一种陆英提取物及其制备方法

专利名称：：一种陆英提取物及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种陆英提取物及其制备方法，以及含该陆英提取物的组合物。
背景技术：
：陆英(sambucusChineseLindl.)又名接骨木、八棱木、走马风，为忍冬科接骨木属植物，分布于华北、华东、华南、西南及陕西、甘肃、宁夏等省区，以根、茎及叶入药，具有活血化瘀、祛风除湿、通经活络之功效，能治扭伤、腰肌劳损、骨折、风湿痹痛等症。全草含绿原酸、乌苏酸、齐墩果酸、a-香树酯醇、!3-谷甾醇、黄酮及多糖类等成分。陆英为民间常用药，应用广泛。与传统的将质量标准定位与氨基酸及多肽不同，目前研究表明陆英中以乌苏酸为主的三萜类化合物是陆英抗肝炎作用的主要活性成分，能使急性肝损伤大鼠血清SGPT及肝甘油三酯明显下降，血清甘油三酯及肝糖原含量明显增加，并能减轻肝细胞变性、坏死，对急性肝损伤有明显保护作用。因此，众多的研究都将提取制备陆英乌苏酸类成分为研究目的，如李开泉等(李开泉，陈武，等.以陆英为原料提取乌苏酸的工艺研究.中成药[J].2003,25(5):356-358)研究陆英乌苏酸提取工艺，制备得到了高纯度的乌苏酸，中国专利CN1763071A中披露了一种陆英提取物，其是以陆英总三萜为提取物的有效成分，而事实上，具有抗肝炎作用的绝非仅限于含有单一乌苏酸的萜类成分，而是至少应包含有乌苏酸类三萜、黄酮的有效部位。且黄酮类成分还是其活血化瘀、通径活络的主要成分，因此，当将其目标仅定位与乌苏酸类三萜成分时，其药效大打折扣。目前，陆英制剂已有陆英片(卫生部部颁标准WS3-B-0294-90)、陆英冲剂(卫生部部颁标准WS3-B-0295-90)和陆英糖浆(卫生部部颁标准WS3-B-0296-90)等制剂作为，可疏肝健脾、活血化瘀、消肿止痛，临床用于治疗病毒性肝炎以及风湿痹症、跌打损伤引起的疼痛。而这些制剂中，有效部位的提取制备仅仅经水煎煮后直接浓縮，加入所需辅料制成制剂，工艺较为简单粗糙，所得提取物杂质多，服用量大。然而，在现有技术中，以陆英为原料联合提取乌苏酸类三萜成分和总黄酮类成分两种物质的方法，还没有涉及。因此，向深度和广度进一步研究陆英提取物，充分将其乌苏酸类三萜成分和黄酮类成分加于应用，应该具有良好的应用前景。
发明内容本发明要解决的技术问题是从陆英中联合提取乌苏酸类三萜类和总黄酮两类化合物，其目的是提供一种陆英提取物，该提取物中含有重量百分比为25%_40%的总黄酮和30%_50%的总三萜类化合物。本发明的目的还在于提供一种制备陆英提取物的方法，陆英药材粉碎后，以醇浓度为50%95%的醇水混合溶媒提取，得到提取液经浓縮醇沉后，醇沉上清液浓縮去醇，所得浓縮液经聚酰胺吸附树脂柱，分别收集含乌苏酸为主的三萜类化合物和黄酮类成分的洗脱部位，合并，即得所述的陆英提取物；该提取物含有重量百分比分别为25%40%的总黄酮和30%_50%的总三萜类化合物。具体地，本发明陆英提取物的制备方法为陆英药材粉碎后，以醇浓度为50%95%的醇水混合溶媒提取，得到提取液经浓，浓縮液加乙醇调使含醇量为6%80%，搅拌，静置，过滤，取滤液，滤液浓縮去醇，所得浓縮液经聚酰胺吸附树脂柱，依次用0%10%的乙醇、45%60%的乙醇洗脱，分别收集0%-10%的乙醇洗脱部分和45%60%的乙醇洗脱部分；0%10%的乙醇洗脱部分减压浓縮至相对密度为1.001.IO，静置，浓縮液过滤，弃滤液，沉淀以水洗涤3-5次，再用热蒸馏水分散，调pH至10-12，溶解离心弃沉淀，沉淀再调pH至2-3，离心，得沉淀，沉淀干燥即得以乌苏酸为主的三萜类化合物，总三萜含量大于90%，其中乌苏酸含量大于75%;45%60%的乙醇洗脱部分减压浓縮，干燥得黄酮类成分，总黄酮含量大于50%;合并上述两提取物，即得所述的陆英提取物；其中该提取物含有重量百分比分别为25%40%的总黄酮和30%_50%的总三萜类化合物。本发明的陆英提取物，其中个组分重量百分比优选为30%_35%的总黄酮和45%_50%的总三萜类化合物，其中所述总三萜类化合物，标示性成分为乌苏酸，该提取物中乌苏酸的含量为25%_35%，优选为28%-32%。本发明的药物组合物，其含有治疗有效量的陆英提取物和药学可接受的辅料，该陆英提取物含有重量百分比为25%_40%的总黄酮和30%-50%的总三萜。本发明的上述组合物，其可谓任何口服剂型或注射剂型，优选口服剂型，更优选为片剂、胶囊或颗粒剂。上述优选剂型，例如优选偏激，其含有治疗有效量的上述陆英提取物和药学上可接受的偏激辅料，其中该陆英提取物在组合物中的含量为O.1%-99.9%(重量)，优选为10%-60%(重量)，更优选为20%_30%，和所述的辅料为常规辅料，例如选自未经纤维素、乳糖、低取代羟丙基纤维素、交联羧甲基纤维素、预胶化淀粉、微粉硅胶和硬脂酸镁中至少一种。上述组合物可用于治疗病毒性肝炎以及风湿痹症、跌打损伤引起的疼痛等。本发明中，有效成分含量的测定方法为1、总黄酮成分的测定对照品溶液的制备精密称定芦丁对照品10mg，置100ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，精密量取10ml，置100ml容量瓶中，加入甲醇至刻度，摇匀，即得(每lml含芦丁0.Olmg)供试品溶液的制备取陆英提取物，研细，精密称取100mg，置100ml容量瓶中，先加入甲醇适量，超声5min，然后加入甲醇至刻度，摇匀，精密量取续滤液10ml，至100ml容量瓶中，加入甲醇至刻度，摇匀，即得。测定法测定对照品溶液和供试品溶液在334nm处的吸收度，计算。陆英提取物中总黄酮含量为25%40%。2、总三萜类化合物含量测定依据三萜类化合物在高氯酸作用下能与香草醛产生颜色反应，在546nm处有最大吸收，采用分光光度法测定。乌苏酸标准品精确配置浓度为lmg/ml的乌苏酸样品，取0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml置5ml容量瓶中，IO(TC烘干，冷却后，每瓶加入0.5ml5X的香草醛，0.8ml高氯酸，摇匀置6(TC水浴保温10min，取出后，用乙酸定容至5ml，摇匀后，546nm测定吸收值，以浓度对光吸收值做标准曲线。样品配置取陆英，同法配置成lmg/ml样品夜，取0.1、0.2、0.3ml分别置5ml容量瓶中IO(TC烘干，冷却后，每瓶加入O.5ml5X的香草醛，0.8ml高氯酸，摇匀置6(TC水浴保温10min，取出后，用乙酸定容至5ml，摇匀后，546nm测定吸收值，对比标准曲线计算样品总三萜的含量。陆英提取物中总三萜的重量百分含量为30%-50%。3、乌苏酸含量测定对照品溶液的配置精密称取乌苏酸对照品9.6mg，至10ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成lml含0.96mg的对照品溶液，分别吸取对照品溶液25、100、200、400和600iil至5ml容量瓶中，用甲醇顶容至刻度。样品溶液的配置精密称取陆英提取物100mg，置100ml容量瓶中，先加入甲醇适量，超声5min，然后加入甲醇至刻度，摇匀，精密量取续滤液10ml，至100ml容量瓶中，加入甲醇至刻度，摇匀，即得。测定用RP-HPLC法测定，色谱条件检测波长210nm，流动相甲醇_水(体积比为87:13);流速1.Oml/min;柱温35°C，测定样品中乌苏酸的含量。陆英提取物中乌苏酸的含量为25%-35%。具体实施例以下实施例仅仅是为了更为清楚地说明本发明的实施方式，而不是限制本发明，在本发明范围类做合理的变动，本领域的技术人员很容易做到。实施例1取干燥陆英全草2000g，加60%的乙醇回流提取3次，每次1.5小时，过滤，合并滤液，滤液减压浓縮至相对密度为1.IO，加乙醇，搅拌，使含醇量为60%，静置，室温放置过夜，过滤，取滤液，滤液继续减压浓縮至无醇味，浓縮液上聚酰胺树脂柱，开始以5%的乙醇洗脱，弃起始流出夜为浑浊的馏分，待馏分变清，开始收集3个柱体积量的馏分，备用；改用60%的乙醇洗脱，收集60%的乙醇洗脱部分，备用；5%的乙醇洗脱部分，减压浓縮至无醇味、相对密度为1.00的浓縮液，冷却，静置24小时，过滤，得沉淀，沉底以蒸馏水洗涤3次后，加水分散，以NaOH调pH为11，静置，析出沉淀，过滤，沉淀以pH为11的碱水洗涤，将洗涤液并入滤液中，所得滤液再加盐酸调pH至3，静置，过滤，得沉淀，沉淀以蒸馏水洗涤至水洗涤液为中性，洗涤后的沉淀干燥，即得三萜类提取物A5.2g;60X的乙醇洗脱部分减压浓縮，干燥，得总黄酮提取物B10.6g;合并三萜类提取物和总黄酮类提取物，即得本发明陆英提取物。经测定，陆英提取物中，总黄酮含量为32%，总三萜类重量百分比为47%，其中标示性成分乌苏酸的重量百分含量为30%。实施例2取干燥陆英全草2000g，加80%的乙醇回流提取3次，每次2小时，过滤，合并滤5液，滤液减压浓縮至相对密度为1.20，加乙醇，搅拌，使含醇量为75%，静置，室温放置过夜，过滤，取滤液，滤液继续减压浓縮至无醇味，浓縮液上聚酰胺树脂柱，开始以10%的乙醇洗脱，弃起始流出夜为浑浊的馏分，待馏分变清，开始收集2个柱体积量的馏分，备用；改用50%的乙醇洗脱，收集50%的乙醇洗脱部分，备用；10%的乙醇洗脱部分，减压浓縮至无醇味、相对密度为1.00的浓縮液，冷却，静置24小时，过滤，得沉淀，沉底以蒸馏水洗涤3次后，加水分散，以NaOH调pH为IO，静置，析出沉淀，过滤，沉淀以pH为10的碱水洗涤，将洗涤液并入滤液中，所得滤液再加盐酸调pH至3，静置，过滤，得沉淀，沉淀以蒸馏水洗涤至水洗涤液为中性，洗涤后的沉淀干燥，即得三萜类提取物A5.5g;60X的乙醇洗脱部分减压浓縮，干燥，得总黄酮提取物B12.6g;合并三萜类提取物和总黄酮类提取物，即得本发明陆英提取物。经测定，陆英提取物中，总黄酮含量为25%，总三萜类重量百分比为43%，其中标示性成分乌苏酸的重量百分含量为26%。实施例3:含有陆英提取物的片剂处方和制法处方陆英提取物20g未经纤维素60g低取代羟丙基纤维素15g95%乙醇适量_制成500片按照上述制剂的处方，取陆英提取物，加入未经纤维素、低取代羟丙基纤维素，以95%的乙醇为黏合剂，过20目筛制软材，6(TC干燥，整粒，加入硬脂酸镁混匀压片，即得。实施例4:陆英提取物胶囊处方及其制法处方陆英提取物30g预胶化淀粉50g75%乙醇适量交联羧甲基纤维素钠15g微粉硅胶5g_制成500粒取陆英提取物，加入预胶化淀粉，以75%的乙醇为粘合剂，过20目筛制软材，6(TC干燥，整粒；干颗粒加入过100目的交联羧甲基纤维素钠和微粉硅胶，混匀，测定颗粒中指标成分含量，装入胶囊，装两约为0.lg，包装即得。以下从药理药效学方面来说明本发明提取物的有益效果，所用提取物均为由实施例l的方法制备得到。—、对肝郁脾虚证大鼠的治疗作用实验用雄性SD大鼠40只，体重150-160g，将大鼠随机分为5组正常对照组(A6组)、阳性对照组(B组)、本发明提取物低、中、高剂量组(25mg/kg、50kg/kg、100mg/kg)，每组8只，各组大鼠体重的差异无统计学意义，大鼠饲养于普通动物房，自由饮水，喂常规饲料，食物在允许时可自由摄取。造模方法及处理将造模组每只大鼠的尾巴用塑料夹夹住，让其相互撕咬，打斗或尝试转头咬掉塑料夹，若塑料夹被咬掉，立即重新夹上，若停止相互撕咬、打斗，则用小铁丝对其肢体予以剌激，让其重新打斗或奔跑，直到对剌激不再敏感为止，每日处理1次，30min/次，造模组自由饮水，隔日禁食，禁食时将饲料用透明塑料袋悬挂在笼子上方，让大鼠可以看到并接近饲料，但又无法吃到饲料，正常对照组则不加任何处理，自由进食、饮水，试验进行到第15天时，肝郁脾虚造模组大鼠出现较为明显的活动少、扎堆、倦卧、嗜睡、拱背、叫声细、淡漠、对外界剌激不兴奋、体质量减轻灯肝郁脾虚的表现，造模取得成功，然后，正常对照组和阳性对照组均灌胃生理盐水(10ml/kg)，治疗组按剂量灌胃给予本发明提取物，连续给药8天，在试验第1天(造模前)和试验中第15天(给药前)、第23天(给药第8天)，分别称量大鼠的体质量，结果见表1。结果灌胃治疗8天后(即试验的第23天)，肝郁脾虚证大鼠各治疗组变化明显恢复，情绪、行为状态、毛发、饮食、睡眠、大便等各方面状况与正常对照组相比无明显差异，而阳性对照组的上述状况(情绪、行为状态、毛发、饮食、体质量、睡眠、大便等)与正常对照组和各治疗组有明显差异；虽然，各治疗组体重低于正常对照组(低剂量组P<O.Ol，中、高剂量组P<0.05)，但明显高于阳性对照组(P<0.01)各组大鼠体质量变化比较(x士s)第一天第15天第23天正常对照165.3±11.2198.4±16.2219.3±15.7阳性对照组跳2±10.4152.7±12.3**158.5±11.6**本发明低剂量组163.5±9.8149.5±10.6"AidA■5±13.4A本发明中剂量组166.6±11.3154.3±11.5**192.7±16.6*AA本发明高剂量组162.9±11.9147.6±10.广198,9士17,r厶厶与正常对照组相比*P<0.05，**P<0.01;与阳性对照组相比AP<0.05，AAP<0.01二，对化学性肝损伤小鼠的治疗作用小鼠60只随机分为6组，每组10只，即正常对照组，模型组，联苯双酯组，丹参胡黄连高、中、低剂量给药组。连续7天口服给药，末次给药后1小时腹腔注射800mg/kg的氨基半乳糖，隔16小时后眼眶取血测定血液升化指标ALT，MDA。结果(表4)显示本发明提取物能够明显降低氨基半乳糖小鼠的ALT的含量，高剂量组能显著降低模型组的MDA水平。表2本发明提取物对氨基半乳糖小鼠肝损伤模型的影响(x±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>与模型组比较*p<0.05，与模型组比较**p<0.01三、活血化瘀作用取动物30只，随机分为3组，即空白组、模型组和本发明提取物组(50mg/kg)，空白组与模型组每天灌胃生理盐水(10ml/kg)，动物普通饲料喂食，二级动物室饲养，药物均以蒸馏水溶散，每天灌胃，连续IO天，第IO天灌胃lh后，各组动物(空白组除外)均腹腔注射盐酸肾上腺素lmg/kg(生理盐水溶液稀释)，第11天造成再次注射肾上腺素，lh后，20%氨基甲酸乙酯麻醉(0.7ml/kg)，腹主动脉取血，2.0%EDTA-Na2抗凝，检测血液流变性等相关指标。结果表明，本发明提取物可不同程度地降低大鼠5s-l、10s-l、35s-l剪切率下的血液黏度，和模型组比较具有显著性差异(P<0.05)，结果见表3。表3本发明提取物对大鼠血液黏度的影响(x士s)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01四、消肿止痛作用动物SD大鼠，均为雄性，体重220-250g，购于沈阳药科大学试验动物中心。试剂卡介苗(中国生物制品鉴定中心)、羊毛脂(沈阳普瑞兴精细化工有限司)、液体石蜡(沈阳化工股份有限公司产品)。佐剂的制备将液体石蜡和羊毛脂按2:1的比例于7(TC下供热充分混匀，高压灭菌，然后每ml加入卡介苗6mg充分研磨混合均匀，制成完全佐剂。关节炎模型的建立每只大鼠右后足跖皮下注射上述佐剂O.lml，诱导关节炎的发生，每隔一天观察一次，直至关节炎完全形成，注射佐剂一侧足跖从第一天起持续肿胀4天，而后开始消肿，于第8天起再次持续肿胀，第16天达到高峰，尾部、耳部继发性反应于第12天起发生，主要表现为注射佐剂对侧(左后肢)足跖肿胀，尾部、耳部及前肢关节也不同程度肿胀，按下列标准给各组大鼠左后肢病变程度评分0分无红肿；1分小趾关节肿胀；2分趾关节和足跖肿胀；3分踝关节一下的足爪肿胀；4分包括踝关节在内的全部足爪肿胀。分组及给药注射佐剂后第19天，关节炎大鼠继发性反应趋于稳定，全身病变也较明显。将上述大鼠随机分为4组，每组10只，第一组空白对照组，灌胃给生理盐水(10ml/kg)，第二至四组为本发明提取物组，分别为低、中、高剂量组，灌胃给药25、50、100mg/kg，每天灌胃给药一次，连续7天，于第7天测量左后足跖厚度，结果见表4。表4本发明提取物对佐剂性关节炎左后足肿胀的影响(x士s，n=10)组别齐糧(mg/kg)左后足跖厚度mm治疗前治疗后对照组本发明低剂量组本发明中剂量组本发明高剂量组25501001.97±0.651,92±0.701.90±0.691.89±0.611.93±0.721.41±0.52*0.92土0.33"0.56±0.19**与对照组相比:*P<0.05，**P<0.01上表结果表明，本发明提取物对佐剂性关节炎大鼠左后足肿胀具有明显的消肿作用，与对照组相比，消肿效果具有显著差异(P<0.05)。权利要求一种陆英提取物，其特征在于该提取物是由下述方法得到陆英药材粉碎后，以醇浓度为50％～95％的醇水混合溶媒提取，得到提取液经浓缩醇沉后，醇沉上清液浓缩去醇，所得浓缩液经聚酰胺吸附树脂柱，分别收集含乌苏酸为主的三萜类化合物和黄酮类成分的洗脱部位，合并，即得所述的陆英提取物；其中该提取物含有重量百分比分别为25％～40％的总黄酮和30％-50％的总三萜类化合物。2.根据权利要求l所述的陆英提取物，其特征是陆英药材粉碎后，以醇浓度为50%95%的醇水混合溶媒提取，得到提取液经浓，浓縮液加乙醇调使含醇量为60%80%，搅拌，静置，过滤，取滤液，滤液浓縮去醇，所得浓縮液经聚酰胺吸附树脂柱，依次用0%10%的乙醇、45%60%的乙醇洗脱，分别收集0%-10%的乙醇洗脱部分和45%60%的乙醇洗脱部分；0%10%的乙醇洗脱部分减压浓縮至相对密度为1.001.IO，静置，浓縮液过滤，弃滤液，沉淀以水洗涤3-5次，再用热蒸馏水分散，调pH至10-12，溶解离心弃沉淀，沉淀再调pH至2-3，离心，得沉淀，沉淀干燥即得以乌苏酸为主的三萜类化合物；45%60%的乙醇洗脱部分减压浓縮，干燥得黄酮类成分，总黄酮含量大于50%;合并上述两提取物，即得所述的陆英提取物；其中该提取物含有重量百分比分别为25%40%的总黄酮和30%_50%的总三萜类化合物。3.根据权利要求l所述的陆英提取物，其中该提取物中含有重量百分比分别为30%_35%的总黄酮和45%_50%的总三萜类化合物。4.根据权利要求1、2或3任一权利要求所述的陆英提取物，其特征在于，所述的总三萜的标示性成分为乌苏酸，该提取物中乌苏酸的含量为25%35%。5.—种药物组合物，含有如权利要求1至3中任意一权利要求所述的陆英提取物和药学上可接受的辅料。6.如权利要求5所述的组合物，其为口服剂型，由治疗有效量的陆英提取物和药学上可接受的辅料组成。7.如权利要求6所述的组合物，其中所述的口服剂型是片剂、胶囊剂或颗粒剂中的任意一种。全文摘要本发明涉及一种陆英提取物及其制备方法，陆英全草经醇提聚酰胺分离后，可得到富含总黄酮和总三萜的陆英提取物，本发明方法简便，易操作，所得提取物杂志含量少，有效成分明确。文档编号A61P19/00GK101693049SQ200910187870公开日2010年4月14日申请日期2009年10月15日优先权日2009年10月15日发明者关屹,闫冬申请人:沈阳亿灵医药科技有限公司;关屹;