瓜mc-jj62多肽类似物及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及MC-JJ62多肽类似物及其微波促进固相合成方法。
背景技术：
：糖尿病是当今危害人类健康的重要疾病，目前全世界约有5%-7%的人受糖尿病困扰，被认为是继心脑血管疾病、恶性肿瘤之后，导致人类伤残、死亡的第三大杀手。糖尿病分为I型和II型，I型糖尿病是一种自身免疫疾病，患者的存活需要注射胰岛素。11型糖尿病占众多糖尿病患者总数的95%左右。II型糖尿病的原因是胰岛细胞代谢发生障碍，胰岛素分泌不足，或者产生胰岛素抵抗，是以胰岛素抵抗为主伴胰岛素分泌相对不足，或者以胰岛素分泌相对不足为主伴胰岛素抵抗导致的代谢性疾病。胰岛素分泌不足，或者产生胰岛素抵抗都可造成血液中葡萄糖过量，当血糖含量超过肾阈时，葡萄糖就转移到尿中排出，从而产生葡萄糖尿。目前临床应用的几种药物均不能够治愈糖尿病，主要是通过不同的作用机制，降低患者的血糖水平。糖尿病患者必须终生服药，药物本身对人体的毒副作用同样威胁着糖尿病人的健康。在中国，目前使用药物能够控制血糖达到正常标准的，还不到糖尿病患者总数的20%(邹大进，2型糖尿病的祸首--胰岛素抵抗，大众医学，2002，(6):17)，直接导致了许多糖尿病患者的并发症发生早，进展快。显然，除了筛选更加安全有效的新型药物之外，寻找其它的辅助治疗手段有效控制血糖水平，对于提高糖尿病人的健康水平同样是十分重要的。苦瓜(Momordicacharantia)是一种人类有长期安全食用历史的蔬菜。近二十年来，人们在苦瓜的果实中发现了许多具有降血糖活性的成分，一些苦瓜果实的提取物，或者直接用苦瓜果实干燥后制成的茶饮料，已经推荐给糖尿病人使用，某些苦瓜成分已经被申请作为治疗糖尿病药物的专利。但是，从科技文献中介绍以及已有的专利或产品，主要是基于对苦瓜诸多降血糖活性成分中对某个已知成分的认识，并没有意识到，苦瓜中具有降血糖活性的成分已知的就有多种，并且化学性质各不相同，此外，苦瓜中还有某些具有降血糖的活性成分是未知的。所以，已有的文献、专利或产品，其局限性也是明显的。美国专利(US6391854B1)和中国专利(CN98805001，苦瓜中的口服活性成分，其活性肽，及它们治疗糖尿病的用途；<申请人>美国卡里克斯治疗公司)提供了苦瓜的一种水溶性提取物称为MC6，MC6的特征中它含有三种肽，它的制备方法的特征是离心澄清的苦瓜汁依次通过30kDal，10kDal及3kDal的超滤膜。MC6分子量小于10kDal，能够通过10kDal超滤膜，而为3kDal滤膜截留。有活性的MC6的特征是在SDS-PAGE凝胶电泳上以单一条带形式迁移，分子量小于10kDal，包含三种肽。同时提供的还有MC6的肽成分，称为MC6.1，以及MC6.1的衍生物和模拟物。活性MC6，MC6.1，MC6.2，MC6.3有降血糖作用，尤其是糖尿病，其中优选口服给予这些活性药物。在这一专利中，所利用的苦瓜降血糖活口服给药后也有这种活性。同时提供的还有利用这些活性药物治疗高血糖疾病的方法性成分仅仅是够透过超滤膜的水溶性蛋白(多肽)。专利申请者描述，MC6没有提高模型动物血浆中胰岛素水平的活性。—则国际专利申请(PCT/IN99/000521999.9.28)的发明，提供了一种高效降血糖多肽-k，它提取自苦瓜。专利申请者介绍的多肽-k制备方法是用非极性溶剂处理苦瓜种子(或果实)，去除不需要的油脂、黄酮类和皂苷配基，然后用含水80%的丙酮提取残留物中的蛋白质，最后选择性地结晶分离出多肽-k。申请者描述，多肽-k不溶于水，其降血糖的作用机理是激活血液中无活性的胰岛素。很明显，MC6与多肽-k都是苦瓜中具有降血糖活性的蛋白质，但是，MC6溶于水，而多肽-k不溶于水，按照MC6的制备方法，则损失了苦瓜中的多肽-k;而按照多肽-k的制备方法，同样损失了苦瓜中的MC6。还有一些中国专利公开了从苦瓜中提取降糖物质或制成中药的内容1、<申请号>99115925<发明名称>一种苦瓜降糖胶囊及其制备工艺，该发明是以新鲜苦瓜为原料，经清洗冷冻，低温制浆，压滤，将滤渣经烘干过IOO目筛，制成苦瓜渣粉；滤液澄清再过滤，经酸性(pH3.0)乙醇在15t:条件下搅拌3小时，静置沉淀12小时，过滤后将沉淀物经低温干燥，过100目筛，制成苦瓜蛋白；过滤液经6(TC真空浓縮，加2倍水溶解，加2倍乙醚脱脂，5(TC真空浓縮回收乙醚，6(TC真空回收乙醇制成粗苦瓜总皂苷，再经无水丙酮在4t:条件下沉淀洗涤数次，3(TC以下真空浓縮制成苦瓜总皂苷，最后将总皂苷，苦瓜蛋白粉和苦瓜渣按IO:2:88重量比经混匀，装入胶囊制成苦瓜降糖胶囊。具有原料来源广泛，工艺简单，服用方便，价格便宜，无毒副作用的优点，可做为治疗糖尿病的辅助制剂。2、<申请号>98110802<授权公告日>2001年08月15日<发明名称>天然苦瓜素降糖药及其制备方法，发明公开了一种天然苦瓜素降糖药的制作方法，包括下述步骤a.将成熟苦瓜切成片，并进行干燥处理；b.把干燥的苦瓜片浸泡于水中，并提取浸液；C.把苦瓜浸液浓縮成浓縮液；d.将浓縮液进行生物酶解，得高活性降解液；e.把降解液进行恒温干燥喷粉制粒；f.将颗粒装入胶囊成药；该方法工艺设备简单，符合大规模生产要求，产品得率高，治疗效果好，无毒副作用。3、<申请号>95103732<发明名称>治疗糖尿病的中药及其生产方法，该发明是一种治疗糖尿病的中药，该中药的主要成分是动物胰脏、苦瓜、南瓜、黄芪，山药，生产方法是动物胰脏粉碎千燥，与用水提法或醇析法得到的苦瓜、南瓜、黄芪提取物混合再加入山药粉得到，该药物具有益气生津，健脾润燥，滋阴降火功率效，并有提高机体免疫功能，促进胰岛素分泌，降低血糖作用。4、〈申请号〉93119351.6〈发明名称〉植物降血糖活性蛋白新组份PA及其制备，该发明涉及生物制药领域。从植物材料苦瓜中提取降血糖活性蛋白新组分PA，制备工艺中材料净化处理-低温冰冻-破碎-酸醇浸渍-高速匀浆-酸醇提取-抽滤-离心净化-沉淀-重新溶解-Sephadex凝胶过柱-紫外检测分部收集-浓縮-干燥的苦瓜降血糖活性蛋白新组份PA的制备方法，其特点是采用了等电点沉淀和凝胶过柱、紫外检测分部收集的方法。发明人认为该物质具有分离提取简便、消耗有机溶剂少、得率高等优点，经动物试验证明降血糖效果明显。5、<申请号>02102754<发明名称>一种快速高效提取植物类胰岛素的方法，苦6瓜种子含有较丰富的植物类胰岛素，是目前治疗糖尿病的一种有效成分。发明技术特征是苦瓜种子脱壳，种仁粉碎过60或100目筛，然后采用酸性乙醇进行萃取，离心取上清液，加入NaCl占体积3%5%，用15Mol/LNaOH调节溶液至pH值7.0±7.5溶液变浑浊、离心、去上液，用丙酮洗涤沉淀部分三次，真空干燥，得到植物类胰岛素粗品。用0.1MTris.cl溶液(pH7.5)溶解进行凝胶亲和层析，收集洗脱峰溶液，用丙酮或乙醇浓縮真空干燥得到植物类胰岛素精品。该方法可以提取制备高纯度的植物类胰岛素成分，可用于糖尿病的治疗。6、<申请号>98102198.0<发明名称>一种苦瓜含片及其制备方法，该发明为一种苦瓜含片及其制备方法。本苦瓜含片主要含有苦瓜粉、糊精、柠檬酸和甘露醇等，制备时，先将鲜苦瓜经榨汁、过滤、冷冻干燥制得苦瓜冻干粉，再与其它成分进行混合，并压制成片。采用本发明的制备方法科学合理，充分保留了苦瓜中的多种营养成分，所制含片常温下不失苦瓜的活性，具有清热解毒、宽胸利气、生津止渴、降低血糖、提高免疫力、抑制癌细胞等功效，是日常生活，特别是在灾区救援、军事行动、以及旅游、探险活动中，可迅速补充体力，提高免疫力的方便必需品。主权项(A61K35/78)要求是一种苦瓜含片，其特征是含有苦瓜粉、糊精、甘露醇、香料、色素及硬脂酸镁。已有的研究表明，苦瓜中除蛋白质之外，皂苷也是一种极为有效的降血糖活性的成分。—些科技文献报道，苦瓜皂苷为四环三菇类化合物，有多个不同成分，均难溶于水，可用乙醇从干燥的苦瓜果实中提取出(常凤岗苦瓜化学成分研究，中草药，1995，26(10)507-510)。苦瓜皂苷并不影响受试动物模型血浆中胰岛素含量，主要是促进增加肌糖原和肝糖原的合成(王先远，金宏，许志勤等苦瓜皂苷降血糖作用及机制初探，氨基酸和生物资源，2001，23(3):42-45)，因而具有显著的降血糖作用(孙淑卿，苦瓜的药理和临床研究概况，中药材，1997，(8):428-429)，动物试验证明，其血糖降低幅度甚至优于"优降糖"(孙宝莹等，苦瓜皂苷的药效学实验研究，河南中医药学刊，1994，9(6):19—21)。水溶多肽MC6、水不溶的多肽-k及苦瓜皂苷，由于它们化学性质的差异，因而属于彼此不同的物质。并且，苦瓜降血糖活性成分并不仅仅是已知的皂苷和蛋白质。从新鲜苦瓜的水煮液中分离出了可溶于乙醚和不溶于乙醚的两个未知的成分，已经鉴定不为皂苷、黄酮和生物碱，这两种成分都表现出明显的降血糖活性(王勇庆苦瓜降血糖作用研究，湖南中医药杂志，1998，C6):51-52)。由此证明，苦瓜中降血糖成分除皂苷和植物蛋白之外，还有其它的降糖活性化合物。将苦瓜的几种不同方法提取物对四氧嘧啶诱导的化学性糖尿病模型小鼠的降糖效果进行比较，结果表明，苦瓜的未被加热的直接压榨的果汁较其它方法提取的有效部位的降血糖效果更好，并推断其降血糖活性物可能为水溶性的受热易被破坏的成分(范玉玲；崔福德，苦瓜有效部位降糖活性的比较研究，沈阳药科大学学报2001，18(1):50-52)。动物实验表明，鲜苦瓜汁能使能使四氧嘧啶诱导糖尿病小鼠已经受损伤的胰岛P细胞得到修复，并再生出新的13细胞，提高了血浆中的胰岛素含量(Ahmed，I.，7Adeghate，E，Sharma，A.K.，Pallot，D丄etal.EffectsofMomordicacharantiafruitjuiceonisletmorphologyinthepancreasofthestreptozotocin-diabeticrat.Diabetesresearchandclinicalpractice.1998，40，145-151)。体内和离体的进一步研究表明，鲜苦瓜汁的这种作用机理是减轻了糖尿病小鼠的胰腺，RIN细胞及胰岛的脂质过氧化，并降低了RIN细胞中四氧嘧啶诱导的apoptosis，从而对RIN细胞，胰岛及胰腺13细胞的起保护作用(Sitasawad，S丄.，Shewade.Ye，Bhonde，Ro，Roleofbittergourdfruitjuiceinstz-induceddiabeticstateinvivoandinvitro.JournalofEthno-pharmacology，2000，73(1):71-79)。而在苦瓜的已知降糖活性化合物中，尚未能确定具有这种修复或再生胰岛细胞，提高胰岛素水平的生物活性。由上述事实可知，苦瓜的降血糖功能活性物，有已知的，也还有属于未知的，苦瓜的降血糖功能，实际是其中所含的多种具有降血糖活性的成分协同作用的结果。就已知的活性成分而言，因其化学性质不同，很难用一种溶剂将它们同时提取出来。此外，在苦瓜的降血糖活性物中，包含有不耐热的成分，其提取的过程不应当受热。用磨浆的办法将新鲜的苦瓜果肉组织细胞充分破碎，细胞的所有内含物，包括溶于水与难溶于水的降血糖活性成分，都将被释放到果浆中。将果浆中的粗纤维(来自于果肉细胞壁)滤去，然后冷冻干燥，这种苦瓜汁的冻干制品无疑包含了比较全面的降血糖活性成分。但是，苦瓜汁中降血糖活性物的含量其实很低，直接冻干成本昂贵，另一方面，苦瓜汁中存在的糖类物质极易潮解，使这种冻干制品根本无法在正常条件下分装、贮藏和使用。加入大量的干燥助剂或防潮剂虽然可以解决苦瓜汁的冻干制品的潮解问题，但将无法制得高含量的苦瓜降血糖制品。综上所述，文献和专利公开的苦瓜有效成分的制备，基本上是采用物理法和化学法提取某个或若干个明确的化学成分为主，或者是苦瓜在加热条件下的某种溶媒(如水，乙醇或其混合物)的总提取物，它们或者未提及如何利用苦瓜中那些化学性质未知的降血糖活性成分，或者未明确苦瓜中某些热敏性降血糖活性物的受热破坏问题。99115925号中国发明专利，一种苦瓜降糖胶囊及其制备工艺提出了苦瓜蛋白与苦瓜皂苷的利用，但在制备过程使用了乙醇，丙酮，乙醚等有机溶剂。98110802号专利，天然苦瓜素降糖药及其制备方法中提到将苦瓜浓縮液进行生物酶解，得高活性降解液，但未提及生物酶解中采用的是什么酶。98102198.0号专利，一种苦瓜含片及其制备方法中使用的是冷冻干燥苦瓜汁工艺，但它没有考虑去除苦瓜中已知的不具有降血糖活性的成分的问题。基于上述原因，开发一套能全面利用苦瓜中理化性质不同的各类降血糖活性物，并且活性成分含量高，所以对于充分而合理地利用并开发苦瓜资源，也是十分必要的。多肽可以通过基因工程的方法或者化学合成的方法得到。基因工程的方法在获取长肽(氨基酸残基长度大于50)或蛋白质上比化学方法有优势，但是多肽的化学合成方法尤其是在固相合成策略出现后，在制备氨基酸残基长度小于40的多肽或小肽上有基因工程方法难以比拟的灵活性、多样性和高效性等。1963年Merrifield创立并开发了固相合成多肽的方法。固相多肽合成一般有两种策略即Boc/Bzl正交保护固相合成策略和Fmoc/tBu正交保护固相合成策略，Merrifield创立的固相合成法即为Boc/Bzl正交保护固相合成策略。但是，Boc/Bzl正交保护固相合成策略中存在一些缺点，如副反应多、条件苛刻以及在延长肽链的过程中多肽链会从固相上丢失等。而随后出现的Fmoc/tBu正交保护固相合成策略则反应条件温和的多。当近年来微波技术运用于多肽的固相合成中后，使多肽的合成技术产生了一个飞跃。微波促进化学反应是由于其使极性分子在微波场中快速旋转，使得一些反应速率较常规加热方法快10到1000倍，而且产率大大提高。1986年Gedye等人首次报道了将微波应用于有机合成中，微波可以促进许多化学反应，如Diels-Alder反应，皂化反应等，可以显著地加快反应速率并提高收率。在1992年，Hui-mingYu等首先报道了将微波应用于多肽固相合成领域中，他们完成了酰基载体蛋白片断十肽(acylcarrierprotein,ACP6574)的合成。如何高效的合成长肽在世界上仍然是一个挑战，因为多肽随着肽链的增加，其合成难度成倍增加。用传统的固相方法合成长肽，其收率往往很低杂质较多纯化困难，从而从实用的角度上说失去了合成的意义。其次合成周期长，在中间不出现困难肽序的情况下10肽一般需要近一个星期时间才能完成合成周期，如果出现困难肽序，往往就无法合成得到目标多肽。而使用微波促进固相合成多肽，可以克服困难肽序，合成传统固相方法无法得到的多肽，而且合成时间大大縮短，且显著提高多肽粗品纯度及收率，使得产品的纯化大大方便，只要经过一次制备型HPLC就能得到纯度较高的产品；此外还可以非常方便的用D型氨基酸及非天然氨基酸等对多肽进行定点修饰，去寻找活性更高、生物半衰期更长的多肽，这更是基因工程技术无法做到的。因此，我们在苦瓜降血糖(MC-JJ62)多肽类似物的合成中采用此种方法快速高效的合成得到MC-JJ62系列类似物。
发明内容本发明有两个目的第一个目的是从具降血糖活性的药食同源植物苦瓜中得到多肽进行修饰得到降血糖活性更高的MC-JJ62多肽类似物。本发明的第二个目的是提供了MC-JJ62多肽衍生物的固相制备方法，本发明采用微波促进Fmoc/tBu正交保护固相合成策略高效快速地合成得到系列MC-JJ62多肽类似物。其特征在于采用微波促进Fmoc/tBu正交保护固相合成策略，于固相载体上先合成得到载有第一个Fmoc保护氨基酸的树脂，茚三酮法检测为阴性后脱去Fmoc保护基得到载有第一个氨基酸残基的树脂；再进入下一个偶联循环，按照相应的肽序用不同的保护氨基酸重复偶联和脱保护的步骤，依次延长所需的氨基酸序列，合成得到载有相应多肽的树脂，最后用裂解剂将多肽从树脂上切割下来得到多肽粗品。粗品经制备级高效液相色谱纯化，冻干得多肽纯品。载有第一个Fmoc保护氨基酸的树脂的制备方法，其特征是通过在微波照射条件下Fmoc保护氨基酸先经活化剂活化后再与固相载体偶合得到，反应中加入1-羟基-苯并三氮唑(HOBT)或其衍生物抑制消旋，并使用有机碱中和反应的酸性。载有第一个Fmoc保护氨基酸的树脂所使用的固相载体是Rink树脂、Wang树脂或2-氯三苯甲基氯树脂。活化剂是二环己基碳二亚胺(DCQ、N，N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)、N，N〃-羰基二咪唑(CDI)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC.HC1)、2-(7-偶氮苯并9三氮唑)-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)或使用的1-羟基-苯并三氮唑(HOBT)衍生物为N-羟基琥珀酰亚胺(HOSU)、l-羟基-7-偶氮苯并三氮唑(HOAT)或3-羟基-l，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮(HOOBT)。有机碱为三乙胺(TEA)、N-甲基吗啉(NMM)或二异丙基乙胺(DIEA);微波促进条件是微波频率2450MHz，反应温度20100°C，反应时间为515min。Fmoc保护基的脱除是通过使用含有O.lmolL—1的1-羟基-苯并三氮唑(HOBT)的六氢吡啶溶液在微波促进下反应，选用二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)、或N-甲基吡咯烷酮(NMP)为反应溶剂。微波促进条件是微波频率2450MHz，反应温度20100°C，反应时间为1lOmin。本发明的优点在于1.提出的一种MC-JJ62多肽类似物可以在保留降糖活性的基础上，提高MC-JJ62的稳定性，延长作用时间。2.微波促进固相合成MC-JJ62多肽类似物大大的提高了偶合反应速率，常规固相合成方法充分偶合一个氨基酸到树脂上去，往往需要2小时到20小时不等，甚至更长。而微波促进则平均只需要10分钟左右；常规固相合成方法脱Fmoc保护基，往往需要30分钟到1小时不等，而微波促进则平均只需要5分钟左右，这极大的提高了多肽合成的效率，縮短了合成周期。3.微波促进固相合成MC-JJ62多肽类似物合成得到的粗品的纯度大于60%，较常规固相合成方法大大提高，这方便了后续的纯化工作，只需要经过一次制备液相纯化，冻干即可得到目标纯品。4.微波促进固相方法合成MC-JJ62多肽类似物，其成本低，由于偶合效率较高，所需要保护氨基酸平均只需要2倍过量，较常规固相合成方法需要4到5倍过量大为降低。5.微波促进固相合成MC-JJ62多肽类似物方法易于实现自动化、大规模化，这使其更适合工业化生产。因此用本发明提供的微波促进固相合成技术制备的MC-JJ62多肽类似物，收率高、合成周期短、粗品纯化容易，生产成本低、易于工业自动化生产。制备得到的MC-JJ62多肽类似物，比天然MC-JJ62更加稳定，适合作为治疗糖尿病药物的活性成分。具体实施例方式在本说明书全文中采用以下縮写Et3N:三乙胺；NMM:N-甲基吗啉；DIEA:N，N'-二异丙基乙胺；DMF:二甲基甲酰胺；DMSO:二甲亚砜；DCM:二氯甲烷；Fm0C:N-9荷甲氧羰基；DIC:N，N，-二异丙基碳二亚胺；CDI:N，N，-羰基二咪唑；DMAP:4-二甲氨基吡啶；HOSU:N-羟基琥珀酰亚胺；EDC.HC1:1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐；HATU:2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯；HBTU:苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯；HCTU:6-氯苯并三氮唑-l，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯；HOAT:l-羟基-7-偶氮苯并三氮唑；HOBT:1-羟基-苯并三氮唑；PyBOP:六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷；HPLC:高效液相色谱；ESI-MS:电喷雾质谱；Gly:甘氨酸；Ser:丝氨酸；Ala:丙氨酸；Thr:苏氨酸；Val:缬氨酸；lie:异亮氨酸；Leu:亮氨酸；Tyr:酪氨酸；Phe:苯丙氨酸；His:组氨酸；Pro:脯氨酸；Asp:天门冬氨酸；Met:蛋氨酸；Glu:谷氨酸；Trp:色氨酸；Lys:赖氨酸；Arg:精氨酸。Asn:天冬酰胺；Gin:谷氨酰胺。本发明是通过下列实施列来进行说明的，但这些实施例不做任何限制本发明的解释。实施例1(D-Lys)-Thr-Asn-Met-Lys-Gly-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO:2)的微波促进固相合成(1)树脂的溶胀称取Fmoc-AlaResin50mg(取代量0.4mmol/g)，经7mLDCM溶胀30min，抽滤去DCM，再用10mLNMP溶胀30min，最后分别用NMP，DCM，NMP7mL冲洗干净。(2)微波促进Fmoc保护基的脱除将溶胀好的树脂放入反应器中，加入7mL含0.1MHOBT的25%哌啶/NMP(V/V)溶液，在微波反应器中反应lmin，微波功率为15W，反应温度控制在5(TC以内，使用空气压縮机压縮空气冷却，反应结束后滤去溶液；再加入7mL含0.1MHOBT的25%哌啶/NMP(V/V)溶液在微波反应器中再反应4min，微波功率为25W，反应温度控制在5(TC，使用空气压縮机压縮空气冷却。反应结束后滤去溶液，用NMP洗涤干净。得到脱去初始连接的Fmoc保护基的树脂。(3)微波促进Fmoc-Ala-rinkamide-MBHAResin的合成将Fmoc-Ala-rink(0.04mmo1)，HBTU(0.04mmo1)，HOBT(0.04mmo1)和DIPEA(0.08mmol)溶于10mLNMP中，再将此溶液加入上面的树脂中，在微波反应器中反应7min，微波功率为25W，反应温度控制在5(TC，使用空气压縮机压縮空气冷却。反应结束后滤除反应液，用DCM和NMP各7mL洗涤树脂3次。[OOM](4)偶合效率的检测用茚三酮法或者溴酚兰法定性检测树脂的偶合效率，显色反应为阴性即可进入下一个偶合循环。茚三酮法取少量树脂颗粒用乙醇洗涤，放入透明小瓶中加入5%茚三酮乙醇、KCN吡啶溶液(2ml0.001MKCN稀释于98ml吡啶中)、80%苯酚乙醇溶液各2滴，于10(TC加热5分钟，如果树脂显蓝色即为阳性。溴酚兰法取少量树脂颗粒用二甲酰乙酰胺洗涤，放入透明小瓶中加入3滴1%的溴酚蓝二甲基乙酰胺溶液，常温下振摇3分钟，如果树脂显蓝色即为阳性。(5)肽链的延长按照Ala3-MC-JJ62-(ll1)-NH2的序列，重复上述脱保护和偶合的步骤依次连接上相应的氨基酸，偶合微波促进反应时间520min不等。得到连有Ala3-MC-JJ62-(lll)-NH2的树脂。(6)树脂上多肽的裂解将上述得到的连有Ala3-MC-JJ62-(lll)-NH2的树脂放入反应瓶中，各加入裂解剂ReagentK(TFA/苯甲硫醚/水/苯酚/EDT，82.5:5:5:5:2.5，V/V)10mL，先在Ot:下振摇30min，再在常温下反应3h。反应结束后抽滤，加少量TFA和DCM洗涤三次，合并滤液。将滤液加入大量的冰乙醚中析出白色絮状沉淀，冷冻离心得到目标多肽的粗品。最终得到Ala3-MC-JJ62-(lll)-NH2粗品63.2mg，收率为94.3%。(7)Ala3-MC-JJ62-(ll1)-NH2-NH2粗品的纯化将上面得到的Ala3-MC-JJ62-(lll)-NH2粗品，溶于少量的水中，用岛津制备型反相HPLC纯化粗品。纯化中采用C18反相制备柱(340mmX28mm，5ym);流动相A:0.1%TFA/水(V/V)，流动相B:0.1%TFA/乙腈(V/V);流动相梯度流动相B13%15%，30min;流速为6mL/min;检测波长为214nm。收集的溶液冻干得纯品，最终得到纯品29.7mg。理论相对分子质量1079.3.ESI-MSm/z:found[M+3H]3+360.8，[M+4H]4+270.8，[M+5H]5+216.9;calu[M+3H]3+360.8，[M+4H]4+270.7，[M+5H]5+216.9;根据实施例l所述的方法，根据相应的序列合成得到实施例254的多肽，通过电喷雾质谱(ESI-MS)确证各自的分子量。实施例2(D-Ala)Thr-Asn-Met-Lys-Gly-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO:3);理论相对分子质量1022.2.ESI-MSm/z:found[M+3H]3+341.7，[M+4H]4+256.6，[M+5H]5+205.4;calu[M+3H]3+341.6，[M+4H]4+256.6，[M+5H]5+205.4;实施例3(D-Val)-Thr-Asn-Met-Lys-Gly-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO:4);理论相对分子质量1050.3.ESI-MSm/z:found[M+3H]3+351.1，[M+4H]4+263.6，[M+5H]5+211.1;calu[M+3H]3+351.1，[M+4H]4+263.6，[M+5H]5+21U;实施例4(D-Leu)-Thr-Asn-Met-Lys-Gly-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO:5);理论相对分子质量1064.2.ESI-MSm/z:found[M+3H]3+355.8，[M+4H]4+267.1，[M+5H]5+213.9;calu[M+3H]3+355.7，[M+4H]4+267.1，[M+5H]5+213.9;实施例5(D-Ile)-Thr-Asn-Met-Lys-Gly-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO:6);理论相对分子质量1064.3.ESI-MSm/z:found[M+3H]3+355.8，[M+4H]4+267.1，[M+5H]5+213.9;calu[M+3H]3+355.8，[M+4H]4+267.0，[M+5H]5+213.9;实施例6(D-Phe)-Thr-Asn-Met-Lys-Gly-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO:7);理论相对分子质量1098.3.ESI-MSm/z:found[M+3H]3+367.1，[M+4H]4+275.6，[M+5H]5+220.7;calu[M+3H]3+367.0，[M+4H]4+275.5，[M+5H]5+220.5;实施例7(D-Pro)Thr-Asn-Met-Lys-Gly-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO:8);理论相对分子质量1048.2.ESI-MSm/z:found[M+3H]3+350.4，[M+4H]4+263.1，[M+5H]5+210.6;calu[M+3H]3+350.4，[M+4H]4+263.0，[M+5H]5+210.6;实施例8(D-Met)-Thr-Asn-Met-Lys-Gly-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO:9);理论相对12分子质量1082.3.ESI-MSm/z:found[M+3H]3+361.8，[M+4H]calu[M+3H]3+316.8，[M+4H]4+271.7，[M+5H]5+217.5;实施例9(D-Cys)-Thr-Asn-Met-Lys-Gly-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO分子质量1054.3.ESI-MSm/z:found[M+3H]3+352.4，[M+4H]4+264.6，calu[M+3H]3+352.2，[M+4H]4+264.5，[M+5H]5+211.9;实施例10Lys-(D-Ala)-Asn-Met-Lys-Gly-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO分子质量1049.3.ESI-MSm/z:found[M+3H]3+350.8，[M+4H]4+263.3，calu[M+3H]3+350.6，[M+4H]4+263.8，[M+5H]5+210.8;实施例11Lys-(D-Val)-Asn-Met-Lys-Gly-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO分子质量1077.3.ESI-MSm/z:found[M+3H]3+360.1，[M+4H]4+270.3，calu[M+3H]3+360.0，[M+4H]4+270.3，[M+5H]5+216.5;实施例12Lys-(D-Leu)-Asn-Met-Lys-Gly-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO对分子质量1091.4ESI-MSm/z:found[M+3H]3+364.8，[M+4H]4+273.8，calu[M+3H]3+364.8，[M+4H]4+273.7，[M+5H]5+219.1;实施例13Lys-(D-Ile)-Asn-Met-Lys-Gly-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO:分子质量1091.4.ESI-MSm/z:found[M+3H]3+364.8，[M+4H]4+273.8，calu[M+3H]3+364.7，[M+4H]4+273.6，[M+5H]5+219.3;实施例14Lys-(D-Phe)-Asn-Met-Lys-Gly-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO分子质量1125.4.ESI-MSm/z:found[M+3H]3+367.1，[M+4H]4+282.3，calu[M+3H]3+367.0，[M+4H]4+282.2，[M+5H]5+226.0;实施例15Lys-(D-Pro)-Asn-Met-Lys-Gly-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO分子质量1075.3.ESI-MSm/z:found[M+3H]3+359.4，[M+4H]4+269.8，calu[M+3H]3+359.4，[M+4H]4+269.8，[M+5H]5+216.0;实施例16Lys-(D-Met)-Asn-Met-Lys-Gly-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO分子质量1109.4.ESI-MSm/z:found[M+3H]3+370.8，[M+4H]4+278.3，calu[M+3H]3+370.8，[M+4H]4+278.2，[M+5H]5+222.7;实施例17Lys-(D-Cys)-Asn-Met-Lys-Gly-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO分子质量1081.3.ESI-MSm/z:found[M+3H]3+361.4，[M+4H]4+271.3，calu[M+3H]3+361.4，[M+4H]4+271.3，[M+5H]5+217.2;271.6，[M+5H]5+217.5:10);理论相对5+211.9;11);理论相对[M+5H]5+210.9;12);理论相对5+216.5;:13);理论相5+219.3;14);理论相对5+219.3;:15);理论相对5+226.1;16);理论相对5+216.1;:17);理论相对5+222.9;:18);理论相对5+217.3;实施例17Lys-Thr-(D-Ala)-Met-Lys-Gly-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO:19);理论相对分子质量1036.3.ESI-MSm/z:found[M+3H]3+346.4，[M+4H]4+260.1，[M+5H]5+208.3;calu[M+3H]3+346.3，[M+4H]4+260.0，[M+5H]5+208.2;实施例19Lys-Thr-(D-Val)-Met-Lys-Gly-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO:20);理论相对分子质量1064.3.ESI-MSm/z:found[M+3H]3+355.8，[M+4H]4+267.1，[M+5H]5+213.9;calu[M+3H]3+355.8，[M+4H]4+267.0，[M+5H]5+213.9;实施例20Lys-Thr-(D-Leu)-Met-Lys-Ala-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO:21);理论相对分子质量1078.4.ESI-MSm/z:found[M+3H]3+360.5，[M+4H]4+270.6，[M+5H]5+216.7;calu[M+3H]3+360.4，[M+4H]4+270.5，[M+5H]5+216.5;实施例21Lys-Thr-(D-Ile)-Met-Lys-Gly-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO:22);理论相对分子质量1078.4.ESI-MSm/z:found[M+3H]3+360.5，[M+4H]4+270.6，[M+5H]5+216.7;calu[M+3H]3+360.4，[M+4H]4+270.5，[M+5H]5+216.5;实施例22Lys-Thr-(D-Phe)-Met-Lys-Gly-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO:23);理论相对分子质量1112.4.ESI-MSm/z:found[M+3H]3+371.8，[M+4H]4+279.1，[M+5H]5+223.5;calu[M+3H]3+371.6，[M+4H]4+279.0，[M+5H]5+23.4;实施例23Lys-Thr-(D-Pro)-Met-Lys-Gly-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO:24);理论相对分子质量1062.3.ESI-MSm/z:found[M+3H]3+355.1，[M+4H]4+266.6，[M+5H]5+213.3;calu[M+3H]3+355.0，[M+4H]4+266.6，[M+5H]5+213.3;实施例24Lys-Thr-(D-Met)-Met-Lys-Gly-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO:25);理论相对分子质量1096.4.ESI-MSm/z:found[M+3H]3+366.5，[M+4H]4+275.1，[M+5H]5+220.3;calu[M+3H]3+366.5，[M+4H]4+275.0，[M+5H]5+220.2;实施例25Lys-Thr-(D-Cys)-Met-Lys-Ala-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO:26);理论相对分子质量1068.3.ESI-MSm/z:found[M+3H]3+357.1，[M+4H]4+268.1，[M+5H]5+214.7;calu[M+3H]3+357.0，[M+4H]4+268.0，[M+5H]5+214.5;实施例26(D-Lys)-Thr-Ans-Met-Lys-Ala-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO:27);理论相对分子质量1093.3.ESI-MSm/z:found[M+3H]3+365.4，[M+4H]4+274.3，[M+5H]5+219.7;calu[M+3H]3+365.4，[M+4H]4+274.5，[M+5H]5+219.5;实施例27(D-Ala)-Thr-Ans-Met-Lys-Ala-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO:28);理论相对分子质量1036.2.ESI-MSm/z:found[M+3H]3+365.4，[M+4H]4+274.3，[M+5H]5+219.6;calu[M+3H]3+365.4，[M+4H]4+274.2，[M+5H]5+219.7;实施例28(D-Val)-Thr-Ans-Met-Lys-Ala-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO:分子质量1064.3.ESI-MSm/z:found[M+3H]3+355.8，[M+4H]4+267.1，calu[M+3H]3+355.7，[M+4H]4+267.0，[M+5H]5+213.9;实施例29(D-Leu)-Thr-Ans-Met-Lys-Ala-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO分子质量1078.3.ESI-MSm/z:found[M+3H]3+360.4，[M+4H]4+270.6，calu[M+3H]3+360.4，[M+4H]4+270.6，[M+5H]5+216.7;实施例30(D-Ile)-Thr-Ans-Met-Lys-Ala-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO:分子质量1078.3.ESI-MSm/z:found[M+3H]3+360.4，[M+4H]4+270.6，calu[M+3H]3+360.4，[M+4H]4+270.6，[M+5H]5+216.8;实施例31(D-Phe)-Thr-Ans-Met-Lys-Ala-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO:分子质量1112.3.ESI-MSm/z:found[M+3H]3+371.8，[M+4H]4+279.1，calu[M+3H]3+371.7，[M+4H]4+279.0，[M+5H]5+223.5;实施例32(D-Pro)-Thr-Ans-Met-Lys-Ala-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO:分子质量1062.3.ESI-MSm/z:found[M+3H]3+355.1，[M+4H]4+266.6，calu[M+3H]3+355.1，[M+4H]4+266.6，[M+5H]5+213.5;实施例33(D-Met)-Thr-Ans-Met-Lys-Ala-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO分子质量1096.3.ESI-MSm/z:found[M+3H]3+366.5，[M+4H]4+275.1，calu[M+3H]3+366.5，[M+4H]4+275.0，[M+5H]5+220.3;实施例34(D-Cys)-Thr-Ans-Met-Lys-Ala-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO对分子质量1068.3.ESI-MSm/z:found[M+3H]3+357.1，[M+4H]4+268.1calu[M+3H]3+357.0，[M+4H]4+268.0，[M+5H]5+214.5;实施例35Lys-(D-Ala)-Asn-Met-Lys-Ala-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO:分子质量1063.3.ESI-MSm/z:found[M+3H]3+355.4，[M+4H]4+266.8，calu[M+3H]3+355.4，[M+4H]4+266.8，[M+5H]5+213.7;实施例36Lys-(D-Val)-Asn-Met-Lys-Ala-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO:分子质量1091.4.ESI-MSm/z:found[M+3H]3+364.8，[M+4H]4+273.8，calu[M+3H]3+364.8，[M+4H]4+273.8，[M+5H]5+219.3;实施例37Lys-(D-Leu)-Asn-Met-Lys-Ala-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO:29);理论相对5+213.9;30);理论相对5+216.7;31);理论相对5+216.7;32);理论相对5+223.5;33);理论相对5+213.5;:34);理论相对5+220.3，:35);理论相.[M+5H]5+214.7;36);理论相对5+213.7;37);理论相对5+219.3;38);理论相对分子质量1105.4.ESI-MSm/z:found[M+3H]3+369.5，[M+4H]4+277.3，calu[M+3H]3+369.5，[M+4H]4+277.2，[M+5H]5+222.2;实施例38Lys-(D-Ile)-Asn-Met-Lys-Ala-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO:分子质量1105.4.ESI-MSm/z:found[M+3H]3+369.5，[M+4H]4+277.3，calu[M+3H]3+369.6，[M+4H]4+277.3，[M+5H]5+222.0;实施例39Lys-(D-Phe)-Asn-Met-Lys-Ala-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO:分子质量1139.4.ESI-MSm/z:found[M+3H]3+380.8，[M+4H]4+285.8，calu[M+3H]3+380.8，[M+4H]4+285.8，[M+5H]5+228.9;实施例40Lys-(D-Pro)-Asn-Met-Lys-Ala-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO分子质量1089.3.ESI-MSm/z:found[M+3H]3+364.1，[M+4H]4+273.3，calu[M+3H]3+364.0，[M+4H]4+273.3，[M+5H]5+218.9;实施例41Lys-(D-Met)-Asn-Met-Lys-Ala-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO分子质量1123.4.ESI-MSm/z:found[M+3H]3+375.5，[M+4H]4+281.9，calu[M+3H]3+375.7，[M+4H]4+281.9，[M+5H]5+225.5;实施例42Lys-(D-Cys)-Asn-Met-Lys-Ala-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO分子质量1095.4.ESI-MSm/z:found[M+3H]3+366.1，[M+4H]4+274.8，calu[M+3H]3+366.1，[M+4H]4+274.8，[M+5H]5+220.0;实施例43Lys-Thr-(D-Ala)-Met-Lys-Ala-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO:分子质量1050.3.ESI-MSm/z:found[M+3H]3+351.1，[M+4H]4+263.6，calu[M+3H]3+351.1，[M+4H]4+263.6，[M+5H]5+211.1;实施例44Lys-Thr-(D-Val)-Met-Lys-Ala-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO:分子质量1078.4.ESI-MSm/z:found[M+3H]3+360.5，[M+4H]4+270.6，calu[M+3H]3+360.5，[M+4H]4+270.6，[M+5H]5+216.7;实施例45Lys-Thr-(D-Leu)-Met-Lys-Ala-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO分子质量1092.4.ESI-MSm/z:found[M+3H]3+365.1，[M+4H]4+274.1，calu[M+3H]3+365.1，[M+4H]4+274.0，[M+5H]5+219.5;实施例46Lys-Thr-(D-Ile)-Met-Lys-Ala-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO:分子质量1092.4.ESI-MSm/z:found[M+3H]3+365.1，[M+4H]4+274.1，calu[M+3H]3+365.1，[M+4H]4+274.0，[M+5H]5+219.6;实施例475+222.1;39);理论相对5+222.1;40);理论相对5+228.9;41);理论相对5+218.9;:42);理论相对5+225.7;:43);理论相对5+220.1;44);理论相对5+21U;45);理论相对5+216.7;:46);理论相对5+219.5;47);理论相对5+219.5;Lys-Thr-(D-Phe)-Met-Lys-Ala-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO:分子质量1126.4.ESI-MSm/z:found[M+3H]3+376.5，[M+4H]4+282.6，calu[M+3H]3+376.6，[M+4H]4+282.7，[M+5H]5+226.3;实施例48Lys-Thr-(D-Pro)-Met-Lys-Ala-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO:分子质量1076.3.ESI-MSm/z:found[M+3H]3+359.8，[M+4H]4+270.1，calu[M+3H]3+359.8，[M+4H]4+270.0，[M+5H]5+216.4;实施例49Lys-Thr-(D-Met)-Met-Lys-Ala-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO分子质量1110.4.ESI-MSm/z:found[M+3H]3+371.1，[M+4H]4+278.6，calu[M+3H]3+371.0，[M+4H]4+278.6，[M+5H]5+223.1;实施例50Lys-Thr-(D-Cys)-Met-Lys-Ala-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO分子质量1082.4.ESI-MSm/z:found[M+3H]3+361.8，[M+4H]4+271.6，calu[M+3H]3+361.7，[M+4H]4+271.7，[M+5H]5+217.6;实施例51Lys-Thr-Gly-Met-Lys-(D-His)-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO:分子质量1102.3.ESI-MSm/z:found[M+3H]3+368.4，[M+4H]4+276.6，calu[M+3H]3+368.4，[M+4H]4+276.6，[M+5H]5+221.6;实施例52Lys-Thr-Gly-Met-Lys-(D-Lys)-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO:分子质量1093.4.ESI-MSm/z:found[M+3H]3+365.5，[M+4H]4+274.3，calu[M+3H]3+365.6，[M+4H]4+274.2，[M+5H]5+219.7;实施例53Lys-Thr-Gly-Met-Lys-(D-Arg)-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO对分子质量1121.4.ESI-MSm/z:found[M+3H]3+374.8，[M+4H]4+281.3，225.3;calu[M+3H]3+347.9，[M+4H]4+281.4，[M+5H]5+225.1;实施例54Lys-Thr-Gly-Met-Lys-(D-Met)-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO分子质量1096.4.ESI-MSm/z:found[M+3H]3+366.5，[M+4H]4+275.1，calu[M+3H]3+366.6，[M+4H]4+275.0，[M+5H]5+220.5;实施例55MC-JJ62及其类似物体内降糖活性实验取IO周龄雄性昆明小鼠(体重lS22g)，随机分组，每组6只，氧嘧啶给药建模，给药剂量为60mg/kg，72小时后，小鼠禁食56小时测血糖挑选血糖值范围在1323的小鼠随机分组，每组6只。成模后的小鼠连续10d腹腔注射MC-JJ62多肽及其类似物。在0，30，60，90，120用血糖仪测定血糖值。如表1所示，MC-JJ62多肽及其类似物的降血糖活性强于二甲双胍。表1MC-JJ62及其类似物降血糖的效应48);理论相对5+226.3;49);理论相对5+216.3;50);理论相对5+223.1;51);理论相对5+217.5;52);理论相对5+221.5;53);理论相对5+219.7;54);理论相5+55);理论相对5+220.3;尾静脉注射四17<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>n=6，x±s.*P<0.05，"P<0.01，"*P<0.001vssaline序列表<110>中国药科大学<120>微波促进固相合成苦瓜MC-JJ62多肽类似物及其应用<160>11<210>1<211>116<212>PRT<213>人工序列<220><221>合成构建体<222>(1)..(1)<223>第1位的Xaa是Lys，D-Lys，D-Ala，D-Val，D-Leu，D-IleD-Phe，D-Pro，D-Met或D-Cys;<220><221>合成构建体<222>(2)..(2)<223>第2位的Xaa是Thr，D-Lys，D-Ala，D-Val，D-Leu，D-IleD-Phe，D-Pro，D-Met或D-Cys;<220><221>合成构建体<222>(3)..(3)<223>第3位的Xaa是Asn，D-Lys，D-Ala，D-Val，D-Leu，D-IleD-Phe，D-Pro，D-Met或D-Cys;<220><221>合成构建体<222>(4)..(4)<223>第4位的Xaa是Ala或Gly<400>1<210>2<211>116<212>PRT<213>人工序列<220><221>合成构建体<222>(1)..(1)<223>第1位的Xaa是D-Lys，D-Ala，D-Val，D-Leu，D-IleD-Phe，D-Pro，D-Met，D-Cys或Lys;<400>2(D-Lys)ThrAsnMetLysGlyMetAlaGlyAlaAla1510<210>3<211>11<212>PRT<213>人工序列<400>3(D-Ala)ThrAsnMetLysGlyMetAlaGlyAlaAla1510<210>4<211>11<212>PRT<213>人工序列<400>4(D-Val)ThrAsnMetLysGlyMetAlaGlyAlaAla1510<210>5<211>11<212>PRT<213>人工序列<400>5(D-Leu)ThrAsnMetLysGlyMetAlaGlyAlaAla1510<210>6<211>11<212>PRT<213>人工序列<400>6(D-Ile)Thi.AsnMetLysGlyMetAlaGlyAlaAla1510<210>7<211>11<212>PRT<213>人工序列<400>7(D-Phe)ThrAsnMetLysGlyMetAlaGlyAlaAla1510<210>8<211>11<212>PRT<213>人工序列<400>8(D-Pro)ThrAsnMetLysGlyMetAlaGlyAlaAla1510<210>9<211>11<212>PRT<213>人工序列<400>9(D-Met)ThrAsnMetLysGlyMetAlaGlyAlaAla1510<210>10<211>11<212>PRT<213>人工序列<400>10(D-Cys)ThrAsnMetLysGlyMetAlaGlyAlaAla1510<210>1120<211>11<212>PRT<213>人工序列<400>11Lys(D-Ala)AsnMetLysGlyMetAlaGlyAlaAla1510<210>12<211>11<212>PRT<213>人工序列<400>12Lys(D-Val)AsnMetLysGlyMetAlaGlyAlaAla1510<210>13<211>11<212>PRT<213>人工序列<400>13Lys(D-Leu)AsnMetLysGlyMetAlaGlyAlaAla1510<210>14<211>11<212>PRT<213>人工序列<400>14Lys(D-Ile)AsnMetLysGlyMetAlaGlyAlaAla1510<210>15<211>11<212>PRT<213>人工序列<400>15Lys(D-Phe)AsnMetLysGlyMetAlaGlyAlaAla1510<210>16<211>11<212>PRT<213>人工序列<400>16Lys(D-Pro)AsnMetLysGlyMetAlaGlyAlaAla1510<210>17<211>11<212>PRT<213>人工序列<400>17Lys(D-Met)AsnMetLysGlyMetAlaGlyAlaAla1510<210>18<211>11<212>PRT<213>人工序列<400>18Lys(D-Cys)AsnMetLysGlyMetAlaGlyAlaAla1510<210>19<211>11<212>PRT<213>人工序列<400>19LysThr(D-Ala)MetLysGlyMetAlaGlyAlaAla1510<210>20<211>11<212>PRT<213>人工序列<400>20LysThr(D-Val)MetLysGlyMetAlaGlyAlaAla1510<210>21<211>11<212>PRT<213>人工序列<400>21LysThr(D-Leu)MetLysAlaMetAlaGlyAlaAla1510<210>22<211>11CN<212>PRT<213>人工序列<400>22LysThr(D-Ile)MetLysGlyMetAlaGlyAlaAla1510<210>23<211>11<212>PRT<213>人工序列<400>23LysThr(D-Phe)MetLysGlyMetAlaGlyAlaAla1510<210>24<211>11<212>PRT<213>人工序列<400>24LysThr(D-Pro)MetLysGlyMetAlaGlyAlaAla1510<210>25<211>11<212>PRT<213>人工序列<400>25LysThr(D-Met)MetLysGlyMetAlaGlyAlaAla1510<210>26<211>11<212>PRT<213>人工序列<400>26LysThr(D-Cys)MetLysAlaMetAlaGlyAlaAla1510<210>27<211>11<212>PRT<213>人工序列<400>27(D-Lys)ThrAnsMetLysAlaMetAlaGlyAlaAla231510<210>28<211>11<212>PRT<213>人工序列<400>28(D-Ala)ThrAnsMetLysAlaMetAlaGlyAlaAla1510<210>29<211>11<212>PRT<213>人工序列<400>29(D-Val)Thi.AnsMetLysAlaMetAlaGlyAlaAla1510<210>30<211>11<212>PRT<213>人工序列<400>30(D-Leu)ThrAnsMetLysAlaMetAlaGlyAlaAla1510<210>31<211>11<212>PRT<213>人工序列<400>31(D-Ile)ThrAnsMetLysAlaMetAlaGlyAlaAla1510<210>32<211>11<212>PRT<213>人工序列<400>32(D-Phe)Thi.AnsMetLysAlaMetAlaGlyAlaAla1510<210>33<211>11<212>PRT<213>人工序列<400>33(D-Pro)ThrAnsMetLysAlaMetAlaGlyAlaAla1510<210>34<211>11<212>PRT<213>人工序列<400>34(D-Met)Thi.AnsMetLysAlaMetAlaGlyAlaAla1510<210>35<211>11<212>PRT<213>人工序列<400>35(D-Cys)ThrAnsMetLysAlaMetAlaGlyAlaAla1510<210>36<211>11<212>PRT<213>人工序列<400>36Lys(D-Ala)AsnMetLysAlaMetAlaGlyAlaAla1510<210>37<211>11<212>PRT<213>人工序列<400>37Lys(D-Val)AsnMetLysAlaMetAlaGlyAlaAla1510<210>38<211>11<212>PRT<213>人工序列<400>38Lys(D-Leu)AsnMetLysAlaMetAlaGlyAlaAla1510<210>39<211>11<212>PRT<213>人工序列<400>39Lys(D-Ile)AsnMetLysAlaMetAlaGlyAlaAla1510<210>40<211>11<212>PRT<213>人工序列<400>40Lys(D-Phe)AsnMetLysAlaMetAlaGlyAlaAla1510<210>41<211>11<212>PRT<213>人工序列<400>41Lys(D-Pro)AsnMetLysAlaMetAlaGlyAlaAla1510<210>42<211>11<212>PRT<213>人工序列<400>42Lys(D-Met)AsnMetLysAlaMetAlaGlyAlaAla1510<210>43<211>11<212>PRT<213>人工序列<400>43Lys(D-Cys)AsnMetLysAlaMetAlaGlyAlaAla1510<210>44<211>11<212>PRT<213>人工序列26<400>44LysThr(D-Ala)MetLysAlaMetAlaGlyAlaAla1510<210>45<211>11<212>PRT<213>人工序列<400>45LysThr(D-Val)MetLysAlaMetAlaGlyAlaAla1510<210>46<211>11<212>PRT<213>人工序列<400>46LysThr(D-Leu)MetLysAlaMetAlaGlyAlaAla1510<210>47<211>11<212>PRT<213>人工序列<400>47LysThr(D-Ile)MetLysAlaMetAlaGlyAlaAla1510<210>48<211>11<212>PRT<213>人工序列<400>48LysThr(D-Phe)MetLysAlaMetAlaGlyAlaAla1510<210>49<211>11<212>PRT<213>人工序列<400>49LysThr(D-Pro)MetLysAlaMetAlaGlyAlaAla1510<210>50<211>11<212>PRT<213>人工序列<400>50LysThr(D-Met)MetLysAlaMetAlaGlyAlaAla1510<210>51<211>11<212>PRT<213>人工序列<400>51LysThr(D-Cys)MetLysAlaMetAlaGlyAlaAla1510<210>52<211>11<212>PRT<213>人工序列<400>52LysThrGlyMetLys(D-His)MetAlaGlyAlaAla1510<210>53<211>11<212>PRT<213>人工序列<400>53LysThrGlyMetLys(D-Lys)MetAlaGlyAlaAla1510<210>54<211>11<212>PRT<213>人工序列<400>54LysThrGlyMetLys(D-Arg)MetAlaGlyAlaAla1510<210>55<211>11<212>PRT<213>人工序列<400>55LysThrGlyMetLys(D-Met)MetAlaGlyAlaAla1510权利要求一种具有降血糖活性的含有式I(SEQ.IDNO1)结构的苦瓜MC-JJ62多肽类似物，得到的苦瓜MC-JJ62多肽类似物；其特征在于其结构具有以下形式Xaa1-Xaa2-Xaa3-Met-Lys-Xaa4-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO1)Xaa1Lys，D-Lys，D-Ala，D-Val，D-Leu，D-IleD-Phe，D-Pro，D-Met或D-Cys；Xaa2Thr，D-Lys，D-Ala，D-Val，D-Leu，D-IleD-Phe，D-Pro，D-Met或D-Cys；Xaa3Asn，D-Lys，D-Ala，D-Val，D-Leu，D-IleD-Phe，D-Pro，D-Met或D-Cys；Xaa4Ala或Gly。2.根据权利要求1所述的多肽，具有如下序列(D-Lvs)-Thr-Asn-Met-Lvs-Glv-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO:2)(D-AlaVThr-Asn-Met-Lvs-Glv-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO:3)(D-Val)-Thr-Asn-Met-Lvs-Glv-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO:4)(D-Leu)-Thr-Asn-Met-Lvs-Glv-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO:5)(D-Ile)-Thr-Asn-Met-Lvs-Glv-Met-Ala-Glv-Ala-Ala(SEQ.IDNO:6)(D-Phe)Thr-Asn-Met-Lvs-Glv-Met-Ala-Glv-Ala-Ala(SEQ.IDNO:7)(D-ProVThr-Asn-Met-Lvs-Glv-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO:8)(D-MetVThr-Asn-Met-Lvs-Glv-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO:9)(D-Cvs)-Thr-Asn-Met-Lvs-Glv-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO:10)Lys-(D-Ala)-Asn-Met-Lvs-Glv-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO:11)Lvs-rD-Val)-Asn-Met-Lvs-Glv-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO:12)Lvs-(D-LeuVAsn-Met-Lvs-Glv-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO:13)Lvs-(D-IleVAsn-Met-Lvs-Glv-Met-Ala-Glv-Ala-Ala(SEQ.IDNO:14)Lvs-(D-Phe)-Asn-Met-Lvs-Glv-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO:15)Lvs-(D-Pro)-Asn-Met-Lvs-Glv-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO:16)Lys-(D-Met)-Asn-Met-Lvs-Glv-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO:17)Lvs-(D-Cvs)-Asn-Met-Lvs-Glv-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO:18)Lvs-Thr-(D-AlaVMet-Lvs-Glv-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO:19)Lvs-Thr-(D-Val)-Met-Lvs-Glv-Met-Ala-Glv-Ala-Ala(SEQ.IDNO:20)Lvs-Thr-(D-Leu)-Met-Lvs-Glv-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO:21)Lvs-Thr-rD-Ile)-Met-Lvs-Glv-Met-Ala-Glv-Ala-Ala(SEQ.IDNO:22)Lys-Thr-(D-PheVMet-Lvs-Glv-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO:23)Lvs-Thr-(D-Pro)-Met-Lvs-Ala-Met-Ala-Glv-Ala-Ala(SEQ.IDNO:24)Lvs-Thr-(D-Met)-Met-Lvs-Ala-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO:25)Lvs-Thr-(D-CvsVMet-Lvs-Ala-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO:26)(D-Lvs)Thr-Ans-Met-Lvs-Ala-Met-Ala-Glv-Ala-Ala(SEQ.IDNO:27)(D-Ala)Thr-Ans-Met-Lvs-Ala-Met-Ala-Glv-Ala-Ala(SEQ.IDNO:28)(D-Val)Thr-Ans-Met-Lvs-Ala-Met-Ala-Glv-Ala-Ala(SEQ.IDNO:29)(D-Leu)Thr-Ans-Met-Lvs-Ala-Met-Ala-Glv-Ala-Ala(SEQ.IDNO:30)(D-Ile)Thr-Ans-Met-Lvs-Ala-Met-Ala-Glv-Ala-Ala(SEQ.IDNO:31)(D-Phe)Thr-Ans-Met-Lvs-Ala-Met-Ala-Glv-Ala-Ala(SEQ.IDNO:32)(D-Pro)Thr-Ans-Met-Lys-Ala-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO:33)(D-Met)Thr-Ans-Met-Lvs-Ala-Met-Ala-Glv-Ala-Ala(SEQ.IDNO:34)m-Cvs)Thr-Ans-Met-Lvs-Ala-Met-Ala-Glv-Ala-Ala(SEQ.IDNO:35)Lvs-(D-Ala)-Asn-Met-Lvs-Ala-Met-Ala-Glv-Ala-Ala(SEQ.IDNO:36)Lvs-rD-ValVAsn-Met-Lvs-Ala-Met-Ala-Glv-Ala-Ala(SEQ.IDNO:37)Lvs-rD-LeuVAsn-Met-Lvs-Ala-Met-Ala-Glv-Ala-Ala(SEQ.IDNO:38)Lys-(D-Ile)-Asn-Met-Lys-Ala-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO:39)Lvs-(D-Phe)-Asn-Met-Lvs-Ala-Met-Ala-Glv-Ala-Ala(SEQ.IDNO:40)Lvs-rD-ProVAsn-Met-Lvs-Ala-Met-Ala-Glv-Ala-Ala(SEQ.IDNO41)Lvs-(D-Met)-Asn-Met-Lvs-Ala-Met-Ala-Glv-Ala-Ala(SEQ.IDNO:42)Lvs-rD-CvsVAsn-Met-Lvs-Ala-Met-Ala-Glv-Ala-Ala(SEQ.IDNO:43)Lys-Thr-(D-Ala)-Met-Lys-Ala-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO:44)Lys-Thr-(D-Val)-Met-Lys-Ala-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO:45)Lvs-Thr-rD-LeuVMet-Lvs-Ala-Met-Ala-Glv-Ala-Ala(SEQ.IDNO46)Lys-Thr-(D-Ile)-Met-Lys-Ala-Met-Ala-Gly-Ala-Ala〔SEQ.IDNO:47)Lvs-Thr-rD-PheVMet-Lvs-Ala-Met-Ala-Glv-Ala-Ala(SEQ.IDNO:48)Lys-Thr-(D-Pro)-Met-Lys-Ala-Met-Ala-Gly-Ala-Ala(SEQ.IDNO:49)Lvs-Thr-rD-MeO-Met-Lvs-Ala-Met-Ala-Glv-Ala-Ala(SEQ.IDNO50)Lvs-Thr-rD-CvsVMet-Lvs-Ala-Met-Ala-Glv-Ala-Ala(SEQ.IDNO51)Lvs-Thr-Glv-Met-Lvs-(D-HisVMet-Ala-Glv-Ala-Ala(SEQ.IDNO:52)Lvs-Thr-Glv-Met-Lvs-①-LvsVMet-Ala-Glv-Ala-Ala(SEQ.IDNO:53)Lvs-Thr-Glv-Met-Lvs-rD-ArpVMet-Ala-Glv-Ala-Ala(SEQ.IDNO54)Lvs-Thr-Glv-Met-Lvs-①-MetVMet-Ala-Glv-Ala-Ala(SEQ.IDNO:55)。3.—种药物组合物，包括治疗有效量的权利要求1中所述的MC-JJ62多肽类似物或者其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体或稀释剂。4.权利要求1中所述的MC-JJ62多肽类似物或者其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体或稀释剂在制备用于治疗糖尿病的药物中的运用。5.权利要求1中所述的MC-JJ62多肽类似物的制备方法，其特征在于采用微波促进Fmoc/tBu正交保护固相合成策略，于固相载体上先合成得到载有第一个Fmoc保护氨基酸的树脂，茚三酮法检测为阴性后脱去Fmoc保护基得到载有第一个氨基酸残基的树脂；再进入下一个偶联循环，按照相应的肽序用不同的保护氨基酸重复偶联和脱保护的步骤，依次延长所需的氨基酸序列，合成得到载有相应多肽的树脂，最后用裂解剂将多肽从树脂上切割下来得到多肽粗品。粗品经制备级高效液相色谱纯化，冻干得多肽纯品。6.根据权利要求5中所述微波促进固相合成MC-JJ62多肽类似物方法，其特征是载有第一个Fmoc保护氨基酸的树脂的制备方法，是通过在微波照射条件下Fmoc保护氨基酸先经活化剂活化后再与固相载体偶合得到，反应中加入1-羟基-苯并三氮唑(HOBT)或其衍生物抑制消旋，并使用有机碱中和反应的酸性。7.根据权利要求6所述的载有第一个Fmoc保护氨基酸的树脂的制备方法，其特征在于使用的固相载体是Rink树脂、Wang树脂或2-氯三苯甲基氯树脂；使用的活化剂是二环己基碳二亚胺(DCQ、N，N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)、N，N〃-羰基二咪唑(CDI)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)或6-氯苯并三氮唑-l，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯(HCTU);使用的1-羟基-苯并三氮唑(HOBT)衍生物为N-羟基琥珀酰亚胺(HOSU)、l-羟基-7-偶氮苯并三氮唑(HOAT)或3-羟基-l，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮(HOOBT);使用的有机碱为三乙胺(TEA)、N-甲基吗啉(NMM)或二异丙基乙胺(DIEA);微波促进条件是磁控管频率2450MHz，反应温度20100°C，反应时间为515min。8.根据权利要求5中所述微波促进固相合成MC-JJ62多肽类似物合成方法，其特征是Fmoc保护基的脱除是通过使用含有0.1mol丄—1的1-羟基-苯并三氮唑(HOBT)的六氢吡啶溶液在微波促进下反应，选用二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)、或N-甲基吡咯烷酮(NMP)为反应溶剂；微波促进条件是磁控管频率2450MHz，反应温度20100°C，反应时间为1lOmin。全文摘要本发明涉及新型高效降血糖苦瓜MC-JJ62多肽类似物及其微波促进固相合成方法。通过对天然苦瓜多肽的2，4，5，8或9位点进行改造得到具有更长药理作用时间的MC-JJ62多肽类似物；其化学合成是通过微波促进固相合成方法而得以高效快速实现，粗品经制备级高效液相纯化，最后冻干得到MC-JJ62多肽类似物。文档编号A61P3/10GK101691395SQ20091018332公开日2010年4月7日申请日期2009年9月17日优先权日2009年9月17日发明者张惠斌,朱孝云,王敬杰,纪剑峰,金晶,钱海,陈巍,陈鑫,黄文龙申请人:中国药科大学