短链化多核苷酸及其制备方法
专利名称：短链化多核苷酸及其制备方法
技术领域：
本发明涉及作为医药品特别有效的短链化多核苷酸及其制备方法。具体来讲，本发明是以合成的短链化多核苷酸或其盐中的2’-5’磷酸二酯键占全部磷酸二酯键的3％以下，即，对应于所有磷酸二酯键的磷酸基团，从3’位转移到2’位的磷酸基团的比例(磷酸位移率)在3％以下为特征的短链化多核苷酸或其盐，以及它们的制备方法。
背景技术：
聚肌苷酸·聚胞苷酸，即，以聚[I]·聚[C]为代表的多核苷酸是本领域技术人员公知的化合物，由于其具备干扰素诱导作用和免疫活性作用等，所以，对其作为肝炎治疗剂和癌治疗剂使用的可能性进行了研究。
多核苷酸的药理作用与其链长有关，链越长，其干扰素诱导作用等越强。但是，反过来考虑，链越长显现出的毒性也越强。
最近，尝试对多核苷酸进行水解，将获得的合成的短链化多核苷酸封入象阳离子脂质体那样的可将药物移入细胞内的有效载体中的方法，这样不仅能够维持多核苷酸的有效药理作用，还可减弱毒性(例如，PCT WO 99/20283号、PCTWO 99/48531号)。
但是众所周知，如果象以上所述那样通过水解而使多核苷酸短链化，则在短链化的同时因为伪旋转机理而使部分磷酸基团从3’位转移2’位发生分子内位移(参考《蛋白质、核酸、酶》Vol.40，No.10，pp1323-1332(1995))。其结果是，短链化多核苷酸分子内的部分3’-5’磷酸二酯键被2’-5’磷酸二酯键置换。这种磷酸基团的位移现象是否会影响到药理作用等目前还不清楚。
发明的揭示本发明的目的是提供作为医药品有效且安全的短链化多核苷酸及其盐，以及其短链化双链多核苷酸及其盐。
本发明者们经过认真研究后发现了在短链化反应时生成的2’-5’磷酸二酯键仅在一定比例以下的短链化多核苷酸及其盐中，解决了上述问题，从而完成了本发明。
本发明之一是短链化多核苷酸或盐，其特征是，2’-5’磷酸二酯键占所有磷酸二酯键的3％以下，更好是2％以下。
此外，本发明还涉及上述2’-5’磷酸二酯键占所有磷酸二酯键的3％以下，更好是2％以下的短链化多核苷酸或其盐中，由可形成双链的2个短链化多核苷酸或其盐构成的双链短链化多核苷酸或其盐。本发明进一步涉及包含以可将药物移入细胞内的有效载体和上述2’-5’磷酸二酯键占所有磷酸二酯键的3％以下的短链化多核苷酸或其盐，或和可形成双链的2个短链化多核苷酸或其盐形成的具有双链的短链化多核苷酸或盐为必须构成组分的复合体的组合物。
本发明的多核苷酸是各种核苷酸通过磷酸二酯键发生直链聚合反应形成的化合物，核苷酸数大约在20个以上，可以是天然的也可以是合成的。具体例子包括聚肌苷酸(即，聚(I))或其类似物、聚胞苷酸(即，聚(C))或其类似物、聚腺苷酸(即，聚(A))或其类似物、或聚尿苷酸(即，聚(U))或其类似物。
聚肌苷酸类似物是全部或部分肌苷酸经过化学修饰而获得的均聚物，或肌苷酸和其他核苷酸的共聚物。例如，聚(7-脱氮肌苷酸)、聚(2’-叠氮肌苷酸)。聚胞苷酸类似物是全部或部分胞苷酸经过化学修饰而获得的均聚物，或胞苷酸和其他核苷酸的共聚物。例如，聚(5-溴胞苷酸)、聚(2-硫代胞苷酸)、聚(胞苷酸-5’-硫代磷酸)、聚(胞苷酸、尿苷酸)、聚(胞苷酸、4-硫代尿苷酸)、聚(1-乙烯基胞苷酸)。聚腺苷酸类似物和聚尿苷酸类似物也是如此。其中，适合于本发明的是聚肌苷酸和聚胞苷酸。
本发明的短链化多核苷酸的平均链长一般为0.1k bases～1kbases(base碱基的个数，1k bases表示1000个碱基，以下将“base(s)”简称为“b”)，较好是200b～800b，更好为300b～600b。该平均链长如下面的试验例5所述，可以通过凝胶渗透色谱法(gel permeation chromatography，以下称为“GPC法”)容易地确定。
本发明的短链化多核苷酸的磷酸位移率一般在3％以下，较好在2％以下或0.1％～2％，更好是在1％以下或0.1％～1％。
多核苷酸的磷酸基团从3’位向2’位转移可通过下面的试验例6所述的方法容易地确认。即，用核酸酶P1选择性地对3’-5’磷酸二酯键进行水解，使多核苷酸分解为核苷、核苷酸及寡核苷酸后，再用碱性磷酸酶选择性地对末端的磷酸基团进行水解，使全部核苷酸转变为核苷。另一方面，具有未被核酸酶P1分解的2’-5’磷酸二酯键的寡核苷酸即使用碱性磷酸酶处理，其分子内的2’-5’磷酸二酯键也不会被水解，所以不能够分解为核苷。用液相色谱法对核苷和寡核苷酸(大部分为二聚体)进行定量，求得磷酸的位移率。
本发明的可形成双链的2个短链化多核苷酸包括聚肌苷酸和聚胞苷酸、聚腺苷酸和聚尿苷酸、聚肌苷酸类似物和聚胞苷酸、聚肌苷酸和聚胞苷酸类似物、聚肌苷酸类似物和聚胞苷酸类似物、聚腺苷酸类似物和聚尿苷酸、聚腺苷酸和聚尿苷酸类似物、聚腺苷酸类似物和聚尿苷酸类似物。因此，由可形成双链的2个短链化多核苷酸形成的具有双链的短链化多核苷酸包括聚肌苷酸·聚胞苷酸、聚腺苷酸·聚尿苷酸、聚肌苷酸类似物·聚胞苷酸、聚肌苷酸·聚胞苷酸类似物、聚肌苷酸类似物·聚胞苷酸类似物、聚腺苷酸类似物·聚尿苷酸、聚腺苷酸·聚尿苷酸类似物、聚腺苷酸类似物·聚尿苷酸类似物。其中，聚肌苷酸·聚胞苷酸是适合于本发明的具有双链的短链化多核苷酸。
上述具有双链的短链化多核苷酸的平均链长可以认为是全部短链化多核苷酸的平均链长。该平均链长作为具有双链的短链化多核苷酸的外观平均链长可用碱基对的个数表示。因此，上述具有双链的短链化多核苷酸的平均链长一般为0.1k bp～1k bp(bp碱基对的个数，1k bp为1000个碱基对)，较好为200bp～800bp，更好为300bp～600bp。
本发明的短链化多核苷酸盐及具有双链的短链化多核苷酸盐只要是医药上允许的盐，对其无特别限定。例如，钠盐和钾盐。
可将药物移入细胞内的有效载体可采用带有正电荷的载体，其具体例子包括聚-L-赖氨酸等阳离子性聚合物和Lipofectin、Lipofectamine、Lipofectace、DMRIE-C等阳离子脂质体，还包括PCT WO 94/19314号公报揭示的被认为是同一类的载体。例如，以具有以下结构式[I]的2-O-(2-二乙基氨基乙基)氨基甲酰基-1，3-O-二油酰基甘油 和磷脂(例如，磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、卵磷脂、大豆磷脂、它们的氢化磷脂)为必须构成组分的药物载体。
上述阳离子脂质体带有正电荷，与带有负电荷的多核苷酸或寡核苷酸形成静电复合体，该复合体和细胞膜融合的同时，多核苷酸或寡核苷酸被移入细胞内。这种复合体被称为“lipoplex”。
以下对本发明的短链化多核苷酸的制备方法进行详细说明。例如，在适当的pH范围内和适当的温度范围内使作为起始原料的多核苷酸溶液加热水解就可制得。此时，水溶液的pH以在7以上的碱性为宜，更好是pH7～10。此外，如果考虑到短链化反应的速度和碱基部分的稳定性，pH更好为8～9。另一方面，从碱基的稳定性考虑，反应温度应在20～110℃的范围内，更好是在40～100℃。但是，考虑到足够的水解速度和碱基部分的稳定性，反应温度最好在50～90℃的范围内。
更具体来讲，例如，将多核苷酸搅拌溶解于水，如注射用水、注射用蒸馏水或生理盐水中，用缓冲液或pH调节剂将pH值调整为8～9。然后，在50～90℃的反应温度范围内，一边监控平均链长和磷酸的位移率，一边进行0.5～60小时的加热水解，就能够制得磷酸位移率较低、且具有0.1kb～1kb的平均链长的短链化多核苷酸。
pH的调整可采用医药上允许的添加剂，例如，缓冲液或pH调节剂。具体例子包括氨基乙酸(别名甘氨酸)、三羟基甲基氨基甲烷(别名Tris)、碳酸钠、碳酸氢钠(别名重碱)、氢氧化钠、二乙醇胺、三乙醇胺等缓冲液和pH调节剂。对它们的种类、组合和浓度等无任何限定。
如果对反应液进行透析处理或活性炭处理等，能够将单体和不需要的盐、杂质、短链化生成的反应副产品排出到反应系统外。
此外，在适当的pH范围内和适当的温度范围内，以多核苷酸溶液为起始原料，用磷酸二酯酶也可制得本发明的短链化多核苷酸。此时反应液的pH一般在4～9的范围内，更好是5～8的范围内。此外，考虑到反应时的磷酸位移，pH值最好在6～7的范围内。另一方面，考虑到酶的性质，反应温度一般在20～60℃的范围内，更好是在25～50℃的范围内。但是，要获得足够的水解速度，避免酶反应以外的热对水解的影响，且不引发磷酸基团的位移，反应温度最好在30～40℃的范围内。
更具体来讲，在多核苷酸中加水(注射用水、注射用蒸馏水和生理盐水等)搅拌并溶解。如有需要，添加缓冲液和pH调节剂来调整pH值。然后，加入核酸酶P1等磷酸二酯酶，在30～40℃的反应温度范围内，一边监控平均链长和磷酸位移率，一边进行短链化反应，制得磷酸位移较少、且具有0.1kb～1kb的平均链长的短链化多核苷酸。对酶的浓度和反应条件等无任何限定。
如果对反应液进行乙醇沉淀、透析处理和活性炭处理等，能够将单体、不需要的盐、杂质、短链化反应生成的副产品等排除到反应系统外。
通过适当的膜分离能够对短链化多核苷酸进行精制。例如，以分离出本发明的平均链长为0.1kb～1kb的短链化多核苷酸为目的，可采用超滤膜等。对该滤膜的材质或孔径等无任何限定。
作为起始原料的多核苷酸可以是天然的也可以是合成的，对盐的种类和链长也无特别限定。天然的多核苷酸包括tRNA和聚腺苷酸。合成的聚核苷酸能够由以聚核苷酸磷酸化酶为代表的RNA合成酶和其固定化酶制得。此外，作为干扰素诱导剂的市售的聚肌苷酸钠盐和聚胞苷酸钠盐等也可作为起始原料使用。
在适当的溶液(例如，含有0.15M NaCl的10mM的Tris-盐酸缓冲液(pH7))中，混入以上获得的磷酸位移率较低的短链化多核苷酸中可形成双链的2个短链化多核苷酸，能够获得本发明的具有双链的短链化多核苷酸，此外，利用常规方法进行退火也能够获得。退火的方法包括将含有可形成双链的2个短链化多核苷酸的溶液升温至70～80℃，再慢慢冷却的方法。
此外，可以对以上获得的磷酸位移率较低的短链化多核苷酸或具有双链的短链化多核苷酸进行冷冻干燥处理，这样就能够制得可长期保存的冷冻干燥品。冷冻干燥处理可采用常规方法进行。例如，对在上述条件下获得的短链化多核苷酸溶液进行过滤灭菌处理后，将滤液注入经过热空气灭菌处理的金属容器中，在-40℃～-20℃的棚温下进行1～4小时的预冷，一次干燥后，在15～30℃的棚温下减压进行二次干燥(时间为10～50小时左右)，就能够获得冷冻干燥品。一般，在上述冷冻干燥品中添加适当的溶液(注射用水、注射用蒸馏水、生理盐水、麦芽糖溶液和葡萄糖溶液等)使其溶解就可使用。
本发明的组合物，即，包含以可将药物移入细胞内的有效载体和2’-5’磷酸二酯键占所有磷酸二酯键的3％以下的短链化多核苷酸、可形成双链的2个短链化多核苷酸或由可形成双链的2个短链化多核苷酸形成的具有双链的短链化多核苷酸为必须构成组分的复合体(以下称为“本复合体”)的组合物能够通过和脂质体的常规制备方法同样的方法制得。具体来讲，在可将药物移入细胞内的有效载体，例如阳离子脂质体或其原料(例如，2-O-(2-二乙基氨基乙基)氨基甲酰基-1，3-O-二油酰基甘油等甘油衍生物及磷脂)中加入水(注射用水、注射用蒸馏水和生理盐水等)，搅拌混合后，用适当的分散机，例如，均质混合机、均化机、超声波分散机、超声波均化机、高压乳化分散机、Microfluidizer(商品名)、Nanomizer(商品名)、De Bee 2000(商品名)、Ultimizer(商品名)、Manton-Gaulin型高压均化机进行分散处理。然后，在该脂质分散液中加入本发明的短链化多核苷酸或具有双链的短链化多核苷酸，再次用适当的分散机进行分散处理，获得本复合体之后，进行过滤灭菌等灭菌处理，就能够制得作为注射剂的本发明组合物。在制备时的适当步骤中还可添加其他任意的添加剂，对其无特别限定。此外，预先混合可将药物移入细胞内的有效载体，例如，阳离子脂质体或其原料(例如，2-O-(2-二乙基氨基乙基)氨基甲酰基-1，3-O-二油酰基甘油等甘油衍生物及磷脂)和本发明的短链化多核苷酸或具有双链的短链化多核苷酸，然后在该混合物中加入水，同时进行分散处理。此外，上述各种制备方法中，还可包括适当的粗分散步骤。
此外，可以对以上获得的本发明的组合物进行冷冻干燥处理，这样就能够制得可长期保存的本发明组合物的冷冻干燥制剂。冷冻干燥处理可采用常规方法进行。例如，在上述分散处理后进行过滤灭菌处理，然后将所得本发明组合物定量地分别注入小瓶中。在-40℃～-20℃的条件下进行约2～3小时的预冷，然后在约0～10℃的减压条件下进行一次干燥，再在约15～25℃的减压条件下进行二次干燥，进行冷冻干燥。接着，一般用氮气等惰性气体置换掉小瓶内部的空气，加盖后就可获得本发明组合物的冷冻干燥制剂。
一般，用任何适当的溶液对本发明组合物的冷冻干燥制剂进行再溶解就可使用。进行再溶解时，可采用注射用水、注射用蒸馏水、生理盐水、麦芽糖溶液、葡萄糖溶液和其他普通的输液等。
本发明组合物及其冷冻干燥制剂可作为药物制剂使用。作为药物制剂的本发明组合物及其冷冻干燥制剂能够发挥出多核苷酸所具有的药理作用。因此，该药物制剂的具体例子包括干扰素诱导剂、免疫活化剂、细胞内核酸酶活化剂、癌治疗剂或预防剂、肝炎治疗剂或预防剂。
实施发明的最佳方式例举实施例和试验例对本发明进行更为详细的说明，但本发明并不仅限于这些实施例和试验例中。
参考例1在8g肌苷-5’-二磷酸三钠盐及1g氯化镁中加入500mL 0.1M的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，搅拌溶解。然后，添加6N的氢氧化钠将pH值调整到9.3，于38℃静置1小时。再添加1mL多核苷酸磷酸化酶溶液，于38℃反应18小时。接着，在上述反应液中加入25mL 0.2M的乙二胺四乙酸使反应停止，再加入10mL饱和食盐水和500mL无水乙醇，使聚肌苷酸(1973 b)沉淀。
参考例2在10g胞苷-5’-二磷酸三钠盐及3g氯化锰中加入约1L 0.2M的碳酸氢钠-氢氧化钠缓冲液，搅拌溶解。然后，添加6N的氢氧化钠将pH值调整到9.8，于36℃静置1小时。接着，添加2mL精制的多核苷酸磷酸化酶溶液，于36℃反应24小时。再添加50mL 0.2M的乙二胺四乙酸使反应停止，最后在反应液中加入20mL饱和食盐水和1L无水乙醇，使聚胞苷酸(3300 b)沉淀。
实施例1对参考例1获得的聚肌苷酸进行离心分离，在沉淀物中加入500mL注射用水进行再溶解，然后进行透析处理。用活性炭对透析内液进行处理后，通过过滤除去活性炭，再在滤液中加入6N的氢氧化钠，将pH值调整为8.5。接着，于70℃进行8小时的加热水解使该聚肌苷酸短链化，再用活性炭对上述短链化多核苷酸进行处理，过滤除去活性炭后，进行透析处理。对透析内液过滤灭菌后，用常规方法对滤液进行冷冻干燥处理，获得1.9g磷酸位移率较低的本发明的短链化多核苷酸(聚肌苷酸钠盐)的冷冻干燥制品(磷酸位移率为0.2％，平均链长为360 b)。
实施例2对参考例2获得的聚胞苷酸进行离心分离，在沉淀物中加入500mL注射用水进行再溶解，然后进行透析处理。用活性炭对透析内液进行处理后，通过过滤除去活性炭，再在滤液中加入6N的氢氧化钠，将pH值调整为9.0。接着，于80℃进行4小时的加热水解使该聚胞苷酸短链化，再用活性炭对上述短链化多核苷酸进行处理，过滤除去活性炭后，进行透析处理。对透析内液过滤灭菌后，用常规方法对滤液进行冷冻干燥处理，获得2.7g磷酸位移率较低的本发明的短链化多核苷酸(聚胞苷酸钠盐)的冷冻干燥制品(磷酸位移率为0.1％，平均链长为318 b)。
实施例3在1g聚胞苷酸钠盐(S020，w(沉降系数)7.2，生化学工业株式会社制)中加入200mL 0.1M的Tris-盐酸缓冲液(pH8.0)，搅拌溶解后，一边用试验例5记载的方法监控平均链长，一边于60℃进行48小时的加热水解使该聚腺苷酸短链化，再用活性炭对上述短链化多核苷酸进行处理，通过常规方法对透析内液进行冷冻干燥处理，获得0.3g磷酸位移率较低的本发明的短链化多核苷酸(聚腺苷酸钠盐)的冷冻干燥制品(磷酸位移率为1.9％，平均链长为154 b)。
实施例4在1g聚尿苷酸钠盐(S020，w(沉降系数)6.5，生化学工业株式会社制)中加入200mL 0.2M的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH9.0)，搅拌溶解后，一边用试验例5记载的方法监控平均链长，一边于60℃进行25小时的加热水解使该聚尿苷酸短链化。对上述短链化多核苷酸进行透析处理后，通过常规方法对透析内液进行冷冻干燥处理，获得0.2g磷酸位移率较低的本发明的短链化多核苷酸(聚尿苷酸钠盐)的冷冻干燥制品(磷酸位移率为1.2％，平均链长为108 b)。
实施例5在250mg聚肌苷酸钠盐(S020，w(沉降系数)8.8，Yamasa酱油株式会社制)中加入50mL 0.1M的Tris-盐酸缓冲液(pH8.0)，搅拌溶解后，在50～120℃的适当的短链化温度下对上述溶液进行加热，然后一边用试验例5记载的方法监控平均链长，一边对任意链长的聚肌苷酸进行取样，其结果如表1所示。分别对所得试样溶液进行透析后，通过常规方法进行冷冻干燥处理，获得各种冷冻干燥制品。
表1
实施例6在250mg聚胞苷酸钠盐(S020，w(沉降系数)8.6，Yamasa酱油株式会社制)中加入50mL 0.1M的Tris-盐酸缓冲液(pH9.0)，搅拌溶解后，在55～120℃的适当的短链化温度下对上述溶液进行加热，然后一边用试验例5记载的方法监控平均链长，一边对任意链长的聚胞苷酸进行取样，其结果如表2所示。分别对所得试样溶液进行透析后，通过常规方法进行冷冻干燥处理，获得各种冷冻干燥制品。
表2
从上述实施例5和实施例6可明显看出，使市售的聚肌苷酸钠盐及聚胞苷酸钠盐短链化时，在55℃以下的短链化温度下，不能够进行充分的水解。因此，即使短链化时间超过约50小时，平均链长还是超过1kb。另一方面，由于将短链化温度设定在120℃的试样及将短链化温度设定在90℃的试样的水解反应速度过快，所以很难对短链化进行控制。特别是短链化温度为120℃时，在1～1.5小时的短链化时间内可将多核苷酸分解至接近寡核苷酸的程度。此外，还可确认该试样的磷酸位移率较高，碱基部分也出现了分解。
实施例7在100mg聚腺苷酸钠盐(S020，w(沉降系数)7.2，生化学工业株式会社制)中加入100mL 0.1M的Tris-盐酸缓冲液(pH7.0)，溶解后，在该溶液中加入核酸酶P1(来源于青霉，生化学工业株式会社制)，然后一边用试验例5记载的方法监控平均链长，一边于25℃进行3小时的孵化，使该聚腺苷酸短链化(磷酸位移率为0.1％，平均链长为287 b)。
实施例8在1g尿苷-5’-二磷酸三钠盐及0.3g氯化锰中加入约100mL 0.2M的碳酸氢钠-氢氧化钠缓冲液，搅拌溶解。然后，添加1N的氢氧化钠将pH值调整到9.5后，再添加0.2mL多核苷酸磷酸化酶溶液，一边用试验例5记载的方法监控平均链长，一边于25℃进行10小时的反应。接着，在上述反应液中加入5mL 0.2M的乙二胺四乙酸使反应停止，再加入2mL饱和食盐水和100mL乙醇，使聚尿苷酸(549 b)沉淀。对所得聚尿苷酸进行离心分离，在沉淀物中加入50mL注射用水进行再溶解后再进行透析处理。然后，在透析内液中加入1N的氢氧化钠，将pH值调整到8.5，于80℃进行30分钟的加热水解调节该聚尿苷酸的链长。最后，用超滤膜对上述短链化多核苷酸溶液进行膜分离，在调节链长分布的同时除去不需要的盐、短链化反应时生成的副产品等(磷酸位移率为0.1％，平均链长为485 b)。
实施例9在1g 2-O-(2-二乙基氨基乙基)氨基甲酰基-1，3-O-二油酰基甘油和2g精制卵磷脂中加入溶有40g麦芽糖的100mL注射用水，搅拌混合后，用均化机进行5分钟的分散处理，获得阳离子脂质体(载体)的粗分散液。然后，用实验室用小型乳化分散机对该粗分散液进行1小时的分散处理，获得阳离子脂质体溶液。在搅拌下缓缓地在该阳离子脂质体溶液中加入约50mL分别含有200mg实施例1及实施例2制得的磷酸位移率较低的短链化聚肌苷酸钠盐及聚胞苷酸钠盐的水溶液后，用实验室用小型乳化分散机对该水溶液进行2小时的分散处理，最后用注射用水定容至400mL，获得含有本复合体的组合物。对该含有本复合体的组合物进行过滤灭菌处理后，将其1mL一份分别注入小瓶中，然后按照常规方法制成冷冻干燥制剂。用注射用水重组冷冻干燥制剂，使其为1mL时的本复合体的平均粒径为133nm(光子相关法)。
实施例10在50g 2-O-(2-二乙基氨基乙基)氨基甲酰基-1，3-O-二油酰基甘油和25g大豆磷脂中加入溶有1kg蔗糖的3L注射用水，搅拌混合后，用Manton-Gaulin型高压均化机进行30分钟的分散处理，再用注射用水定容至5L，获得阳离子脂质体(载体)的分散液。然后，在搅拌下缓缓地在该阳离子脂质体溶液中加入约2L分别含有1g实施例1及实施例2制得的磷酸位移率较低的短链化聚肌苷酸钠盐及聚胞苷酸钠盐的水溶液，再用1N的盐酸将pH值调整为5.5。接着，再次用Manton-Gaulin型高压均化机进行1小时的分散处理，最后用注射用水定容至10L，获得含有本复合体的组合物。将含有本复合体的组合物20mL一份分别注入小瓶中后，按照常规方法制成冷冻干燥制剂。用注射用水重组冷冻干燥制剂，使其为20mL时的本复合体的平均粒径为158nm(光子相关法)。
实施例11在1g 2-O-(2-二乙基氨基乙基)氨基甲酰基-1，3-O-二油酰基甘油和2g卵磷脂中加入溶有40g葡萄糖的100mL注射用水，搅拌混合后，用均化机进行5分钟的分散处理，再定容至500mL，获得阳离子脂质体(载体)的粗分散液。接着，用实验室用小型乳化分散机对粗分散液进行1小时的分散处理，获得阳离子脂质体溶液。将所得溶液10mL一份分别注入小瓶中，按照常规方法进行冷冻干燥。在该冷冻干燥品中加入10mL分别含有5mg实施例1、2或5、6获得的磷酸位移率较低的短链化聚肌苷酸钠盐和聚胞苷酸钠盐，以及市售的聚肌苷酸钠盐(S020，w(沉降系数)8.8，Yamasa酱油株式会社制)和聚胞苷酸钠盐(S020.w(沉降系数)8.6，Yamasa酱油株式会社制)的水溶液，然后，用探针型超声波分散机进行10分钟的分散处理，获得含有本复合体的组合物。
实施例12搅拌下混合1mL分别含有100μg实施例3及4获得的磷酸位移率较低的短链化聚腺苷酸钠盐和聚尿苷酸钠盐的水溶液及2mL含有2mg市售Lipofectin(商品名)的水溶液，然后用探针型超声波分散机进行15分钟的分散处理，获得含有本复合体的组合物。
实施例13在约200mg聚肌苷酸钠盐(S020.w(沉降系数)8.8，Yamasa酱油株式会社制)中加入0.2M的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH5.2)，搅拌溶解后，加热至80℃，然后，一边用试验例6记载的方法对磷酸位移率进行监控，一边对具有任意的磷酸位移率的聚肌苷酸进行取样。接着，在硼酸缓冲液(pH 8.5)中将具有各种磷酸位移率的聚肌苷酸加热至60℃，再用试验例5记载的方法一边监控链长一边使聚肌苷酸短链化，使其平均链长达到200±50 b，其结果如表3所示。分别对所得短链化聚肌苷酸溶液进行透析处理后，按照常规方法进行冷冻干燥处理，获得冷冻干燥品。
表3
实施例14在约200mg聚胞苷酸钠盐(S020，w(沉降系数)8.6，Yamasa酱油株式会社制)中加入0.2M的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH5.2)，搅拌溶解后，加热至80℃，然后，一边用试验例6记载的方法对磷酸位移率进行监控，一边对具有任意的磷酸位移率的聚胞苷酸进行取样。接着，在硼酸缓冲液(pH8.5)中将具有各种磷酸位移率的聚胞苷酸加热至70℃，再用试验例5记载的方法一边监控链长一边使聚胞苷酸短链化，使其平均链长达到200±50 b，其结果如表4所示。分别对所得短链化聚胞苷酸溶液进行透析处理后，按照常规方法进行冷冻干燥处理，获得冷冻干燥品。
表4
实施例15具有双链的短链化多核苷酸分别调制由实施例1、2、13及14获得的磷酸位移率为0.7％的聚肌苷酸和磷酸位移率为1.2％的聚胞苷酸组合而成的具有双链的短链化多核苷酸(双链RNA)，磷酸位移率为2.0％的聚肌苷酸和磷酸位移率为1.9％的聚胞苷酸组合而成的具有双链的短链化多核苷酸(双链RNA)，磷酸位移率为2.8％的聚肌苷酸和磷酸位移率为2.7％的聚胞苷酸组合而成的具有双链的短链化多核苷酸(双链RNA)。将各聚肌苷酸钠盐和聚胞苷酸钠盐溶于Tris-盐酸缓冲液(pH7，含有0.15M的氯化钠)，于80℃加热5分钟后，慢慢冷却就可获得各种具有双链的短链化多核苷酸。
比较例1(对应于实施例1的以往制法-1)在5mg聚肌苷酸钠盐(S020，w(沉降系数)8.8，Yamasa酱油株式会社制)中注入10mL注射用水，搅拌溶解后，在该溶液中加入10mL甲酰胺，于80℃加热5小时(磷酸位移率为8.9％，平均链长为628 b)。
比较例2(对应于实施例2的以往制法-1)在5mg聚胞苷酸钠盐(S020，w(沉降系数)8.6，Yamasa酱油株式会社制)中注入10mL注射用水，搅拌溶解后，在该溶液中加入10mL甲酰胺，于80℃加热5小时(磷酸位移率为4.2％，平均链长为751 b)。
比较例3(对应于实施例1的以往制法-2)在5mg聚肌苷酸钠盐(S020，w(沉降系数)8.8，Yamasa酱油株式会社制)中注入10mL注射用水，搅拌溶解后，于90℃对该溶液进行8小时的加热(磷酸位移率为7.1％，平均链长为213 b)。
比较例4(对应于实施例2的以往制法-2)在5mg聚胞苷酸钠盐(S020，w(沉降系数)8.6，Yamasa酱油株式会社制)中注入10mL注射用水，搅拌溶解后，于90℃对该溶液进行12小时的加热(磷酸位移率为4.2％，平均链长为289 b)。
比较例5调制分别由实施例13和14获得的磷酸位移率为4.2％的聚肌苷酸和磷酸位移率为3.8％的聚胞苷酸组合而成的具有双链的短链化多核苷酸(双链RNA)。将作为多核苷酸的聚肌苷酸钠盐和聚胞苷酸钠盐溶于Tris-盐酸缓冲液(pH7，含有0.15M的氯化钠)，于80℃加热5分钟后，慢慢冷却就可获得该具有双链的短链化多核苷酸。
试验例1平均链长对药理活性的影响根据对HeLa S3癌细胞的细胞增殖抑制作用(体外)对实施例9的组合物的药理活性进行评估。进行实验时，将HeLa S3癌细胞以104细胞/孔的密度接种在96孔的滴定板中进行24小时或更长时间的培养，确认细胞充分附着在板中后，添加该组合物，继续进行培养。在CO2培养箱内培养3天后，用MTT法测定存活细胞数，再用下式算出细胞增殖抑制率，其结果如表5所示。
细胞增殖抑制率(％)＝(复合体处理群的吸光度值/对照群的吸光度)×100
表5
(a)聚肌苷酸钠盐(Yamasa酱油株式会社制)(b)聚胞苷酸钠盐(Yamasa酱油株式会社制)如表5所示，各组合物对作为癌细胞株的HeLa S3的细胞增殖抑制作用和平均链长有很大关系。表5中，一般作为干扰素诱导剂使用的1000 b以上的长链聚肌苷酸·聚胞苷酸显现出最强的增殖抑制作用，本发明的平均链长在0.1kb～1kb范围内的磷酸位移率较低的短链化聚肌苷酸·聚胞苷酸虽然略低，但也保持了足够强的增殖抑制作用。此外，当平均链长不足100 b时细胞增殖抑制作用急剧下降，接近寡核苷酸程度的多核苷酸几乎不显现活性。
试验例2对骨髓细胞的影响对骨髓毒性进行研究作为毒性评估。对ddY小鼠(雄性，8周)静脉注射市售的聚肌苷酸钠盐(S020，w(沉降系数)8.8，Yamasa酱油株式会社制)和聚胞苷酸钠盐(S020，w(沉降系数)8.6，Yamasa酱油株式会社制)，以及实施例5和6中的磷酸位移率较低的聚肌苷酸、聚胞苷酸中平均链长分别为982 b和907 b的多核苷酸，第2天从大腿骨处抽取骨髓细胞。用新亚甲蓝和吉姆萨对细胞进行染色，测定网织红细胞和成熟红细胞，其结果如表6所示。表6的骨髓毒性是指网织红细胞数和全部红细胞数之比，由下式定义。此外，*标记为显著性水平p＜0.01，表示试验群和静脉内注射了无多核苷酸的载体的对照群的显著性差异(Dunnett的多重比较法)。
骨髓毒性＝(网织红细胞数/网织红细胞数＋成熟红细胞数)表6
(a)聚肌苷酸钠盐(Yamasa酱油株式会社制)(b)聚胞苷酸钠盐(Yamasa酱油株式会社制)从表6可看出，一般作为干扰素诱导剂使用的平均链长超过1000 b的长链聚肌苷酸·聚胞苷酸的投药量即使只有1mg/kg，其对应于对照群的变化也达到了39％，而本发明的平均链长在0.1kb～1kb范围内的磷酸位移率较低的短链化聚肌苷酸·聚胞苷酸的投药量即使是前述的25倍，和对照群相比也未显现出显著性差异。从上述结果可知，聚肌苷酸·聚胞苷酸的毒性和药理活性一样，和平均链长有极大的关系，这样就完全意外地发现本发明的短链化多核苷酸能够大幅度地缓解毒性。
试验例3对A431癌细胞的细胞增殖抑制作用(体外)(平均链长200±50b)使用实施例13和14的磷酸位移率为0.7～4.2％的聚肌苷酸和磷酸位移率为1.2～3.8％的聚胞苷酸、实施例1和2的短链化聚肌苷酸和聚胞苷酸，与实施例11同样操作获得组合物。将A431癌细胞以104细胞/孔的密度接种在96孔的滴定板中进行5小时以上的培养，确认细胞充分附着在板中后，添加该组合物，继续进行培养，在二氧化碳培养箱内培养3天后，用MTT法测定存活细胞数，再用前述式1求得细胞增殖抑制率，由细胞增殖抑制率算出对应于50％的细胞增殖抑制率的聚肌苷酸钠盐和聚胞苷酸钠盐的合计浓度(IC50值)，其结果如表7所示。
表7
从表7可看出，该组合物对癌细胞A431的细胞增殖抑制作用和磷酸位移率有很大的关系。即，不论是聚肌苷酸还是聚胞苷酸，从3’位转移到2’位的磷酸基团越多，显现出越弱的增殖抑制作用。值得注意的是，本发明的磷酸位移率较低的短链化聚肌苷酸、短链化聚胞苷酸(磷酸位移率在3％以下，特别好的在2％以下)的组合对细胞的增殖抑制作用大幅度增强。此外，磷酸位移率为3％，特别是超过2％的聚肌苷酸和聚胞苷酸的组合虽然有协同作用，但增殖抑制作用有减弱的趋势。例如，表7中，磷酸位移率为2.0％和1.9％的聚肌苷酸和聚胞苷酸的组合和同样的磷酸位移率为2.8％及2.7％或4.2％及3.8％的聚肌苷酸和聚胞苷酸的组合相比，IC50之比提高12倍或47倍。极为意外地发现，以3’位转移到2’位的磷酸位移率为3％，特别是2％为界，药理活性有了急剧提高。
试验例4 因磷酸位移而造成的熔解温度(Tm)和药理活性的变化在温度上升到特定温度时，双链RNA被分解为单链RNA。由于该温度因包含在RNA中的碱基种类的不同而显现出特定值，所以该温度为双链RNA的熔解温度，一般被称为Tm值。在对该Tm值进行测定时可采用各种方法，但本实施例使用最普通的吸光光度法对实施例15及比较例5的双链RNA的Tm值进行测定，其结果如表8所示。此外，同样记录在表8中的IC50值是试验例3的测定结果。
表8
各组合物的磷酸位移率约为0～4％的聚肌苷酸·聚胞苷酸的Tm值测定结果无明显差异(一般作为干扰素诱导剂使用的长链聚肌苷酸·聚胞苷酸的Tm值为61℃)。即，由磷酸位移率约为0～4％的聚肌苷酸·聚胞苷酸获得了以双链RNA为特征的双重螺旋结构。但是，从试验例3可知，由于以2％～3％的磷酸位移率为界的多核苷酸的药理活性提高4倍～50倍不等，所以意外地发现作为聚肌苷酸·聚胞苷酸的主要药效的免疫活性作用和抗癌作用不仅受双链RNA的双重螺旋结构的影响，还受磷酸基团的位移率的影响。而且，从3’位转移到2’位的磷酸基团的位移率在2％～3％的范围内时，其药理活性急剧提高。
试验例5 短链化多核苷酸的平均链长的测定(GPC法)在以下的凝胶渗透层析(GPC)的操作条件下，用1mg/mL的多核苷酸水溶液进行试验，求得平均链长。
GPC操作条件检测波长UV 260nm柱 Tosoh-TSKgel G5000PWXL 7.8mmφ×300mm流动相 含有7M尿素的50mM的Tris-盐酸缓冲液(pH7.5)流速0.5mL/min.
尺寸标记RNA Ladder(1770 b，1520 b，1280 b，780 b，530b，400 b，280 b，155 b)(Gibco BRL株式会社制)
试验例6 磷酸位移率的测定在1mg/mL的多核苷酸水溶液1mL中加入3.2mL的500U/mL的核酸酶P1(来源于青霉，生化学工业株式会社制)，再加入水稀释至5mL。将该水溶液放置在37℃的热水浴中使反应进行1小时后，加水至10mL。从该反应液中取出3.2mL，在其中加入0.1U/mL的碱性磷酸酶(来源于牛仔的小肠，生化学工业株式会社制)水溶液0.8mL后，在37℃的热水浴中使反应进行30分钟，再对该溶液进行适当的稀释，按照以下的液相色谱法的操作条件进行试验，对含有2’-5’磷酸二酯键的二聚体进行定量，测定磷酸位移率。
液相色谱法操作条件检测波长UV 260nm柱 资生堂Capcell pack C18 UG1205μm 4.6mmφ×250mm流动相 含有5mM硫酸氢四丁基铵的50mM磷酸缓冲液(pH8)和甲醇的混合液(95∶5)流速1mL/min.
权利要求
1.短链化多核苷酸或其盐，其特征在于，2’-5’磷酸二酯键占所有磷酸二酯键的3％以下。
2.如权利要求1所述的短链化多核苷酸或其盐，其中，多核苷酸为聚肌苷酸或其类似物、聚胞苷酸或其类似物、聚腺苷酸或其类似物、或聚尿苷酸或其类似物。
3.如权利要求1或2所述的短链化多核苷酸或其盐，其中，所述短链化多核苷酸或盐的平均链长在0.1k bases～1k bases的范围内。
4.具有双链的多核苷酸或其盐，其特征在于，由权利要求1～3的任一项所述的短链化多核苷酸或其盐中，可形成双链的2个短链化多核苷酸或盐形成。
5.如权利要求4所述的具有双链的多核苷酸或其盐，其中，可形成双链的2个短链化多核苷酸选自聚肌苷酸·聚胞苷酸、聚腺苷酸·聚尿苷酸、聚肌苷酸类似物·聚胞苷酸、聚肌苷酸·聚胞苷酸类似物、聚肌苷酸类似物·聚胞苷酸类似物、聚腺苷酸类似物·聚尿苷酸、聚腺苷酸·聚尿苷酸类似物、聚腺苷酸类似物·聚尿苷酸类似物。
6.权利要求1～3的任一项所述的短链化多核苷酸或其盐的制法，其特征在于，在pH值为7～10的溶液中，在20～110℃的温度条件下，使多核苷酸或其盐短链化。
7.如权利要求1～3的任一项所述的短链化多核苷酸或其盐，其特征还在于，多核苷酸或其盐通过磷酸二酯酶短链化。
8.含有复合体的组合物，其特征在于，所述复合体以可将药物移入细胞内的有效载体和权利要求1～3的任一项所述的短链化多核苷酸或其盐，或权利要求4或5所述的具有双链的短链化多核苷酸或其盐为必须构成组分。
9.如权利要求8所述的组合物，其中，可将药物移入细胞内的有效载体为带有正电荷的载体。
10.如权利要求9所述的组合物，其中，带有正电荷的载体为阳离子脂质体。
11.如权利要求8所述的组合物，其中，可将药物移入细胞内的有效载体以2-o-(2-二乙基氨基乙基)氨基甲酰基-1，3-o-二油酰基甘油和磷脂为必须构成组分。
12.如权利要求8～11的任一项所述的组合物，其中，所述组合物为药剂。
13.如权利要求12所述的组合物，其中，所述药剂为干扰素诱导剂、免疫活性剂、细胞内核酸酶活性剂、癌治疗剂或预防剂、肝炎治疗剂或预防剂。
全文摘要
本发明的目的是提供作为医药品特别有用的短链化多核苷酸或含有短链化多核苷酸的医药组合物。本发明的短链化多核苷酸或其盐、以及含有其中任1种的医药组合物的特征是,2’－5’磷酸二酯键占所有磷酸二酯键的3%以下。
文档编号A61P43/00GK1340055SQ00803787
公开日2002年3月13日 申请日期2000年2月14日 优先权日1999年2月15日
发明者松山伸二, 石山幸一, 关纯造, 大木忠明 申请人:日本新药株式会社
技术领域：
本发明涉及作为医药品特别有效的短链化多核苷酸及其制备方法。具体来讲，本发明是以合成的短链化多核苷酸或其盐中的2’-5’磷酸二酯键占全部磷酸二酯键的3％以下，即，对应于所有磷酸二酯键的磷酸基团，从3’位转移到2’位的磷酸基团的比例(磷酸位移率)在3％以下为特征的短链化多核苷酸或其盐，以及它们的制备方法。
背景技术：
聚肌苷酸·聚胞苷酸，即，以聚[I]·聚[C]为代表的多核苷酸是本领域技术人员公知的化合物，由于其具备干扰素诱导作用和免疫活性作用等，所以，对其作为肝炎治疗剂和癌治疗剂使用的可能性进行了研究。
多核苷酸的药理作用与其链长有关，链越长，其干扰素诱导作用等越强。但是，反过来考虑，链越长显现出的毒性也越强。
最近，尝试对多核苷酸进行水解，将获得的合成的短链化多核苷酸封入象阳离子脂质体那样的可将药物移入细胞内的有效载体中的方法，这样不仅能够维持多核苷酸的有效药理作用，还可减弱毒性(例如，PCT WO 99/20283号、PCTWO 99/48531号)。
但是众所周知，如果象以上所述那样通过水解而使多核苷酸短链化，则在短链化的同时因为伪旋转机理而使部分磷酸基团从3’位转移2’位发生分子内位移(参考《蛋白质、核酸、酶》Vol.40，No.10，pp1323-1332(1995))。其结果是，短链化多核苷酸分子内的部分3’-5’磷酸二酯键被2’-5’磷酸二酯键置换。这种磷酸基团的位移现象是否会影响到药理作用等目前还不清楚。
发明的揭示本发明的目的是提供作为医药品有效且安全的短链化多核苷酸及其盐，以及其短链化双链多核苷酸及其盐。
本发明者们经过认真研究后发现了在短链化反应时生成的2’-5’磷酸二酯键仅在一定比例以下的短链化多核苷酸及其盐中，解决了上述问题，从而完成了本发明。
本发明之一是短链化多核苷酸或盐，其特征是，2’-5’磷酸二酯键占所有磷酸二酯键的3％以下，更好是2％以下。
此外，本发明还涉及上述2’-5’磷酸二酯键占所有磷酸二酯键的3％以下，更好是2％以下的短链化多核苷酸或其盐中，由可形成双链的2个短链化多核苷酸或其盐构成的双链短链化多核苷酸或其盐。本发明进一步涉及包含以可将药物移入细胞内的有效载体和上述2’-5’磷酸二酯键占所有磷酸二酯键的3％以下的短链化多核苷酸或其盐，或和可形成双链的2个短链化多核苷酸或其盐形成的具有双链的短链化多核苷酸或盐为必须构成组分的复合体的组合物。
本发明的多核苷酸是各种核苷酸通过磷酸二酯键发生直链聚合反应形成的化合物，核苷酸数大约在20个以上，可以是天然的也可以是合成的。具体例子包括聚肌苷酸(即，聚(I))或其类似物、聚胞苷酸(即，聚(C))或其类似物、聚腺苷酸(即，聚(A))或其类似物、或聚尿苷酸(即，聚(U))或其类似物。
聚肌苷酸类似物是全部或部分肌苷酸经过化学修饰而获得的均聚物，或肌苷酸和其他核苷酸的共聚物。例如，聚(7-脱氮肌苷酸)、聚(2’-叠氮肌苷酸)。聚胞苷酸类似物是全部或部分胞苷酸经过化学修饰而获得的均聚物，或胞苷酸和其他核苷酸的共聚物。例如，聚(5-溴胞苷酸)、聚(2-硫代胞苷酸)、聚(胞苷酸-5’-硫代磷酸)、聚(胞苷酸、尿苷酸)、聚(胞苷酸、4-硫代尿苷酸)、聚(1-乙烯基胞苷酸)。聚腺苷酸类似物和聚尿苷酸类似物也是如此。其中，适合于本发明的是聚肌苷酸和聚胞苷酸。
本发明的短链化多核苷酸的平均链长一般为0.1k bases～1kbases(base碱基的个数，1k bases表示1000个碱基，以下将“base(s)”简称为“b”)，较好是200b～800b，更好为300b～600b。该平均链长如下面的试验例5所述，可以通过凝胶渗透色谱法(gel permeation chromatography，以下称为“GPC法”)容易地确定。
本发明的短链化多核苷酸的磷酸位移率一般在3％以下，较好在2％以下或0.1％～2％，更好是在1％以下或0.1％～1％。
多核苷酸的磷酸基团从3’位向2’位转移可通过下面的试验例6所述的方法容易地确认。即，用核酸酶P1选择性地对3’-5’磷酸二酯键进行水解，使多核苷酸分解为核苷、核苷酸及寡核苷酸后，再用碱性磷酸酶选择性地对末端的磷酸基团进行水解，使全部核苷酸转变为核苷。另一方面，具有未被核酸酶P1分解的2’-5’磷酸二酯键的寡核苷酸即使用碱性磷酸酶处理，其分子内的2’-5’磷酸二酯键也不会被水解，所以不能够分解为核苷。用液相色谱法对核苷和寡核苷酸(大部分为二聚体)进行定量，求得磷酸的位移率。
本发明的可形成双链的2个短链化多核苷酸包括聚肌苷酸和聚胞苷酸、聚腺苷酸和聚尿苷酸、聚肌苷酸类似物和聚胞苷酸、聚肌苷酸和聚胞苷酸类似物、聚肌苷酸类似物和聚胞苷酸类似物、聚腺苷酸类似物和聚尿苷酸、聚腺苷酸和聚尿苷酸类似物、聚腺苷酸类似物和聚尿苷酸类似物。因此，由可形成双链的2个短链化多核苷酸形成的具有双链的短链化多核苷酸包括聚肌苷酸·聚胞苷酸、聚腺苷酸·聚尿苷酸、聚肌苷酸类似物·聚胞苷酸、聚肌苷酸·聚胞苷酸类似物、聚肌苷酸类似物·聚胞苷酸类似物、聚腺苷酸类似物·聚尿苷酸、聚腺苷酸·聚尿苷酸类似物、聚腺苷酸类似物·聚尿苷酸类似物。其中，聚肌苷酸·聚胞苷酸是适合于本发明的具有双链的短链化多核苷酸。
上述具有双链的短链化多核苷酸的平均链长可以认为是全部短链化多核苷酸的平均链长。该平均链长作为具有双链的短链化多核苷酸的外观平均链长可用碱基对的个数表示。因此，上述具有双链的短链化多核苷酸的平均链长一般为0.1k bp～1k bp(bp碱基对的个数，1k bp为1000个碱基对)，较好为200bp～800bp，更好为300bp～600bp。
本发明的短链化多核苷酸盐及具有双链的短链化多核苷酸盐只要是医药上允许的盐，对其无特别限定。例如，钠盐和钾盐。
可将药物移入细胞内的有效载体可采用带有正电荷的载体，其具体例子包括聚-L-赖氨酸等阳离子性聚合物和Lipofectin、Lipofectamine、Lipofectace、DMRIE-C等阳离子脂质体，还包括PCT WO 94/19314号公报揭示的被认为是同一类的载体。例如，以具有以下结构式[I]的2-O-(2-二乙基氨基乙基)氨基甲酰基-1，3-O-二油酰基甘油 和磷脂(例如，磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、卵磷脂、大豆磷脂、它们的氢化磷脂)为必须构成组分的药物载体。
上述阳离子脂质体带有正电荷，与带有负电荷的多核苷酸或寡核苷酸形成静电复合体，该复合体和细胞膜融合的同时，多核苷酸或寡核苷酸被移入细胞内。这种复合体被称为“lipoplex”。
以下对本发明的短链化多核苷酸的制备方法进行详细说明。例如，在适当的pH范围内和适当的温度范围内使作为起始原料的多核苷酸溶液加热水解就可制得。此时，水溶液的pH以在7以上的碱性为宜，更好是pH7～10。此外，如果考虑到短链化反应的速度和碱基部分的稳定性，pH更好为8～9。另一方面，从碱基的稳定性考虑，反应温度应在20～110℃的范围内，更好是在40～100℃。但是，考虑到足够的水解速度和碱基部分的稳定性，反应温度最好在50～90℃的范围内。
更具体来讲，例如，将多核苷酸搅拌溶解于水，如注射用水、注射用蒸馏水或生理盐水中，用缓冲液或pH调节剂将pH值调整为8～9。然后，在50～90℃的反应温度范围内，一边监控平均链长和磷酸的位移率，一边进行0.5～60小时的加热水解，就能够制得磷酸位移率较低、且具有0.1kb～1kb的平均链长的短链化多核苷酸。
pH的调整可采用医药上允许的添加剂，例如，缓冲液或pH调节剂。具体例子包括氨基乙酸(别名甘氨酸)、三羟基甲基氨基甲烷(别名Tris)、碳酸钠、碳酸氢钠(别名重碱)、氢氧化钠、二乙醇胺、三乙醇胺等缓冲液和pH调节剂。对它们的种类、组合和浓度等无任何限定。
如果对反应液进行透析处理或活性炭处理等，能够将单体和不需要的盐、杂质、短链化生成的反应副产品排出到反应系统外。
此外，在适当的pH范围内和适当的温度范围内，以多核苷酸溶液为起始原料，用磷酸二酯酶也可制得本发明的短链化多核苷酸。此时反应液的pH一般在4～9的范围内，更好是5～8的范围内。此外，考虑到反应时的磷酸位移，pH值最好在6～7的范围内。另一方面，考虑到酶的性质，反应温度一般在20～60℃的范围内，更好是在25～50℃的范围内。但是，要获得足够的水解速度，避免酶反应以外的热对水解的影响，且不引发磷酸基团的位移，反应温度最好在30～40℃的范围内。
更具体来讲，在多核苷酸中加水(注射用水、注射用蒸馏水和生理盐水等)搅拌并溶解。如有需要，添加缓冲液和pH调节剂来调整pH值。然后，加入核酸酶P1等磷酸二酯酶，在30～40℃的反应温度范围内，一边监控平均链长和磷酸位移率，一边进行短链化反应，制得磷酸位移较少、且具有0.1kb～1kb的平均链长的短链化多核苷酸。对酶的浓度和反应条件等无任何限定。
如果对反应液进行乙醇沉淀、透析处理和活性炭处理等，能够将单体、不需要的盐、杂质、短链化反应生成的副产品等排除到反应系统外。
通过适当的膜分离能够对短链化多核苷酸进行精制。例如，以分离出本发明的平均链长为0.1kb～1kb的短链化多核苷酸为目的，可采用超滤膜等。对该滤膜的材质或孔径等无任何限定。
作为起始原料的多核苷酸可以是天然的也可以是合成的，对盐的种类和链长也无特别限定。天然的多核苷酸包括tRNA和聚腺苷酸。合成的聚核苷酸能够由以聚核苷酸磷酸化酶为代表的RNA合成酶和其固定化酶制得。此外，作为干扰素诱导剂的市售的聚肌苷酸钠盐和聚胞苷酸钠盐等也可作为起始原料使用。
在适当的溶液(例如，含有0.15M NaCl的10mM的Tris-盐酸缓冲液(pH7))中，混入以上获得的磷酸位移率较低的短链化多核苷酸中可形成双链的2个短链化多核苷酸，能够获得本发明的具有双链的短链化多核苷酸，此外，利用常规方法进行退火也能够获得。退火的方法包括将含有可形成双链的2个短链化多核苷酸的溶液升温至70～80℃，再慢慢冷却的方法。
此外，可以对以上获得的磷酸位移率较低的短链化多核苷酸或具有双链的短链化多核苷酸进行冷冻干燥处理，这样就能够制得可长期保存的冷冻干燥品。冷冻干燥处理可采用常规方法进行。例如，对在上述条件下获得的短链化多核苷酸溶液进行过滤灭菌处理后，将滤液注入经过热空气灭菌处理的金属容器中，在-40℃～-20℃的棚温下进行1～4小时的预冷，一次干燥后，在15～30℃的棚温下减压进行二次干燥(时间为10～50小时左右)，就能够获得冷冻干燥品。一般，在上述冷冻干燥品中添加适当的溶液(注射用水、注射用蒸馏水、生理盐水、麦芽糖溶液和葡萄糖溶液等)使其溶解就可使用。
本发明的组合物，即，包含以可将药物移入细胞内的有效载体和2’-5’磷酸二酯键占所有磷酸二酯键的3％以下的短链化多核苷酸、可形成双链的2个短链化多核苷酸或由可形成双链的2个短链化多核苷酸形成的具有双链的短链化多核苷酸为必须构成组分的复合体(以下称为“本复合体”)的组合物能够通过和脂质体的常规制备方法同样的方法制得。具体来讲，在可将药物移入细胞内的有效载体，例如阳离子脂质体或其原料(例如，2-O-(2-二乙基氨基乙基)氨基甲酰基-1，3-O-二油酰基甘油等甘油衍生物及磷脂)中加入水(注射用水、注射用蒸馏水和生理盐水等)，搅拌混合后，用适当的分散机，例如，均质混合机、均化机、超声波分散机、超声波均化机、高压乳化分散机、Microfluidizer(商品名)、Nanomizer(商品名)、De Bee 2000(商品名)、Ultimizer(商品名)、Manton-Gaulin型高压均化机进行分散处理。然后，在该脂质分散液中加入本发明的短链化多核苷酸或具有双链的短链化多核苷酸，再次用适当的分散机进行分散处理，获得本复合体之后，进行过滤灭菌等灭菌处理，就能够制得作为注射剂的本发明组合物。在制备时的适当步骤中还可添加其他任意的添加剂，对其无特别限定。此外，预先混合可将药物移入细胞内的有效载体，例如，阳离子脂质体或其原料(例如，2-O-(2-二乙基氨基乙基)氨基甲酰基-1，3-O-二油酰基甘油等甘油衍生物及磷脂)和本发明的短链化多核苷酸或具有双链的短链化多核苷酸，然后在该混合物中加入水，同时进行分散处理。此外，上述各种制备方法中，还可包括适当的粗分散步骤。
此外，可以对以上获得的本发明的组合物进行冷冻干燥处理，这样就能够制得可长期保存的本发明组合物的冷冻干燥制剂。冷冻干燥处理可采用常规方法进行。例如，在上述分散处理后进行过滤灭菌处理，然后将所得本发明组合物定量地分别注入小瓶中。在-40℃～-20℃的条件下进行约2～3小时的预冷，然后在约0～10℃的减压条件下进行一次干燥，再在约15～25℃的减压条件下进行二次干燥，进行冷冻干燥。接着，一般用氮气等惰性气体置换掉小瓶内部的空气，加盖后就可获得本发明组合物的冷冻干燥制剂。
一般，用任何适当的溶液对本发明组合物的冷冻干燥制剂进行再溶解就可使用。进行再溶解时，可采用注射用水、注射用蒸馏水、生理盐水、麦芽糖溶液、葡萄糖溶液和其他普通的输液等。
本发明组合物及其冷冻干燥制剂可作为药物制剂使用。作为药物制剂的本发明组合物及其冷冻干燥制剂能够发挥出多核苷酸所具有的药理作用。因此，该药物制剂的具体例子包括干扰素诱导剂、免疫活化剂、细胞内核酸酶活化剂、癌治疗剂或预防剂、肝炎治疗剂或预防剂。
实施发明的最佳方式例举实施例和试验例对本发明进行更为详细的说明，但本发明并不仅限于这些实施例和试验例中。
参考例1在8g肌苷-5’-二磷酸三钠盐及1g氯化镁中加入500mL 0.1M的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，搅拌溶解。然后，添加6N的氢氧化钠将pH值调整到9.3，于38℃静置1小时。再添加1mL多核苷酸磷酸化酶溶液，于38℃反应18小时。接着，在上述反应液中加入25mL 0.2M的乙二胺四乙酸使反应停止，再加入10mL饱和食盐水和500mL无水乙醇，使聚肌苷酸(1973 b)沉淀。
参考例2在10g胞苷-5’-二磷酸三钠盐及3g氯化锰中加入约1L 0.2M的碳酸氢钠-氢氧化钠缓冲液，搅拌溶解。然后，添加6N的氢氧化钠将pH值调整到9.8，于36℃静置1小时。接着，添加2mL精制的多核苷酸磷酸化酶溶液，于36℃反应24小时。再添加50mL 0.2M的乙二胺四乙酸使反应停止，最后在反应液中加入20mL饱和食盐水和1L无水乙醇，使聚胞苷酸(3300 b)沉淀。
实施例1对参考例1获得的聚肌苷酸进行离心分离，在沉淀物中加入500mL注射用水进行再溶解，然后进行透析处理。用活性炭对透析内液进行处理后，通过过滤除去活性炭，再在滤液中加入6N的氢氧化钠，将pH值调整为8.5。接着，于70℃进行8小时的加热水解使该聚肌苷酸短链化，再用活性炭对上述短链化多核苷酸进行处理，过滤除去活性炭后，进行透析处理。对透析内液过滤灭菌后，用常规方法对滤液进行冷冻干燥处理，获得1.9g磷酸位移率较低的本发明的短链化多核苷酸(聚肌苷酸钠盐)的冷冻干燥制品(磷酸位移率为0.2％，平均链长为360 b)。
实施例2对参考例2获得的聚胞苷酸进行离心分离，在沉淀物中加入500mL注射用水进行再溶解，然后进行透析处理。用活性炭对透析内液进行处理后，通过过滤除去活性炭，再在滤液中加入6N的氢氧化钠，将pH值调整为9.0。接着，于80℃进行4小时的加热水解使该聚胞苷酸短链化，再用活性炭对上述短链化多核苷酸进行处理，过滤除去活性炭后，进行透析处理。对透析内液过滤灭菌后，用常规方法对滤液进行冷冻干燥处理，获得2.7g磷酸位移率较低的本发明的短链化多核苷酸(聚胞苷酸钠盐)的冷冻干燥制品(磷酸位移率为0.1％，平均链长为318 b)。
实施例3在1g聚胞苷酸钠盐(S020，w(沉降系数)7.2，生化学工业株式会社制)中加入200mL 0.1M的Tris-盐酸缓冲液(pH8.0)，搅拌溶解后，一边用试验例5记载的方法监控平均链长，一边于60℃进行48小时的加热水解使该聚腺苷酸短链化，再用活性炭对上述短链化多核苷酸进行处理，通过常规方法对透析内液进行冷冻干燥处理，获得0.3g磷酸位移率较低的本发明的短链化多核苷酸(聚腺苷酸钠盐)的冷冻干燥制品(磷酸位移率为1.9％，平均链长为154 b)。
实施例4在1g聚尿苷酸钠盐(S020，w(沉降系数)6.5，生化学工业株式会社制)中加入200mL 0.2M的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH9.0)，搅拌溶解后，一边用试验例5记载的方法监控平均链长，一边于60℃进行25小时的加热水解使该聚尿苷酸短链化。对上述短链化多核苷酸进行透析处理后，通过常规方法对透析内液进行冷冻干燥处理，获得0.2g磷酸位移率较低的本发明的短链化多核苷酸(聚尿苷酸钠盐)的冷冻干燥制品(磷酸位移率为1.2％，平均链长为108 b)。
实施例5在250mg聚肌苷酸钠盐(S020，w(沉降系数)8.8，Yamasa酱油株式会社制)中加入50mL 0.1M的Tris-盐酸缓冲液(pH8.0)，搅拌溶解后，在50～120℃的适当的短链化温度下对上述溶液进行加热，然后一边用试验例5记载的方法监控平均链长，一边对任意链长的聚肌苷酸进行取样，其结果如表1所示。分别对所得试样溶液进行透析后，通过常规方法进行冷冻干燥处理，获得各种冷冻干燥制品。
表1
实施例6在250mg聚胞苷酸钠盐(S020，w(沉降系数)8.6，Yamasa酱油株式会社制)中加入50mL 0.1M的Tris-盐酸缓冲液(pH9.0)，搅拌溶解后，在55～120℃的适当的短链化温度下对上述溶液进行加热，然后一边用试验例5记载的方法监控平均链长，一边对任意链长的聚胞苷酸进行取样，其结果如表2所示。分别对所得试样溶液进行透析后，通过常规方法进行冷冻干燥处理，获得各种冷冻干燥制品。
表2
从上述实施例5和实施例6可明显看出，使市售的聚肌苷酸钠盐及聚胞苷酸钠盐短链化时，在55℃以下的短链化温度下，不能够进行充分的水解。因此，即使短链化时间超过约50小时，平均链长还是超过1kb。另一方面，由于将短链化温度设定在120℃的试样及将短链化温度设定在90℃的试样的水解反应速度过快，所以很难对短链化进行控制。特别是短链化温度为120℃时，在1～1.5小时的短链化时间内可将多核苷酸分解至接近寡核苷酸的程度。此外，还可确认该试样的磷酸位移率较高，碱基部分也出现了分解。
实施例7在100mg聚腺苷酸钠盐(S020，w(沉降系数)7.2，生化学工业株式会社制)中加入100mL 0.1M的Tris-盐酸缓冲液(pH7.0)，溶解后，在该溶液中加入核酸酶P1(来源于青霉，生化学工业株式会社制)，然后一边用试验例5记载的方法监控平均链长，一边于25℃进行3小时的孵化，使该聚腺苷酸短链化(磷酸位移率为0.1％，平均链长为287 b)。
实施例8在1g尿苷-5’-二磷酸三钠盐及0.3g氯化锰中加入约100mL 0.2M的碳酸氢钠-氢氧化钠缓冲液，搅拌溶解。然后，添加1N的氢氧化钠将pH值调整到9.5后，再添加0.2mL多核苷酸磷酸化酶溶液，一边用试验例5记载的方法监控平均链长，一边于25℃进行10小时的反应。接着，在上述反应液中加入5mL 0.2M的乙二胺四乙酸使反应停止，再加入2mL饱和食盐水和100mL乙醇，使聚尿苷酸(549 b)沉淀。对所得聚尿苷酸进行离心分离，在沉淀物中加入50mL注射用水进行再溶解后再进行透析处理。然后，在透析内液中加入1N的氢氧化钠，将pH值调整到8.5，于80℃进行30分钟的加热水解调节该聚尿苷酸的链长。最后，用超滤膜对上述短链化多核苷酸溶液进行膜分离，在调节链长分布的同时除去不需要的盐、短链化反应时生成的副产品等(磷酸位移率为0.1％，平均链长为485 b)。
实施例9在1g 2-O-(2-二乙基氨基乙基)氨基甲酰基-1，3-O-二油酰基甘油和2g精制卵磷脂中加入溶有40g麦芽糖的100mL注射用水，搅拌混合后，用均化机进行5分钟的分散处理，获得阳离子脂质体(载体)的粗分散液。然后，用实验室用小型乳化分散机对该粗分散液进行1小时的分散处理，获得阳离子脂质体溶液。在搅拌下缓缓地在该阳离子脂质体溶液中加入约50mL分别含有200mg实施例1及实施例2制得的磷酸位移率较低的短链化聚肌苷酸钠盐及聚胞苷酸钠盐的水溶液后，用实验室用小型乳化分散机对该水溶液进行2小时的分散处理，最后用注射用水定容至400mL，获得含有本复合体的组合物。对该含有本复合体的组合物进行过滤灭菌处理后，将其1mL一份分别注入小瓶中，然后按照常规方法制成冷冻干燥制剂。用注射用水重组冷冻干燥制剂，使其为1mL时的本复合体的平均粒径为133nm(光子相关法)。
实施例10在50g 2-O-(2-二乙基氨基乙基)氨基甲酰基-1，3-O-二油酰基甘油和25g大豆磷脂中加入溶有1kg蔗糖的3L注射用水，搅拌混合后，用Manton-Gaulin型高压均化机进行30分钟的分散处理，再用注射用水定容至5L，获得阳离子脂质体(载体)的分散液。然后，在搅拌下缓缓地在该阳离子脂质体溶液中加入约2L分别含有1g实施例1及实施例2制得的磷酸位移率较低的短链化聚肌苷酸钠盐及聚胞苷酸钠盐的水溶液，再用1N的盐酸将pH值调整为5.5。接着，再次用Manton-Gaulin型高压均化机进行1小时的分散处理，最后用注射用水定容至10L，获得含有本复合体的组合物。将含有本复合体的组合物20mL一份分别注入小瓶中后，按照常规方法制成冷冻干燥制剂。用注射用水重组冷冻干燥制剂，使其为20mL时的本复合体的平均粒径为158nm(光子相关法)。
实施例11在1g 2-O-(2-二乙基氨基乙基)氨基甲酰基-1，3-O-二油酰基甘油和2g卵磷脂中加入溶有40g葡萄糖的100mL注射用水，搅拌混合后，用均化机进行5分钟的分散处理，再定容至500mL，获得阳离子脂质体(载体)的粗分散液。接着，用实验室用小型乳化分散机对粗分散液进行1小时的分散处理，获得阳离子脂质体溶液。将所得溶液10mL一份分别注入小瓶中，按照常规方法进行冷冻干燥。在该冷冻干燥品中加入10mL分别含有5mg实施例1、2或5、6获得的磷酸位移率较低的短链化聚肌苷酸钠盐和聚胞苷酸钠盐，以及市售的聚肌苷酸钠盐(S020，w(沉降系数)8.8，Yamasa酱油株式会社制)和聚胞苷酸钠盐(S020.w(沉降系数)8.6，Yamasa酱油株式会社制)的水溶液，然后，用探针型超声波分散机进行10分钟的分散处理，获得含有本复合体的组合物。
实施例12搅拌下混合1mL分别含有100μg实施例3及4获得的磷酸位移率较低的短链化聚腺苷酸钠盐和聚尿苷酸钠盐的水溶液及2mL含有2mg市售Lipofectin(商品名)的水溶液，然后用探针型超声波分散机进行15分钟的分散处理，获得含有本复合体的组合物。
实施例13在约200mg聚肌苷酸钠盐(S020.w(沉降系数)8.8，Yamasa酱油株式会社制)中加入0.2M的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH5.2)，搅拌溶解后，加热至80℃，然后，一边用试验例6记载的方法对磷酸位移率进行监控，一边对具有任意的磷酸位移率的聚肌苷酸进行取样。接着，在硼酸缓冲液(pH 8.5)中将具有各种磷酸位移率的聚肌苷酸加热至60℃，再用试验例5记载的方法一边监控链长一边使聚肌苷酸短链化，使其平均链长达到200±50 b，其结果如表3所示。分别对所得短链化聚肌苷酸溶液进行透析处理后，按照常规方法进行冷冻干燥处理，获得冷冻干燥品。
表3
实施例14在约200mg聚胞苷酸钠盐(S020，w(沉降系数)8.6，Yamasa酱油株式会社制)中加入0.2M的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH5.2)，搅拌溶解后，加热至80℃，然后，一边用试验例6记载的方法对磷酸位移率进行监控，一边对具有任意的磷酸位移率的聚胞苷酸进行取样。接着，在硼酸缓冲液(pH8.5)中将具有各种磷酸位移率的聚胞苷酸加热至70℃，再用试验例5记载的方法一边监控链长一边使聚胞苷酸短链化，使其平均链长达到200±50 b，其结果如表4所示。分别对所得短链化聚胞苷酸溶液进行透析处理后，按照常规方法进行冷冻干燥处理，获得冷冻干燥品。
表4
实施例15具有双链的短链化多核苷酸分别调制由实施例1、2、13及14获得的磷酸位移率为0.7％的聚肌苷酸和磷酸位移率为1.2％的聚胞苷酸组合而成的具有双链的短链化多核苷酸(双链RNA)，磷酸位移率为2.0％的聚肌苷酸和磷酸位移率为1.9％的聚胞苷酸组合而成的具有双链的短链化多核苷酸(双链RNA)，磷酸位移率为2.8％的聚肌苷酸和磷酸位移率为2.7％的聚胞苷酸组合而成的具有双链的短链化多核苷酸(双链RNA)。将各聚肌苷酸钠盐和聚胞苷酸钠盐溶于Tris-盐酸缓冲液(pH7，含有0.15M的氯化钠)，于80℃加热5分钟后，慢慢冷却就可获得各种具有双链的短链化多核苷酸。
比较例1(对应于实施例1的以往制法-1)在5mg聚肌苷酸钠盐(S020，w(沉降系数)8.8，Yamasa酱油株式会社制)中注入10mL注射用水，搅拌溶解后，在该溶液中加入10mL甲酰胺，于80℃加热5小时(磷酸位移率为8.9％，平均链长为628 b)。
比较例2(对应于实施例2的以往制法-1)在5mg聚胞苷酸钠盐(S020，w(沉降系数)8.6，Yamasa酱油株式会社制)中注入10mL注射用水，搅拌溶解后，在该溶液中加入10mL甲酰胺，于80℃加热5小时(磷酸位移率为4.2％，平均链长为751 b)。
比较例3(对应于实施例1的以往制法-2)在5mg聚肌苷酸钠盐(S020，w(沉降系数)8.8，Yamasa酱油株式会社制)中注入10mL注射用水，搅拌溶解后，于90℃对该溶液进行8小时的加热(磷酸位移率为7.1％，平均链长为213 b)。
比较例4(对应于实施例2的以往制法-2)在5mg聚胞苷酸钠盐(S020，w(沉降系数)8.6，Yamasa酱油株式会社制)中注入10mL注射用水，搅拌溶解后，于90℃对该溶液进行12小时的加热(磷酸位移率为4.2％，平均链长为289 b)。
比较例5调制分别由实施例13和14获得的磷酸位移率为4.2％的聚肌苷酸和磷酸位移率为3.8％的聚胞苷酸组合而成的具有双链的短链化多核苷酸(双链RNA)。将作为多核苷酸的聚肌苷酸钠盐和聚胞苷酸钠盐溶于Tris-盐酸缓冲液(pH7，含有0.15M的氯化钠)，于80℃加热5分钟后，慢慢冷却就可获得该具有双链的短链化多核苷酸。
试验例1平均链长对药理活性的影响根据对HeLa S3癌细胞的细胞增殖抑制作用(体外)对实施例9的组合物的药理活性进行评估。进行实验时，将HeLa S3癌细胞以104细胞/孔的密度接种在96孔的滴定板中进行24小时或更长时间的培养，确认细胞充分附着在板中后，添加该组合物，继续进行培养。在CO2培养箱内培养3天后，用MTT法测定存活细胞数，再用下式算出细胞增殖抑制率，其结果如表5所示。
细胞增殖抑制率(％)＝(复合体处理群的吸光度值/对照群的吸光度)×100
表5
(a)聚肌苷酸钠盐(Yamasa酱油株式会社制)(b)聚胞苷酸钠盐(Yamasa酱油株式会社制)如表5所示，各组合物对作为癌细胞株的HeLa S3的细胞增殖抑制作用和平均链长有很大关系。表5中，一般作为干扰素诱导剂使用的1000 b以上的长链聚肌苷酸·聚胞苷酸显现出最强的增殖抑制作用，本发明的平均链长在0.1kb～1kb范围内的磷酸位移率较低的短链化聚肌苷酸·聚胞苷酸虽然略低，但也保持了足够强的增殖抑制作用。此外，当平均链长不足100 b时细胞增殖抑制作用急剧下降，接近寡核苷酸程度的多核苷酸几乎不显现活性。
试验例2对骨髓细胞的影响对骨髓毒性进行研究作为毒性评估。对ddY小鼠(雄性，8周)静脉注射市售的聚肌苷酸钠盐(S020，w(沉降系数)8.8，Yamasa酱油株式会社制)和聚胞苷酸钠盐(S020，w(沉降系数)8.6，Yamasa酱油株式会社制)，以及实施例5和6中的磷酸位移率较低的聚肌苷酸、聚胞苷酸中平均链长分别为982 b和907 b的多核苷酸，第2天从大腿骨处抽取骨髓细胞。用新亚甲蓝和吉姆萨对细胞进行染色，测定网织红细胞和成熟红细胞，其结果如表6所示。表6的骨髓毒性是指网织红细胞数和全部红细胞数之比，由下式定义。此外，*标记为显著性水平p＜0.01，表示试验群和静脉内注射了无多核苷酸的载体的对照群的显著性差异(Dunnett的多重比较法)。
骨髓毒性＝(网织红细胞数/网织红细胞数＋成熟红细胞数)表6
(a)聚肌苷酸钠盐(Yamasa酱油株式会社制)(b)聚胞苷酸钠盐(Yamasa酱油株式会社制)从表6可看出，一般作为干扰素诱导剂使用的平均链长超过1000 b的长链聚肌苷酸·聚胞苷酸的投药量即使只有1mg/kg，其对应于对照群的变化也达到了39％，而本发明的平均链长在0.1kb～1kb范围内的磷酸位移率较低的短链化聚肌苷酸·聚胞苷酸的投药量即使是前述的25倍，和对照群相比也未显现出显著性差异。从上述结果可知，聚肌苷酸·聚胞苷酸的毒性和药理活性一样，和平均链长有极大的关系，这样就完全意外地发现本发明的短链化多核苷酸能够大幅度地缓解毒性。
试验例3对A431癌细胞的细胞增殖抑制作用(体外)(平均链长200±50b)使用实施例13和14的磷酸位移率为0.7～4.2％的聚肌苷酸和磷酸位移率为1.2～3.8％的聚胞苷酸、实施例1和2的短链化聚肌苷酸和聚胞苷酸，与实施例11同样操作获得组合物。将A431癌细胞以104细胞/孔的密度接种在96孔的滴定板中进行5小时以上的培养，确认细胞充分附着在板中后，添加该组合物，继续进行培养，在二氧化碳培养箱内培养3天后，用MTT法测定存活细胞数，再用前述式1求得细胞增殖抑制率，由细胞增殖抑制率算出对应于50％的细胞增殖抑制率的聚肌苷酸钠盐和聚胞苷酸钠盐的合计浓度(IC50值)，其结果如表7所示。
表7
从表7可看出，该组合物对癌细胞A431的细胞增殖抑制作用和磷酸位移率有很大的关系。即，不论是聚肌苷酸还是聚胞苷酸，从3’位转移到2’位的磷酸基团越多，显现出越弱的增殖抑制作用。值得注意的是，本发明的磷酸位移率较低的短链化聚肌苷酸、短链化聚胞苷酸(磷酸位移率在3％以下，特别好的在2％以下)的组合对细胞的增殖抑制作用大幅度增强。此外，磷酸位移率为3％，特别是超过2％的聚肌苷酸和聚胞苷酸的组合虽然有协同作用，但增殖抑制作用有减弱的趋势。例如，表7中，磷酸位移率为2.0％和1.9％的聚肌苷酸和聚胞苷酸的组合和同样的磷酸位移率为2.8％及2.7％或4.2％及3.8％的聚肌苷酸和聚胞苷酸的组合相比，IC50之比提高12倍或47倍。极为意外地发现，以3’位转移到2’位的磷酸位移率为3％，特别是2％为界，药理活性有了急剧提高。
试验例4 因磷酸位移而造成的熔解温度(Tm)和药理活性的变化在温度上升到特定温度时，双链RNA被分解为单链RNA。由于该温度因包含在RNA中的碱基种类的不同而显现出特定值，所以该温度为双链RNA的熔解温度，一般被称为Tm值。在对该Tm值进行测定时可采用各种方法，但本实施例使用最普通的吸光光度法对实施例15及比较例5的双链RNA的Tm值进行测定，其结果如表8所示。此外，同样记录在表8中的IC50值是试验例3的测定结果。
表8
各组合物的磷酸位移率约为0～4％的聚肌苷酸·聚胞苷酸的Tm值测定结果无明显差异(一般作为干扰素诱导剂使用的长链聚肌苷酸·聚胞苷酸的Tm值为61℃)。即，由磷酸位移率约为0～4％的聚肌苷酸·聚胞苷酸获得了以双链RNA为特征的双重螺旋结构。但是，从试验例3可知，由于以2％～3％的磷酸位移率为界的多核苷酸的药理活性提高4倍～50倍不等，所以意外地发现作为聚肌苷酸·聚胞苷酸的主要药效的免疫活性作用和抗癌作用不仅受双链RNA的双重螺旋结构的影响，还受磷酸基团的位移率的影响。而且，从3’位转移到2’位的磷酸基团的位移率在2％～3％的范围内时，其药理活性急剧提高。
试验例5 短链化多核苷酸的平均链长的测定(GPC法)在以下的凝胶渗透层析(GPC)的操作条件下，用1mg/mL的多核苷酸水溶液进行试验，求得平均链长。
GPC操作条件检测波长UV 260nm柱 Tosoh-TSKgel G5000PWXL 7.8mmφ×300mm流动相 含有7M尿素的50mM的Tris-盐酸缓冲液(pH7.5)流速0.5mL/min.
尺寸标记RNA Ladder(1770 b，1520 b，1280 b，780 b，530b，400 b，280 b，155 b)(Gibco BRL株式会社制)
试验例6 磷酸位移率的测定在1mg/mL的多核苷酸水溶液1mL中加入3.2mL的500U/mL的核酸酶P1(来源于青霉，生化学工业株式会社制)，再加入水稀释至5mL。将该水溶液放置在37℃的热水浴中使反应进行1小时后，加水至10mL。从该反应液中取出3.2mL，在其中加入0.1U/mL的碱性磷酸酶(来源于牛仔的小肠，生化学工业株式会社制)水溶液0.8mL后，在37℃的热水浴中使反应进行30分钟，再对该溶液进行适当的稀释，按照以下的液相色谱法的操作条件进行试验，对含有2’-5’磷酸二酯键的二聚体进行定量，测定磷酸位移率。
液相色谱法操作条件检测波长UV 260nm柱 资生堂Capcell pack C18 UG1205μm 4.6mmφ×250mm流动相 含有5mM硫酸氢四丁基铵的50mM磷酸缓冲液(pH8)和甲醇的混合液(95∶5)流速1mL/min.
权利要求
1.短链化多核苷酸或其盐，其特征在于，2’-5’磷酸二酯键占所有磷酸二酯键的3％以下。
2.如权利要求1所述的短链化多核苷酸或其盐，其中，多核苷酸为聚肌苷酸或其类似物、聚胞苷酸或其类似物、聚腺苷酸或其类似物、或聚尿苷酸或其类似物。
3.如权利要求1或2所述的短链化多核苷酸或其盐，其中，所述短链化多核苷酸或盐的平均链长在0.1k bases～1k bases的范围内。
4.具有双链的多核苷酸或其盐，其特征在于，由权利要求1～3的任一项所述的短链化多核苷酸或其盐中，可形成双链的2个短链化多核苷酸或盐形成。
5.如权利要求4所述的具有双链的多核苷酸或其盐，其中，可形成双链的2个短链化多核苷酸选自聚肌苷酸·聚胞苷酸、聚腺苷酸·聚尿苷酸、聚肌苷酸类似物·聚胞苷酸、聚肌苷酸·聚胞苷酸类似物、聚肌苷酸类似物·聚胞苷酸类似物、聚腺苷酸类似物·聚尿苷酸、聚腺苷酸·聚尿苷酸类似物、聚腺苷酸类似物·聚尿苷酸类似物。
6.权利要求1～3的任一项所述的短链化多核苷酸或其盐的制法，其特征在于，在pH值为7～10的溶液中，在20～110℃的温度条件下，使多核苷酸或其盐短链化。
7.如权利要求1～3的任一项所述的短链化多核苷酸或其盐，其特征还在于，多核苷酸或其盐通过磷酸二酯酶短链化。
8.含有复合体的组合物，其特征在于，所述复合体以可将药物移入细胞内的有效载体和权利要求1～3的任一项所述的短链化多核苷酸或其盐，或权利要求4或5所述的具有双链的短链化多核苷酸或其盐为必须构成组分。
9.如权利要求8所述的组合物，其中，可将药物移入细胞内的有效载体为带有正电荷的载体。
10.如权利要求9所述的组合物，其中，带有正电荷的载体为阳离子脂质体。
11.如权利要求8所述的组合物，其中，可将药物移入细胞内的有效载体以2-o-(2-二乙基氨基乙基)氨基甲酰基-1，3-o-二油酰基甘油和磷脂为必须构成组分。
12.如权利要求8～11的任一项所述的组合物，其中，所述组合物为药剂。
13.如权利要求12所述的组合物，其中，所述药剂为干扰素诱导剂、免疫活性剂、细胞内核酸酶活性剂、癌治疗剂或预防剂、肝炎治疗剂或预防剂。
全文摘要
本发明的目的是提供作为医药品特别有用的短链化多核苷酸或含有短链化多核苷酸的医药组合物。本发明的短链化多核苷酸或其盐、以及含有其中任1种的医药组合物的特征是,2’－5’磷酸二酯键占所有磷酸二酯键的3%以下。
文档编号A61P43/00GK1340055SQ00803787
公开日2002年3月13日 申请日期2000年2月14日 优先权日1999年2月15日
发明者松山伸二, 石山幸一, 关纯造, 大木忠明 申请人:日本新药株式会社
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