壳聚糖修饰顺磁性金属离子磁共振成像对比剂的制备方法
专利名称：壳聚糖修饰顺磁性金属离子磁共振成像对比剂的制备方法
技术领域：
本发明涉及磁共振成像技术领域，尤其涉及一种新型磁共振成像对比剂的制备方法。
背景技术：
磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging, MRI)是一种利用生物体不同组织在外磁场影 响下产生不同磁共振信号来成像的医学影像技术。MRI具有无电离辐射、可实现多核与多参 数成像、无需改变体位便可实行任意方位层面的扫描、较高的空间分辨率和对比度而无骨质 伪影、能反映被检组织水质子周围环境并获取相关生理生化信息等优点，成为临床最有效的 诊断手段之一。为确保临床诊断的准确性，30%以上的MRI需要磁共振成像对比剂(简称 对比剂或称造影剂)来提高图像对比度，全球含钆金属离子对比剂(简称钆基对比剂)年销 量在30吨以上，系高附加值医药产品。优良的对比剂应具有i)足够的结构稳定性；ii)自身 低毒性；iii)驰豫效能高；iv)对组织器官有选择性(靶向性)；V)在体内有适当的存留时间且易 于从体内排出。钆基对比剂在磁共振成像对比剂中占据着重要的地位，相应的配体有二乙 三胺五乙酸(DTPA); 1,4,7,10-四氮杂环十二垸；1,4,7，10-四乙酸(DOTA)和乙二胺四乙酸
(EDTA)及它们的衍生物。已经进入临床应用的有Gd—DTPA (马根维显，Magnevist)， Gd—DTPA—BMA， Gd—D03A—HP (礼替醇，Prohance)， Gd—DOTA (Dotarem)。然而， 自1987年来发现钆基对比剂会对肾小管造成直接损害，近年来证实传统的钆基成像对比剂会 引起肾细胞纤维化。因此，怎样避免附加毒副作用是未来钆基对比剂的研发方向。目前国际 上的发展趋势还是在保障对比剂分子稳定、低毒、高弛豫率的基础上，追求针对特定组织及 器官设计合成选择性高、靶向性强的对比剂分子，包括对钆基磁共振成像对比剂的化学结构 修饰及探索新型超顺磁性(基于Fe304)对比剂和水溶性顺磁性对比剂。这些化合物可经过白 蛋白、葡聚糖、聚苯乙烯、单克隆抗体等的进一步化学物理修饰，增强靶向性。但由于大多 处于研发阶段，没有最后的定论，同时注意到寻求具有更低毒副作用的对比剂也是今后研究 的方向。
作为天然多糖的一种，壳聚糖属氨基直链多糖，属纯天然丰产可再生绿色资源。选择壳 聚糖来修饰对比剂是因为其具有很多优良特性，如i)自身零毒性、良好的水溶性以及与重 金属离子的亲和特性；ii)与多胺多酸对比剂类化合物容易通过共价键结合，结合后利用壳聚 糖的长链缠绕特性将螯合的顺磁性金属离子包在核心，同时增加弛豫效率；iii)进入体内后 壳聚糖会降解，但需要一定时间，保证对比剂的金属离子在体内存留时处于包裹状态不外泄;W)壳聚糖聚合度在12 6时与人体血清蛋白等运送蛋白的结合能力最强，可在成像测定结 束后将未完全降解的对比剂代谢排出体外；v)糖类化合物对不同器官或病灶器官会有不同的 亲和能力，以此提高对比剂的靶向性；vi)壳聚糖自身还能提高生命体的免疫力，并具有一 定的抗癌作用，有望增强协同作用；vii)壳聚糖易于加工成微胶囊，因此在剂型制备方面也 有着优势。这些特点很符合作为MRI对比剂的先决条件。另外从目前对葡聚糖和其他糖类化 合物的造影对比性能研究来看，壳聚糖极其有望成为一种新型、性能优良的MRI对比剂。
本方法将通过多胺多酸化合物的酸酐与壳聚糖氨基通过共价键结合起来，再络合稀土或 过渡金属等顺磁性离子，如钆、铁、锰等，使之成为具有一定靶向性和适宜体内滞留时间、 弛豫效率高于马根维显、毒性小的新型磁共振成像对比剂。其优势还在于i)酰胺键键联 的壳聚糖自身无毒性，可减少药物申报程序环节，容易上市；ii)糖类分子对不同器官组织和 病灶有识别作用，提高相应的选择性；iii)用马根维显l/4至2/3的含钆量就可达到同样的成 像对比效果，可进一步减少金属离子在体内可能引起毒性的风险；iv)加工制备工艺简单， 设备要求低，易于加工生产。
发明内容
本发明的目的是为了降低传统钆基对比剂对器官产生的毒副作用，提供一种潜在新功能 核磁共振成像对比剂及其制备方法，在提高弛豫效率、延长体内弛豫时间的同时改良对不同 器官组织或病灶的选择性，并降低毒副作用。
本发明壳聚糖修饰顺磁性金属离子磁共振成像对比剂的制备方法如下-(l)在反应容器中，加入一定质量的多胺多羧酸固体，然后再分别加入一定体积的无水乙 酸酐，其中所述的多胺多羧酸可以是二乙三胺五乙酸(DTPA)或者乙二胺四乙酸(EDTA)，其中 多胺多羧酸和无水乙酸酐的比值(质量:体积)为1:1~3，再加入一定体积的无水吡啶作为催化 剂，通干燥氮气保护，在55 60'C下搅拌反应24h后抽滤，分别用无水乙酸酐、无水N,N，-二甲基甲酰胺(DMF)和无水乙醚洗涤，得到多胺多羧酸的相应酸酐，所得到的多胺多羧酸的 酸酐是二乙三胺五乙酸酸酐(DTPAA)或者乙二胺四乙酸酸酐(EDTAA)。
(2)在无水N,N'-二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基亚砜(DMSO)中加入水溶性壳聚糖或窄分子 量分布水溶性壳聚糖，再加入4-二甲氨基吡啶或三乙胺或吡啶作为催化剂，常温搅拌下加入 步骤(l)中制备得到的多胺多羧酸酸酐，其中壳聚糖与多胺多羧酸酸酐的摩尔比为1:1 5，于 室温下搅拌36 72h，冰浴冷却后加入蒸馏水继续搅拌12 120h。真空浓縮至小体积，加入 无水乙醇沉析出淡黄色固体，真空干燥。
4(3)称取Sephadex G-25型凝胶，活化后装柱。将步骤(2)中所得到的固体溶解于少量蒸馏 水中，其中固体与蒸馏水比值(质量:体积)为1:2 100，上柱，以蒸馏水为洗脱溶剂，0.1%茚 三酮正丁醇溶液显色，用紫外分析仪进行检测(检测波长为254nm)，在洗脱的过程中出现两 个洗脱峰，配体的洗脱峰首先出柱，将其收集后真空浓缩至小体积，冷却后加入无水乙醇得 淡黄色沉淀，过滤，真空干燥得配体粉末。 (4)称取步骤(3:i中所得到的配体粉末溶解于蒸馏水中，其中配体粉末与蒸馏水比值(质量:体积) 为1:5 20，搅拌下加入金属无机盐，配体与金属无机盐的摩尔比为1:1 5，于室温下持续 搅拌2 24h，将溶液真空浓縮，冷却后加入无水乙醇沉淀，洗涤过滤，干燥后得到磁共振成 像对比剂的固体粉末0.3 3.0g。其中所述的金属无机盐为所有顺磁性稀土及过渡金属离子的 盐类，包括含不同结晶水的盐酸盐、硝酸盐、乙酸盐、硫酸盐或高氯酸盐，优选Gc^+的盐类， M^+的盐类、F^+的盐类。
本发明与现有技术相比具有以下显著优点
l)在常温下反应，反应操作与所需设备简单，成本低廉，易于实现规模化生产；2)产品水溶 性好，弛豫率为10 14Lmmor^s—、是Gd-DTPA弛豫率的1 3倍；3)对肝脏和肾脏组织有 着靶向性的选择，可有效的提高肝脏和肾脏的造影对比的清晰度；4)与马根维显对照对比的 小鼠体内试验结果表明，停药后30天钆离子在肝和肾脏的残留可降低2/5 2/3; 5)壳聚糖是 天然丰产可再生绿色资源，具有良好的生物相容性和降解性，自身无毒无害。
具体实施实例 实例l
水溶性壳聚糖的制备方法如下称取一定质量的高分子量壳聚糖于三口烧瓶中，加入一
定体积的体积分数为0.5%的乙酸溶液，其中壳聚糖与乙酸的比值(质量:体积)为1:50，在搅拌 下,加入一定体积的质量分数为10。/。的双氧7jC,其中壳聚糖与双氧水的比值(质量:体积)为1:1， 搅拌约10min。将所得到的溶液进行微波处理，设置微波参数(微波时间:30min,微波温度:60 'C)，微波结束后，静置冷却，调节pH至中性。再将所得到的溶液真空浓縮至一定体积，加 入乙醇沉析出固体，再用乙醚洗涤，真空干燥，即得到平均分子量为1980(聚合度为11，分 子量分布指数(DPI或Mw/M )= 1.9)的水溶性壳聚糖。
(l)在三颈烧瓶中，加入一定质量的二乙三胺五乙酸(DTPA)固体，然后加入一定体积的无 水乙酸酐，其中DTPA与无水乙酸酐的比值(质量:体积)为1:1,再加入一定体积的无水吡瞎作 为催化剂，通干燥氮气保护，在55 6(TC下搅拌反应24h后抽滤，分别用无水乙酸酐、无水 N,N，-二甲基甲酰胺(DMF)和无水乙醚洗涤，得到多胺多羧酸的酸酐DTPAA的白色固体
5粉末。(2)在无水N,N'-二甲基甲酰胺(DMF)中加入步骤(1)中制备得到的壳聚糖，再加入4-二 甲氨基吡啶作为催化剂，常温搅拌下加入步骤(l)中制备得到的多胺多羧酸酸酐，其中壳聚糖 与多胺多酸酸酐的摩尔比为1:1，于室温下搅拌36h，冰浴冷却后加入蒸馏水继续搅拌12h。 真空浓缩至小体积，加入无水乙醇沉析出淡黄色固体，真空干燥。(3)称取Sephadex G-25型 凝胶，活化后装柱。将步骤(2)中所得到的固体溶解于少量蒸馏水中，其中固体与蒸馏水比值 (质量:体积)为1:2，上柱，以蒸馏水为洗脱溶剂，0.1%茚三酮正丁醇溶液显色，用紫外分析 仪进行检测(波长为254nm),在洗脱的过程中出现两个洗脱峰，配体的洗脱峰首先出柱，将 其收集后真空浓縮至小体积，冷却后加入无水乙醇得淡黄色沉淀，过滤，真空干燥得配体粉 末。(4)称取步骤(3)中所得到的配体粉末溶解于蒸馏水中，其中配体粉末与蒸馏水比值(质量: 体积)为1:5，搅拌下加入金属无机盐GdCl3，6H20，其中配体与GdCl3*6H20的摩尔比为1:1， 于室温下持续搅拌2h,将溶液真空浓縮，冷却后加入无水乙醇沉淀，洗涤过滤，干燥后得到 磁共振成像对比剂的固体粉末l.Og左右。 实例2
(l)在三颈烧瓶中，加入一定质量的二乙三胺五乙酸(DTPA)固体，然后加入一定体积的 无水乙酸酐，其中DTPA与无水乙酸酐的比值(质量:体积)为1:3，再加入一定体积无水吡咬作 为催化剂，通干燥氮气保护，在55 6(TC下搅拌反应24h后抽滤，分别用无水乙酸酐、无水 N,N'-二甲基甲酰胺(DMF)和无水乙醚洗涤，得到多胺多羧酸的酸酐DTPAA的白色固体粉末。 (2)在无水N,N'-二甲基甲酰胺(DMF)中加入平均分子量为1460(聚合度为8，分子量分布指数 (DPI或Mw/M"^ 1.06)的水溶性壳聚糖(该原料由海南省精细化工重点实验室提供，制备方法 同实例l)，再加入4-二甲氨基吡啶作为催化剂，常温搅拌下加入歩骤(l)中制备得到的多胺多 羧酸酸酐，其中壳聚糖与多胺多酸酸酐DTPAA的摩尔比为1:5，于室温下搅拌72 h，冰浴冷 却后加入蒸馏水继续搅拌120h。真空浓縮至小体积，加入无水乙醇沉析出淡黄色固体，真空 干燥。(3)称取Sephadex G-25型凝胶，活化后装柱。将步骤(2)中所得到的固体溶解于少量蒸 馏水中，其中固体与蒸馏水比值(质量:体积)为1:100，上柱，以蒸馏水为洗脱溶剂，0.1%茚 三酮正丁醇溶液显色，用紫外分析仪进行检测(波长为254nm)，在洗脱的过程中出现两个洗 脱峰，配体的洗脱峰首先出柱，将其收集后真空浓缩至小体积，冷却后加入无水乙醇得淡黄 色沉淀，过滤，真空干燥得配体粉末。(4)称取步骤(3)中所得到的配体粉末溶解于蒸馏水中， 其中配体粉末与蒸馏水比值(质量:体积)为1:20,搅拌下加入金属无机盐MnCl2*4H20，其中配 体与MnC1^4H20的摩尔比为1:5，于室温下持续搅拌24h，将溶液真空浓縮，冷却后加入无 水乙醇沉淀，洗涤过滤，干燥后得到磁共振成像对比剂的固体粉末l.Og。实例3
(l)在三颈烧瓶中，加入二乙三胺五乙酸(DTPA)固体，然后加入一定体积的无水乙酸酐， 其中DTPA与无水乙酸酐的比值(质量:体积)为1:1，再加入一定体积的无水吡啶作为催化剂， 通干燥氮气保护，在55 60'C下搅拌反应24h后抽滤，分别用无水乙酸酐、无水N，N，-二甲 基甲酰胺(DMF)和无水乙醚洗涤，得到多胺多羧酸的酸酐DTPAA的白色固体粉末。(2)在无 水二甲基亚砜(DMSO)中加入平均分子量为1080(聚合度为6，分子量分布指数(DPI或Mw/M"一 1.03)的水溶性壳聚糖(该原料由海南省精细化工重点实验室提供，制备方法同实例1)，再加入 三乙胺作为催化剂，常温搅拌下加入步骤(l)中制备得到的多胺多羧酸酸酐，其中壳聚糖与多 胺多酸酸酐DTPAA的摩尔比为1:1，于室温下搅拌36h,冰浴冷却后加入蒸馏水继续搅拌12 h。真空浓縮至小体积，加入无水乙醇沉析出淡黄色固体，真空干燥。(3)称取Sephadex G-25 型凝胶，活化后装柱。将步骤(2)中所得到的固体溶解于少量蒸馏水中，其中固体与蒸馏水比 值(质量:体积)为1:2,上柱，以蒸馏水为洗脱溶剂，0.1%茚三酮正丁醇溶液显色，用紫外分 析仪进行检测(波长为254nm)，在洗脱的过程中出现两个洗脱峰，配体的洗脱峰首先出柱， 将其收集后真空浓縮至小体积，冷却后加入无水乙醇得淡黄色沉淀，过滤，真空千燥得配体 粉末。(4)称取步骤(3)中所得到的配体粉末溶解于蒸馏水中，其中配体粉末与蒸馏水比值(质 量:体积)为1:5，搅拌下加入金属无机盐GdCl3.6H20，其中配体与GdCl3.6H20的摩尔比为1:1， 于室温下持续搅拌2h，将溶液真空浓縮，冷却后加入无水乙醇沉淀，洗涤过滤，千燥后得到 磁共振成像对比剂的固体粉末0.5g左右。 实例4
(l)在三颈烧瓶中，加入乙二胺四乙酸(EDTA)固体，然后加入一定体积的无水乙酸酐， 其中EDTA与无水乙酸酐的比值(质量:体积)为1:3，再加入一定体积的无水吡啶作为催化剂， 通干燥氮气保护，在55 60'C下搅拌反应24h后抽滤，分别用无水乙酸酐、无水N，N，-二甲 基甲酰胺(DMF)和无水乙醚洗涤，得到多胺多羧酸的酸酐EDTAA的白色固体粉末。(2)在无 水N,N'-二甲基甲酰胺(DMF)中加入平均分子量为1080(聚合度为6，分子量分布指数(DPI或 MUM。"1.03)的水溶性壳聚糖(该原料由海南省精细化工重点实验室提供，制备方法同实例1)， 再加入4-二甲氨基吡啶作为催化剂，常温搅拌下加入步骤(l)中制备得到的多胺多羧酸酸酐， 其中壳聚糖与多胺多酸酸酐EDTAA的摩尔比为1:5，于室温下搅拌72 h，冰浴冷却后加入蒸 馏水继续搅拌120 h。真空浓縮至小体积，加入无水乙醇沉析出淡黄色固体，真空干燥。(3) 称取Sephadex G-25型凝胶，活化后装柱。将步骤(2)中所得到的固体用少量蒸馏水溶解，其 中固体与蒸馏水比值(质量:体积)为1:2，上柱，以蒸馏水为洗脱溶剂，0.1%茚三酮正丁醇溶
7液显色，用紫外分析仪进行检测(波长为254nm)，在洗脱的过程中出现两个洗脱峰，配体的 洗脱峰首先出柱，将其收集后真空浓縮至小体积，冷却后加入无水乙醇得淡黄色沉淀，过滤， 真空干燥得配体粉末。(4)称取步骤(3)中所得到的配体粉末溶解于蒸馏水中，其中配体粉末与 蒸馏水比值(质量:体积)为1:20，搅拌下加入金属无机盐GdCl3*6H20，其中配体与GdCl3*6H20 的摩尔比为1:5，于室温下持续搅拌24h，将溶液真空浓缩，冷却后加入无水乙醇沉淀，洗錄 过滤，干燥后得到磁共振成像对比剂的固体粉末1.5g左右。 实例5
(l)在三颈烧瓶中，加入乙二胺四乙酸(EDTA)固体，然后加入一定体积的无水乙酸酐，其 中EDTA与无水乙酸酐的比值(质量:体积)为1:3，再加入一定体积的无水吡啶作为催化剂， 通干燥氮气保护，在55 6(TC下搅拌反应24h后抽滤，分别用无水乙酸酐、无水N，N'-二甲 基甲酰胺(DMF)和无水乙醚洗涤，得到多胺多羧酸的酸酐EDTAA的白色固体粉末。(2)在无 水N，N'-二甲基甲酰胺(DMF)中加入平均分子量为1460(聚合度为8，分子量分布指数(DPI或
Mw/Mn"1.06)的水溶性壳聚糖(该原料由海南省精细化工重点实验室提供,制备方法同实例l)，
再加入吡啶作为催化剂，常温搅拌下加入步骤(l)中制备得到的多胺多羧酸酸酐，其中壳聚糖 与多胺多酸酸酐EDTAA的摩尔比为1:5，于室温下搅拌72h，冰浴冷却后加入蒸馏水继续搅 拌120h。真空浓縮至小体积，加入无水乙醇沉析出淡黄色固体，真空干燥。(3)称取Sephadex G-25型凝胶，活化后装柱。将步骤P)中所得到的固体溶解于少量蒸馏水中，其中固体与蒸馏 水比值(质量:体积)为1:100，上柱，以蒸馏水为洗脱溶剂，0.1%茚三酮正丁醇溶液显色，用 紫外分析仪进行检测(波长为254nm)，在洗脱的过程中出现两个洗脱峰，配体的洗脱峰首先 出柱，将其收集后真空浓縮至小体积，冷却后加入无水乙醇得淡黄色沉淀，过滤，真空干燥 得配体粉末。(4)称取步骤(3)中所得到的配体粉末溶解于蒸馏水中，其中配体粉末与蒸馏水比 值(质量:体积)为1:20，搅拌下加入金属无机盐MnCl2*4H20，其中配体与MnCl2 4H20的摩尔 比为1:5，于室温下持续搅拌24h，将溶液真空浓縮，冷却后加入无水乙醇沉淀，洗涤过滤， 干燥后得到磁共振成像对比剂的固体粉末1.5g左右。
实例6
(l)在三颈烧瓶中，加入二乙三胺五乙酸(DTPA)固体，然后加入一定体积的无水乙酸酐， 其中DTPA与无水乙酸酐的比值(质量:体积)为1:1，再加入一定体积的无水吡啶作为催化剂， 通干燥氮气保护，在55 60。C下搅拌反应24 h后抽滤，分别用无水乙酸酐、无水N,N'-二甲 基甲酰胺(DMF)和无水乙醚洗涤，得到多胺多羧酸的酸酐DTPAA的白色固体粉末。(2)在无 水二甲基亚砜(DMSO)中加入平均分子量为1980(聚合度为11，分子量分布指数(DPI或Mw/M""1.08)的水溶性壳聚糖(该原料由海南省精细化工重点实验室提供，制备方法同实例l)， 再加入4-二甲氨基吡啶作为催化剂，常温搅拌下加入步骤(l)中制备得到的多胺多羧酸酸酐， 其中壳聚糖与多胺多酸酸酐DTPAA的摩尔比为1:1，于室温下搅拌36h，冰浴冷却后加入蒸 馏水继续搅拌12h。真空浓縮至小体积，加入无水乙醇沉析出淡黄色固体，真空干燥。(3)称 取Sephadex G-25型凝胶，活化后装柱。将步骤(2)中所得到的固体溶解于少量蒸馏水中，其 中固体与蒸馏水比值(质量:体积)为1:2，上柱，以蒸馏水为洗脱溶剂，0.1%茚三酮正丁醇溶 液显色，用紫外分析仪进行检测(波长为254nm)，在洗脱的过程中出现两个洗脱峰，配体的 洗脱峰首先出柱，将其收集后真空浓缩至小体积，冷却后加入无水乙醇得淡黄色沉淀，过滤， 真空干燥得配体粉末。(4)称取步骤(3)中所得到的配体粉末溶解于蒸馏水中，其中配体粉末与 蒸馏水比值(质量:体积)为1:5,搅拌下加入金属无机盐GdCl3.6H20，其中配体与GdCl3.6H20 的摩尔比为l:l，于室温下持续搅拌2h，将溶液真空浓缩，冷却后加入无水乙醇沉淀，洗涤 过滤，干燥后得到磁共振成像对比剂的固体粉末1.2g左右。 实例7
(l)称取一定质量的高分子量壳聚糖于三口烧瓶中，加入一定体积的体积分数为0.5%的 乙酸溶液，其中壳聚糖与乙酸的比值(质量:体积)为1:50,在搅拌下，加入一定体积的10%双 氧7jC，其中壳聚糖与双氧水的比值(质量:体积)为1:1，搅拌约10min。将所得到的溶液进行微 波处理，设置微波参数(微波时间:30min，微波温度:6(TC),微波结束后，静置冷却，调节pH 至中性。再将所得到的溶液真空浓縮至小体积，加入乙醇沉析出固体，再用乙醚洗涤，真空 干燥，即得到平均分子量为1980(聚合度为11，分子量分布指数(DPI或Mw/M )= 1.9)的水溶 性壳聚糖。(2)在三颈烧瓶中，加入乙二胺四乙酸(EDTA)固体，然后加入一定体积的无水乙酸 酐，其中EDTA与无水乙酸酐的比值(质量:体积)为1:1,再加入一定体积的无水吡啶作为催 化剂，通干燥氮气保护，在55 60'C下搅拌反应24h后抽滤，分别用无水乙酸酐、无水N,N，-二甲基甲酰胺(DMF)和无水乙醚洗涤，得到多胺多羧酸的酸酐EDTAA的白色固体粉末。(3) 在无水N，N'-二甲基甲酰胺(DMF)中加入步骤(1)中制备得到的壳聚糖，再加入4-二甲氨基吡 啶作为催化剂，常温搅拌下加入步骤(2)中制备得到的多胺多羧酸酸酐，其中壳聚糖与多胺多 酸酸酐EDTAA的摩尔比为1:1，于室温下搅拌36h，冰浴冷却后加入蒸馏水继续搅拌12h。 真空浓縮至小体积，加入无水乙醇沉析出淡黄色固体，真空干燥。(4)称取Sephadex G-25型 凝胶，活化后装柱。将步骤(3)中所得到的固体溶解于少量蒸馏水中，其中固体与蒸馏水比值 (质量:体积)为1:100,上柱，以蒸馏水为洗脱溶剂，0.1%茚三酮正丁醇溶液显色，用紫外分 析仪进行检测(波长为254nm)，在洗脱的过程中出现两个洗脱峰，配体的洗脱峰首先出柱，
9将其收集后真空浓縮至小体积，冷却后加入无水乙醇得淡黄色沉淀，过滤，真空干燥得配体 粉末。(5)称取步骤(4)中所得到的配体粉末溶解于蒸馏水中，其中配体粉末与蒸馏水比值(质 量:体积)为1:5，搅拌下加入金属无机盐0(103.6&0，其中配体与0(103.61120的摩尔比为1:1， 于室温下持续搅拌2h，将溶液真空浓縮，冷却后加入无水乙醇沉淀，洗涤过滤，干燥后得到 磁共振成像对比剂的固体粉末l.Og左右。
权利要求
1、壳聚糖修饰顺磁性金属离子磁共振成像对比剂的制备方法，其特征在于按以下步骤进行(1)在反应容器中，加入一定质量的多胺多羧酸固体和一定体积的无水乙酸酐，再加入无水吡啶作为催化剂，通干燥氮气保护，在55～60℃下搅拌反应24h后抽滤，分别用无水乙酸酐、无水N，N’-二甲基甲酰胺和无水乙醚洗涤，得到多胺多羧酸的相应酸酐，其中多胺多羧酸和无水乙酸酐的比值以质量与体积比计为1∶1～3；(2)在无水N，N’-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜中加入水溶性壳聚糖或窄分子量分布水溶性壳聚糖，再加入4-二甲氨基吡啶或三乙胺或吡啶作为催化剂，常温搅拌下加入步骤(1)中制备得到的多胺多羧酸酸酐，其中壳聚糖与多胺多羧酸酸酐的摩尔比为1∶1～5，于室温下搅拌36～72h，冰浴冷却后加入蒸馏水继续搅拌12～120h，真空浓缩至小体积，加入无水乙醇沉析出淡黄色固体，真空干燥；(3)称取Sephadex G-25型凝胶，活化后装柱，将步骤(2)中所得到的固体溶解于少量蒸馏水中，其中固体与蒸馏水比值以质量与体积比计为1∶2～100，上柱，以蒸馏水为洗脱溶剂，0.1％茚三酮正丁醇溶液显色，用紫外分析仪进行检测，检测波长为254nm，在洗脱的过程中出现两个洗脱峰，配体的洗脱峰首先出柱，将其收集后真空浓缩至小体积，冷却后加入无水乙醇得淡黄色沉淀，过滤，真空干燥得配体粉末；(4)称取步骤(3)中所得到的配体粉末溶解于蒸馏水中，其中配体粉末与蒸馏水比值以质量与体积比计为1∶5～20，搅拌下加入金属无机盐，配体与金属无机盐的摩尔比为1∶1～5，于室温下持续搅拌2～24h，将溶液真空浓缩，冷却后加入无水乙醇沉淀，洗涤过滤，干燥后得到磁共振成像对比剂的固体粉末0.3～3.0g。
2、 根据权利要求l所述的壳聚糖修饰顺磁性金属离子磁共振成像对比剂的制备方法，其特征 在于多胺多羧酸可以是二乙三胺五乙酸或者乙二胺四乙酸。
3、 根据权利要求1所述的壳聚糖修饰顺磁性金属离子磁共振成像对比剂的制备方法，其特征 在于其中所述的金属无机盐可以是所有顺磁性稀土及过渡金属离子的盐类，包括含不同结晶 水的盐酸盐、硝酸盐、乙酸盐、硫酸盐或高氯酸盐，优选GcP的盐类，Mn"的盐类、Fe^的 盐类。
全文摘要
壳聚糖修饰顺磁性金属离子磁共振成像对比剂的制备方法，属于磁共振成像对比剂技术领域。按下步骤进行首先制备得到的多胺多羧酸的酸酐，在催化剂的作用下与水溶性壳聚糖或窄分子量分布水溶性壳聚糖反应，再经无水乙醇沉析出固体，将该固体过Sephadex G-25型凝胶柱，纯化得到壳聚糖的配体，再将该配体与顺磁性金属无机盐反应，最后无水乙醇沉淀，干燥后即可得到磁共振成像对比剂的固体粉末。本发明将通过多胺多酸化合物的酸酐与壳聚糖氨基通过共价键结合起来，再络合顺磁性的稀土或过渡金属离子，使之成为具有一定靶向性和适宜体内滞留时间、弛豫效率高于马根维显、毒性小的新型磁共振成像对比剂。本发明加工制备工艺简单，设备要求低，易于加工生产。
文档编号A61K49/06GK101642579SQ20091018420
公开日2010年2月10日 申请日期2009年8月14日 优先权日2009年8月14日
发明者岐 张, 顾海波, 燕 黄 申请人:江苏大学
技术领域：
本发明涉及磁共振成像技术领域，尤其涉及一种新型磁共振成像对比剂的制备方法。
背景技术：
磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging, MRI)是一种利用生物体不同组织在外磁场影 响下产生不同磁共振信号来成像的医学影像技术。MRI具有无电离辐射、可实现多核与多参 数成像、无需改变体位便可实行任意方位层面的扫描、较高的空间分辨率和对比度而无骨质 伪影、能反映被检组织水质子周围环境并获取相关生理生化信息等优点，成为临床最有效的 诊断手段之一。为确保临床诊断的准确性，30%以上的MRI需要磁共振成像对比剂(简称 对比剂或称造影剂)来提高图像对比度，全球含钆金属离子对比剂(简称钆基对比剂)年销 量在30吨以上，系高附加值医药产品。优良的对比剂应具有i)足够的结构稳定性；ii)自身 低毒性；iii)驰豫效能高；iv)对组织器官有选择性(靶向性)；V)在体内有适当的存留时间且易 于从体内排出。钆基对比剂在磁共振成像对比剂中占据着重要的地位，相应的配体有二乙 三胺五乙酸(DTPA); 1,4,7,10-四氮杂环十二垸；1,4,7，10-四乙酸(DOTA)和乙二胺四乙酸
(EDTA)及它们的衍生物。已经进入临床应用的有Gd—DTPA (马根维显，Magnevist)， Gd—DTPA—BMA， Gd—D03A—HP (礼替醇，Prohance)， Gd—DOTA (Dotarem)。然而， 自1987年来发现钆基对比剂会对肾小管造成直接损害，近年来证实传统的钆基成像对比剂会 引起肾细胞纤维化。因此，怎样避免附加毒副作用是未来钆基对比剂的研发方向。目前国际 上的发展趋势还是在保障对比剂分子稳定、低毒、高弛豫率的基础上，追求针对特定组织及 器官设计合成选择性高、靶向性强的对比剂分子，包括对钆基磁共振成像对比剂的化学结构 修饰及探索新型超顺磁性(基于Fe304)对比剂和水溶性顺磁性对比剂。这些化合物可经过白 蛋白、葡聚糖、聚苯乙烯、单克隆抗体等的进一步化学物理修饰，增强靶向性。但由于大多 处于研发阶段，没有最后的定论，同时注意到寻求具有更低毒副作用的对比剂也是今后研究 的方向。
作为天然多糖的一种，壳聚糖属氨基直链多糖，属纯天然丰产可再生绿色资源。选择壳 聚糖来修饰对比剂是因为其具有很多优良特性，如i)自身零毒性、良好的水溶性以及与重 金属离子的亲和特性；ii)与多胺多酸对比剂类化合物容易通过共价键结合，结合后利用壳聚 糖的长链缠绕特性将螯合的顺磁性金属离子包在核心，同时增加弛豫效率；iii)进入体内后 壳聚糖会降解，但需要一定时间，保证对比剂的金属离子在体内存留时处于包裹状态不外泄;W)壳聚糖聚合度在12 6时与人体血清蛋白等运送蛋白的结合能力最强，可在成像测定结 束后将未完全降解的对比剂代谢排出体外；v)糖类化合物对不同器官或病灶器官会有不同的 亲和能力，以此提高对比剂的靶向性；vi)壳聚糖自身还能提高生命体的免疫力，并具有一 定的抗癌作用，有望增强协同作用；vii)壳聚糖易于加工成微胶囊，因此在剂型制备方面也 有着优势。这些特点很符合作为MRI对比剂的先决条件。另外从目前对葡聚糖和其他糖类化 合物的造影对比性能研究来看，壳聚糖极其有望成为一种新型、性能优良的MRI对比剂。
本方法将通过多胺多酸化合物的酸酐与壳聚糖氨基通过共价键结合起来，再络合稀土或 过渡金属等顺磁性离子，如钆、铁、锰等，使之成为具有一定靶向性和适宜体内滞留时间、 弛豫效率高于马根维显、毒性小的新型磁共振成像对比剂。其优势还在于i)酰胺键键联 的壳聚糖自身无毒性，可减少药物申报程序环节，容易上市；ii)糖类分子对不同器官组织和 病灶有识别作用，提高相应的选择性；iii)用马根维显l/4至2/3的含钆量就可达到同样的成 像对比效果，可进一步减少金属离子在体内可能引起毒性的风险；iv)加工制备工艺简单， 设备要求低，易于加工生产。
发明内容
本发明的目的是为了降低传统钆基对比剂对器官产生的毒副作用，提供一种潜在新功能 核磁共振成像对比剂及其制备方法，在提高弛豫效率、延长体内弛豫时间的同时改良对不同 器官组织或病灶的选择性，并降低毒副作用。
本发明壳聚糖修饰顺磁性金属离子磁共振成像对比剂的制备方法如下-(l)在反应容器中，加入一定质量的多胺多羧酸固体，然后再分别加入一定体积的无水乙 酸酐，其中所述的多胺多羧酸可以是二乙三胺五乙酸(DTPA)或者乙二胺四乙酸(EDTA)，其中 多胺多羧酸和无水乙酸酐的比值(质量:体积)为1:1~3，再加入一定体积的无水吡啶作为催化 剂，通干燥氮气保护，在55 60'C下搅拌反应24h后抽滤，分别用无水乙酸酐、无水N,N，-二甲基甲酰胺(DMF)和无水乙醚洗涤，得到多胺多羧酸的相应酸酐，所得到的多胺多羧酸的 酸酐是二乙三胺五乙酸酸酐(DTPAA)或者乙二胺四乙酸酸酐(EDTAA)。
(2)在无水N,N'-二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基亚砜(DMSO)中加入水溶性壳聚糖或窄分子 量分布水溶性壳聚糖，再加入4-二甲氨基吡啶或三乙胺或吡啶作为催化剂，常温搅拌下加入 步骤(l)中制备得到的多胺多羧酸酸酐，其中壳聚糖与多胺多羧酸酸酐的摩尔比为1:1 5，于 室温下搅拌36 72h，冰浴冷却后加入蒸馏水继续搅拌12 120h。真空浓縮至小体积，加入 无水乙醇沉析出淡黄色固体，真空干燥。
4(3)称取Sephadex G-25型凝胶，活化后装柱。将步骤(2)中所得到的固体溶解于少量蒸馏 水中，其中固体与蒸馏水比值(质量:体积)为1:2 100，上柱，以蒸馏水为洗脱溶剂，0.1%茚 三酮正丁醇溶液显色，用紫外分析仪进行检测(检测波长为254nm)，在洗脱的过程中出现两 个洗脱峰，配体的洗脱峰首先出柱，将其收集后真空浓缩至小体积，冷却后加入无水乙醇得 淡黄色沉淀，过滤，真空干燥得配体粉末。 (4)称取步骤(3:i中所得到的配体粉末溶解于蒸馏水中，其中配体粉末与蒸馏水比值(质量:体积) 为1:5 20，搅拌下加入金属无机盐，配体与金属无机盐的摩尔比为1:1 5，于室温下持续 搅拌2 24h，将溶液真空浓縮，冷却后加入无水乙醇沉淀，洗涤过滤，干燥后得到磁共振成 像对比剂的固体粉末0.3 3.0g。其中所述的金属无机盐为所有顺磁性稀土及过渡金属离子的 盐类，包括含不同结晶水的盐酸盐、硝酸盐、乙酸盐、硫酸盐或高氯酸盐，优选Gc^+的盐类， M^+的盐类、F^+的盐类。
本发明与现有技术相比具有以下显著优点
l)在常温下反应，反应操作与所需设备简单，成本低廉，易于实现规模化生产；2)产品水溶 性好，弛豫率为10 14Lmmor^s—、是Gd-DTPA弛豫率的1 3倍；3)对肝脏和肾脏组织有 着靶向性的选择，可有效的提高肝脏和肾脏的造影对比的清晰度；4)与马根维显对照对比的 小鼠体内试验结果表明，停药后30天钆离子在肝和肾脏的残留可降低2/5 2/3; 5)壳聚糖是 天然丰产可再生绿色资源，具有良好的生物相容性和降解性，自身无毒无害。
具体实施实例 实例l
水溶性壳聚糖的制备方法如下称取一定质量的高分子量壳聚糖于三口烧瓶中，加入一
定体积的体积分数为0.5%的乙酸溶液，其中壳聚糖与乙酸的比值(质量:体积)为1:50，在搅拌 下,加入一定体积的质量分数为10。/。的双氧7jC,其中壳聚糖与双氧水的比值(质量:体积)为1:1， 搅拌约10min。将所得到的溶液进行微波处理，设置微波参数(微波时间:30min,微波温度:60 'C)，微波结束后，静置冷却，调节pH至中性。再将所得到的溶液真空浓縮至一定体积，加 入乙醇沉析出固体，再用乙醚洗涤，真空干燥，即得到平均分子量为1980(聚合度为11，分 子量分布指数(DPI或Mw/M )= 1.9)的水溶性壳聚糖。
(l)在三颈烧瓶中，加入一定质量的二乙三胺五乙酸(DTPA)固体，然后加入一定体积的无 水乙酸酐，其中DTPA与无水乙酸酐的比值(质量:体积)为1:1,再加入一定体积的无水吡瞎作 为催化剂，通干燥氮气保护，在55 6(TC下搅拌反应24h后抽滤，分别用无水乙酸酐、无水 N,N，-二甲基甲酰胺(DMF)和无水乙醚洗涤，得到多胺多羧酸的酸酐DTPAA的白色固体
5粉末。(2)在无水N,N'-二甲基甲酰胺(DMF)中加入步骤(1)中制备得到的壳聚糖，再加入4-二 甲氨基吡啶作为催化剂，常温搅拌下加入步骤(l)中制备得到的多胺多羧酸酸酐，其中壳聚糖 与多胺多酸酸酐的摩尔比为1:1，于室温下搅拌36h，冰浴冷却后加入蒸馏水继续搅拌12h。 真空浓缩至小体积，加入无水乙醇沉析出淡黄色固体，真空干燥。(3)称取Sephadex G-25型 凝胶，活化后装柱。将步骤(2)中所得到的固体溶解于少量蒸馏水中，其中固体与蒸馏水比值 (质量:体积)为1:2，上柱，以蒸馏水为洗脱溶剂，0.1%茚三酮正丁醇溶液显色，用紫外分析 仪进行检测(波长为254nm),在洗脱的过程中出现两个洗脱峰，配体的洗脱峰首先出柱，将 其收集后真空浓縮至小体积，冷却后加入无水乙醇得淡黄色沉淀，过滤，真空干燥得配体粉 末。(4)称取步骤(3)中所得到的配体粉末溶解于蒸馏水中，其中配体粉末与蒸馏水比值(质量: 体积)为1:5，搅拌下加入金属无机盐GdCl3，6H20，其中配体与GdCl3*6H20的摩尔比为1:1， 于室温下持续搅拌2h,将溶液真空浓縮，冷却后加入无水乙醇沉淀，洗涤过滤，干燥后得到 磁共振成像对比剂的固体粉末l.Og左右。 实例2
(l)在三颈烧瓶中，加入一定质量的二乙三胺五乙酸(DTPA)固体，然后加入一定体积的 无水乙酸酐，其中DTPA与无水乙酸酐的比值(质量:体积)为1:3，再加入一定体积无水吡咬作 为催化剂，通干燥氮气保护，在55 6(TC下搅拌反应24h后抽滤，分别用无水乙酸酐、无水 N,N'-二甲基甲酰胺(DMF)和无水乙醚洗涤，得到多胺多羧酸的酸酐DTPAA的白色固体粉末。 (2)在无水N,N'-二甲基甲酰胺(DMF)中加入平均分子量为1460(聚合度为8，分子量分布指数 (DPI或Mw/M"^ 1.06)的水溶性壳聚糖(该原料由海南省精细化工重点实验室提供，制备方法 同实例l)，再加入4-二甲氨基吡啶作为催化剂，常温搅拌下加入歩骤(l)中制备得到的多胺多 羧酸酸酐，其中壳聚糖与多胺多酸酸酐DTPAA的摩尔比为1:5，于室温下搅拌72 h，冰浴冷 却后加入蒸馏水继续搅拌120h。真空浓縮至小体积，加入无水乙醇沉析出淡黄色固体，真空 干燥。(3)称取Sephadex G-25型凝胶，活化后装柱。将步骤(2)中所得到的固体溶解于少量蒸 馏水中，其中固体与蒸馏水比值(质量:体积)为1:100，上柱，以蒸馏水为洗脱溶剂，0.1%茚 三酮正丁醇溶液显色，用紫外分析仪进行检测(波长为254nm)，在洗脱的过程中出现两个洗 脱峰，配体的洗脱峰首先出柱，将其收集后真空浓缩至小体积，冷却后加入无水乙醇得淡黄 色沉淀，过滤，真空干燥得配体粉末。(4)称取步骤(3)中所得到的配体粉末溶解于蒸馏水中， 其中配体粉末与蒸馏水比值(质量:体积)为1:20,搅拌下加入金属无机盐MnCl2*4H20，其中配 体与MnC1^4H20的摩尔比为1:5，于室温下持续搅拌24h，将溶液真空浓縮，冷却后加入无 水乙醇沉淀，洗涤过滤，干燥后得到磁共振成像对比剂的固体粉末l.Og。实例3
(l)在三颈烧瓶中，加入二乙三胺五乙酸(DTPA)固体，然后加入一定体积的无水乙酸酐， 其中DTPA与无水乙酸酐的比值(质量:体积)为1:1，再加入一定体积的无水吡啶作为催化剂， 通干燥氮气保护，在55 60'C下搅拌反应24h后抽滤，分别用无水乙酸酐、无水N，N，-二甲 基甲酰胺(DMF)和无水乙醚洗涤，得到多胺多羧酸的酸酐DTPAA的白色固体粉末。(2)在无 水二甲基亚砜(DMSO)中加入平均分子量为1080(聚合度为6，分子量分布指数(DPI或Mw/M"一 1.03)的水溶性壳聚糖(该原料由海南省精细化工重点实验室提供，制备方法同实例1)，再加入 三乙胺作为催化剂，常温搅拌下加入步骤(l)中制备得到的多胺多羧酸酸酐，其中壳聚糖与多 胺多酸酸酐DTPAA的摩尔比为1:1，于室温下搅拌36h,冰浴冷却后加入蒸馏水继续搅拌12 h。真空浓縮至小体积，加入无水乙醇沉析出淡黄色固体，真空干燥。(3)称取Sephadex G-25 型凝胶，活化后装柱。将步骤(2)中所得到的固体溶解于少量蒸馏水中，其中固体与蒸馏水比 值(质量:体积)为1:2,上柱，以蒸馏水为洗脱溶剂，0.1%茚三酮正丁醇溶液显色，用紫外分 析仪进行检测(波长为254nm)，在洗脱的过程中出现两个洗脱峰，配体的洗脱峰首先出柱， 将其收集后真空浓縮至小体积，冷却后加入无水乙醇得淡黄色沉淀，过滤，真空千燥得配体 粉末。(4)称取步骤(3)中所得到的配体粉末溶解于蒸馏水中，其中配体粉末与蒸馏水比值(质 量:体积)为1:5，搅拌下加入金属无机盐GdCl3.6H20，其中配体与GdCl3.6H20的摩尔比为1:1， 于室温下持续搅拌2h，将溶液真空浓縮，冷却后加入无水乙醇沉淀，洗涤过滤，千燥后得到 磁共振成像对比剂的固体粉末0.5g左右。 实例4
(l)在三颈烧瓶中，加入乙二胺四乙酸(EDTA)固体，然后加入一定体积的无水乙酸酐， 其中EDTA与无水乙酸酐的比值(质量:体积)为1:3，再加入一定体积的无水吡啶作为催化剂， 通干燥氮气保护，在55 60'C下搅拌反应24h后抽滤，分别用无水乙酸酐、无水N，N，-二甲 基甲酰胺(DMF)和无水乙醚洗涤，得到多胺多羧酸的酸酐EDTAA的白色固体粉末。(2)在无 水N,N'-二甲基甲酰胺(DMF)中加入平均分子量为1080(聚合度为6，分子量分布指数(DPI或 MUM。"1.03)的水溶性壳聚糖(该原料由海南省精细化工重点实验室提供，制备方法同实例1)， 再加入4-二甲氨基吡啶作为催化剂，常温搅拌下加入步骤(l)中制备得到的多胺多羧酸酸酐， 其中壳聚糖与多胺多酸酸酐EDTAA的摩尔比为1:5，于室温下搅拌72 h，冰浴冷却后加入蒸 馏水继续搅拌120 h。真空浓縮至小体积，加入无水乙醇沉析出淡黄色固体，真空干燥。(3) 称取Sephadex G-25型凝胶，活化后装柱。将步骤(2)中所得到的固体用少量蒸馏水溶解，其 中固体与蒸馏水比值(质量:体积)为1:2，上柱，以蒸馏水为洗脱溶剂，0.1%茚三酮正丁醇溶
7液显色，用紫外分析仪进行检测(波长为254nm)，在洗脱的过程中出现两个洗脱峰，配体的 洗脱峰首先出柱，将其收集后真空浓縮至小体积，冷却后加入无水乙醇得淡黄色沉淀，过滤， 真空干燥得配体粉末。(4)称取步骤(3)中所得到的配体粉末溶解于蒸馏水中，其中配体粉末与 蒸馏水比值(质量:体积)为1:20，搅拌下加入金属无机盐GdCl3*6H20，其中配体与GdCl3*6H20 的摩尔比为1:5，于室温下持续搅拌24h，将溶液真空浓缩，冷却后加入无水乙醇沉淀，洗錄 过滤，干燥后得到磁共振成像对比剂的固体粉末1.5g左右。 实例5
(l)在三颈烧瓶中，加入乙二胺四乙酸(EDTA)固体，然后加入一定体积的无水乙酸酐，其 中EDTA与无水乙酸酐的比值(质量:体积)为1:3，再加入一定体积的无水吡啶作为催化剂， 通干燥氮气保护，在55 6(TC下搅拌反应24h后抽滤，分别用无水乙酸酐、无水N，N'-二甲 基甲酰胺(DMF)和无水乙醚洗涤，得到多胺多羧酸的酸酐EDTAA的白色固体粉末。(2)在无 水N，N'-二甲基甲酰胺(DMF)中加入平均分子量为1460(聚合度为8，分子量分布指数(DPI或
Mw/Mn"1.06)的水溶性壳聚糖(该原料由海南省精细化工重点实验室提供,制备方法同实例l)，
再加入吡啶作为催化剂，常温搅拌下加入步骤(l)中制备得到的多胺多羧酸酸酐，其中壳聚糖 与多胺多酸酸酐EDTAA的摩尔比为1:5，于室温下搅拌72h，冰浴冷却后加入蒸馏水继续搅 拌120h。真空浓縮至小体积，加入无水乙醇沉析出淡黄色固体，真空干燥。(3)称取Sephadex G-25型凝胶，活化后装柱。将步骤P)中所得到的固体溶解于少量蒸馏水中，其中固体与蒸馏 水比值(质量:体积)为1:100，上柱，以蒸馏水为洗脱溶剂，0.1%茚三酮正丁醇溶液显色，用 紫外分析仪进行检测(波长为254nm)，在洗脱的过程中出现两个洗脱峰，配体的洗脱峰首先 出柱，将其收集后真空浓縮至小体积，冷却后加入无水乙醇得淡黄色沉淀，过滤，真空干燥 得配体粉末。(4)称取步骤(3)中所得到的配体粉末溶解于蒸馏水中，其中配体粉末与蒸馏水比 值(质量:体积)为1:20，搅拌下加入金属无机盐MnCl2*4H20，其中配体与MnCl2 4H20的摩尔 比为1:5，于室温下持续搅拌24h，将溶液真空浓縮，冷却后加入无水乙醇沉淀，洗涤过滤， 干燥后得到磁共振成像对比剂的固体粉末1.5g左右。
实例6
(l)在三颈烧瓶中，加入二乙三胺五乙酸(DTPA)固体，然后加入一定体积的无水乙酸酐， 其中DTPA与无水乙酸酐的比值(质量:体积)为1:1，再加入一定体积的无水吡啶作为催化剂， 通干燥氮气保护，在55 60。C下搅拌反应24 h后抽滤，分别用无水乙酸酐、无水N,N'-二甲 基甲酰胺(DMF)和无水乙醚洗涤，得到多胺多羧酸的酸酐DTPAA的白色固体粉末。(2)在无 水二甲基亚砜(DMSO)中加入平均分子量为1980(聚合度为11，分子量分布指数(DPI或Mw/M""1.08)的水溶性壳聚糖(该原料由海南省精细化工重点实验室提供，制备方法同实例l)， 再加入4-二甲氨基吡啶作为催化剂，常温搅拌下加入步骤(l)中制备得到的多胺多羧酸酸酐， 其中壳聚糖与多胺多酸酸酐DTPAA的摩尔比为1:1，于室温下搅拌36h，冰浴冷却后加入蒸 馏水继续搅拌12h。真空浓縮至小体积，加入无水乙醇沉析出淡黄色固体，真空干燥。(3)称 取Sephadex G-25型凝胶，活化后装柱。将步骤(2)中所得到的固体溶解于少量蒸馏水中，其 中固体与蒸馏水比值(质量:体积)为1:2，上柱，以蒸馏水为洗脱溶剂，0.1%茚三酮正丁醇溶 液显色，用紫外分析仪进行检测(波长为254nm)，在洗脱的过程中出现两个洗脱峰，配体的 洗脱峰首先出柱，将其收集后真空浓缩至小体积，冷却后加入无水乙醇得淡黄色沉淀，过滤， 真空干燥得配体粉末。(4)称取步骤(3)中所得到的配体粉末溶解于蒸馏水中，其中配体粉末与 蒸馏水比值(质量:体积)为1:5,搅拌下加入金属无机盐GdCl3.6H20，其中配体与GdCl3.6H20 的摩尔比为l:l，于室温下持续搅拌2h，将溶液真空浓缩，冷却后加入无水乙醇沉淀，洗涤 过滤，干燥后得到磁共振成像对比剂的固体粉末1.2g左右。 实例7
(l)称取一定质量的高分子量壳聚糖于三口烧瓶中，加入一定体积的体积分数为0.5%的 乙酸溶液，其中壳聚糖与乙酸的比值(质量:体积)为1:50,在搅拌下，加入一定体积的10%双 氧7jC，其中壳聚糖与双氧水的比值(质量:体积)为1:1，搅拌约10min。将所得到的溶液进行微 波处理，设置微波参数(微波时间:30min，微波温度:6(TC),微波结束后，静置冷却，调节pH 至中性。再将所得到的溶液真空浓縮至小体积，加入乙醇沉析出固体，再用乙醚洗涤，真空 干燥，即得到平均分子量为1980(聚合度为11，分子量分布指数(DPI或Mw/M )= 1.9)的水溶 性壳聚糖。(2)在三颈烧瓶中，加入乙二胺四乙酸(EDTA)固体，然后加入一定体积的无水乙酸 酐，其中EDTA与无水乙酸酐的比值(质量:体积)为1:1,再加入一定体积的无水吡啶作为催 化剂，通干燥氮气保护，在55 60'C下搅拌反应24h后抽滤，分别用无水乙酸酐、无水N,N，-二甲基甲酰胺(DMF)和无水乙醚洗涤，得到多胺多羧酸的酸酐EDTAA的白色固体粉末。(3) 在无水N，N'-二甲基甲酰胺(DMF)中加入步骤(1)中制备得到的壳聚糖，再加入4-二甲氨基吡 啶作为催化剂，常温搅拌下加入步骤(2)中制备得到的多胺多羧酸酸酐，其中壳聚糖与多胺多 酸酸酐EDTAA的摩尔比为1:1，于室温下搅拌36h，冰浴冷却后加入蒸馏水继续搅拌12h。 真空浓縮至小体积，加入无水乙醇沉析出淡黄色固体，真空干燥。(4)称取Sephadex G-25型 凝胶，活化后装柱。将步骤(3)中所得到的固体溶解于少量蒸馏水中，其中固体与蒸馏水比值 (质量:体积)为1:100,上柱，以蒸馏水为洗脱溶剂，0.1%茚三酮正丁醇溶液显色，用紫外分 析仪进行检测(波长为254nm)，在洗脱的过程中出现两个洗脱峰，配体的洗脱峰首先出柱，
9将其收集后真空浓縮至小体积，冷却后加入无水乙醇得淡黄色沉淀，过滤，真空干燥得配体 粉末。(5)称取步骤(4)中所得到的配体粉末溶解于蒸馏水中，其中配体粉末与蒸馏水比值(质 量:体积)为1:5，搅拌下加入金属无机盐0(103.6&0，其中配体与0(103.61120的摩尔比为1:1， 于室温下持续搅拌2h，将溶液真空浓縮，冷却后加入无水乙醇沉淀，洗涤过滤，干燥后得到 磁共振成像对比剂的固体粉末l.Og左右。
权利要求
1、壳聚糖修饰顺磁性金属离子磁共振成像对比剂的制备方法，其特征在于按以下步骤进行(1)在反应容器中，加入一定质量的多胺多羧酸固体和一定体积的无水乙酸酐，再加入无水吡啶作为催化剂，通干燥氮气保护，在55～60℃下搅拌反应24h后抽滤，分别用无水乙酸酐、无水N，N’-二甲基甲酰胺和无水乙醚洗涤，得到多胺多羧酸的相应酸酐，其中多胺多羧酸和无水乙酸酐的比值以质量与体积比计为1∶1～3；(2)在无水N，N’-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜中加入水溶性壳聚糖或窄分子量分布水溶性壳聚糖，再加入4-二甲氨基吡啶或三乙胺或吡啶作为催化剂，常温搅拌下加入步骤(1)中制备得到的多胺多羧酸酸酐，其中壳聚糖与多胺多羧酸酸酐的摩尔比为1∶1～5，于室温下搅拌36～72h，冰浴冷却后加入蒸馏水继续搅拌12～120h，真空浓缩至小体积，加入无水乙醇沉析出淡黄色固体，真空干燥；(3)称取Sephadex G-25型凝胶，活化后装柱，将步骤(2)中所得到的固体溶解于少量蒸馏水中，其中固体与蒸馏水比值以质量与体积比计为1∶2～100，上柱，以蒸馏水为洗脱溶剂，0.1％茚三酮正丁醇溶液显色，用紫外分析仪进行检测，检测波长为254nm，在洗脱的过程中出现两个洗脱峰，配体的洗脱峰首先出柱，将其收集后真空浓缩至小体积，冷却后加入无水乙醇得淡黄色沉淀，过滤，真空干燥得配体粉末；(4)称取步骤(3)中所得到的配体粉末溶解于蒸馏水中，其中配体粉末与蒸馏水比值以质量与体积比计为1∶5～20，搅拌下加入金属无机盐，配体与金属无机盐的摩尔比为1∶1～5，于室温下持续搅拌2～24h，将溶液真空浓缩，冷却后加入无水乙醇沉淀，洗涤过滤，干燥后得到磁共振成像对比剂的固体粉末0.3～3.0g。
2、 根据权利要求l所述的壳聚糖修饰顺磁性金属离子磁共振成像对比剂的制备方法，其特征 在于多胺多羧酸可以是二乙三胺五乙酸或者乙二胺四乙酸。
3、 根据权利要求1所述的壳聚糖修饰顺磁性金属离子磁共振成像对比剂的制备方法，其特征 在于其中所述的金属无机盐可以是所有顺磁性稀土及过渡金属离子的盐类，包括含不同结晶 水的盐酸盐、硝酸盐、乙酸盐、硫酸盐或高氯酸盐，优选GcP的盐类，Mn"的盐类、Fe^的 盐类。
全文摘要
壳聚糖修饰顺磁性金属离子磁共振成像对比剂的制备方法，属于磁共振成像对比剂技术领域。按下步骤进行首先制备得到的多胺多羧酸的酸酐，在催化剂的作用下与水溶性壳聚糖或窄分子量分布水溶性壳聚糖反应，再经无水乙醇沉析出固体，将该固体过Sephadex G-25型凝胶柱，纯化得到壳聚糖的配体，再将该配体与顺磁性金属无机盐反应，最后无水乙醇沉淀，干燥后即可得到磁共振成像对比剂的固体粉末。本发明将通过多胺多酸化合物的酸酐与壳聚糖氨基通过共价键结合起来，再络合顺磁性的稀土或过渡金属离子，使之成为具有一定靶向性和适宜体内滞留时间、弛豫效率高于马根维显、毒性小的新型磁共振成像对比剂。本发明加工制备工艺简单，设备要求低，易于加工生产。
文档编号A61K49/06GK101642579SQ20091018420
公开日2010年2月10日 申请日期2009年8月14日 优先权日2009年8月14日
发明者岐 张, 顾海波, 燕 黄 申请人:江苏大学
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