蝶呤类一氧化氮合酶抑制剂的制作方法
专利名称：蝶呤类一氧化氮合酶抑制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及到设计与合成具有控制体内一氧化氮(NO)过多产生的蝶呤类衍生物，尤其是具有抑制诱导型一氧化氮合成酶作用的蝶呤类衍生物，是用以制备预防和治疗因体内NO水平升高而介导的疾病的药物。
背景技术：
NO作为一种新型信号分子，具有调节内皮细胞、平滑肌细胞和神经细胞等功能；作为—效应分子，参与炎症与组织损伤恢复，在呼吸、消化、循环、免疫等全身多系统的生理、病理生理及有关临床疾病中起着重要作用。
NO的生物合成是由左旋精氨酸(L-Arg)在一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)作用下与O2结合，生成左旋瓜氨酸(L-Cit)，并释放出一氧化氮。NOS含有4个辅助因子黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、黄素单核苷酸(FMN)、血红素(铁原IX)和四氢生物蝶呤(BH4)。NOS为一个双区结构，C端为还原酶区，含有NADPH、FAD、FMN同钙调节蛋白的结合位点；N端为氧化酶区，含有血红素、BH4同左旋精氨酸的结合位点。根据NOS存在的细胞类型来分共3种，即一类包括神经元性NOS(nNOS)和内皮细胞性NOS(eNOS)，另一类是iNOS，包括细胞因子诱导性NOS和巨噬细胞性NOS(MacNOS)。而其中iNOS是体内一氧化氮水平异常增高的最大的元凶，因为iNOS可被细胞因子、内毒素等许多体液性物质所诱导，而iNOS是三种一氧化氮合酶中唯一的非钙依赖型NOS，它与钙调节蛋白有很强的亲合力，即使在极低的Ca2+浓度下也能引起快通道开放，启动一氧化氮合成，而且iNOS的mRNA的半衰期特别长，一旦被诱导合成即可长时间翻译合成iNOS，所以iNOS一旦被诱导即可持续产生大量的NO，直至底物耗尽。而大量的NO可直接造成组织和细胞的损害甚至死亡，NO可直接与带巯基的功能蛋白结合，从而抑制其正常的生理功能，NO还能抑制ATP的生成，从而影响细胞的能量代谢，NO还可抑制DNA的合成并诱发基因突变。
过量的一氧化氮导致了许多疾病的产生，加剧了疾病的病理进程，但NO在某些方面也具有保护作用，例如内皮细胞性NOS释放出的一氧化氮能舒张血管对抗交感神经兴奋引起的血管收缩。研究表明nNOS、eNOS和iNOS在精氨酸和BH4结合位点上存在差异，这为我们开发应用iNOS的选择性抑制剂而保留nNOS、eNOS的生理功能提供了方向。
目前NOS抑制剂主要有以内源性底物左旋精氨酸为靶点的L-Arg类似物，而以NOS辅助因子FAD、FMN、血红素、BH4为靶点的化合物亦有文献报道。其中BH4在NO的生物合成又扮演了极其重要的角色，它能增加NOS的活性和稳定性，因而以BH4为靶点的化合物同其他NOS抑制剂相比在选择性上有着极大的优越性。
发明内容
巨噬细胞iNOS为一个同型二聚体酶，由两个相同的130000u(130kDa)亚基组成，亚基二聚体化为iNOS活性所必需。用凝胶滤过分离的iNOS亚基仅可结合FAD、FMN和CaM，但不含血红素和BH4，分离所得的亚基不能产生NO，只可催化电子从NADPH向接受体如细胞色素C传递。亚基聚合不能自动发生，而需要BH4、L-精氨酸和血红素共同存在，上述物质细胞内水平不足，将影响iNOS单体(亚基)聚合成有活性的二聚体。iNOS亚基聚合的一般过程如下合成的酶蛋白起初为单体，含有一个非功能性的氧化酶区和一个功能性的还原酶区。后者与FAD、FMN及CaM结合。在L-精氨酸存在的情况下，BH4、血红素(heme)与两个单体的氧化酶区相互作用形成一个二聚体。二聚体化才使iNOS具有催化NO合成的功能。在这个过程中，BH4是必不可缺的，而蝶啶类化合物具有与BH4相同母核，能竞争性的与NOS结合，降低NOS的活性和稳定性，从而降低体内一氧化氮水平。另外，BH4同时也是一些芳香氨基酸羟化酶(如苯丙氨酸羟化酶、酪氨酸羟化酶、色氨酸羟化酶等)的辅酶，而这些芳香氨基酸是构成神经递质的重要组分。但是，BH4作为NOS的辅酶的结合位点与作为芳香氨基酸羟化酶的辅酶的结合位点是不同的[Tayeh，M.A.，and Marletta，M.A.(1989)J.Biol.Chem.264，19654-19658]，而且有文献报道以BH4为靶点的蝶啶类NOS抑制剂并不抑制苯丙氨酸羟化酶的活性[Bmmel，HM.，Reif.A.，et al，(1998)J.Biol.Chem.273，33142-33179]。在我们先前专利中(姚其正，王秋娟等，中国专利，申请号200310106588.0；2003-12-10)已合成了一批具有iNOS抑制活性的4-氨基和4-取代氨基蝶啶化合物，但是2，4-二氨基和2-氨基-4-取代氨基蝶啶类同抗叶酸的二氢叶酸还原酶和二氢蝶呤还原酶的抑制剂结构非常相似，因此2，4-二氨基和2-氨基-4-取代氨基蝶啶类化合物可能对叶酸和BH4的生物合成有抑制作用。为此，本发明设计并合成一批2-氨基-4-羰基(或烷氧基)蝶啶(蝶呤)化合物，而2-氨基-4-羰基蝶啶类可作为芳香氨基酸羟化酶中辅酶BH4的替代物[Levine，R.A.；Zoephel，G..P.；Curtius，H.-C.In Biochemical and Clinical Aspect of Pterdines；Curtius，H.-C.，Pfleiderer，W.，Wacher，H.Berline，1985；Vol.4]。另外，2-氨基-4-羰基蝶啶类化合物对二氢叶酸还原酶和二氢蝶呤还原酶没有抑制作用，而且其与BH4相似程度较2-氨基-4-氨基蝶啶类更高，从而蝶呤类化合物具有对NOS更高的亲合力，因此蝶呤类较2-氨基-4-氨基蝶啶类具有更高的iNOS抑制选择性。在iNOS结构中BH4的2-位氨基同血红素以氢键相连，本发明对蝶呤2-位氨基用芳香等酰基进行了修饰，期望能干扰血红素在NO合成中的电子转移作用，以进一步增强对iNOS抑制活性。这些蝶呤类化合物经用iNOS进行生物活性测试，发现具有抑制NO产生的作用，可用作治疗因体内NO升高而引发的疾病的药物。
下列通式(I)表示的蝶呤类化合物或其药学上可接受的盐 R1代表C1-C8直链或支链的烷烃；C1-C5直链或支链烷基或烷氧基取代或无取代的芳基或杂环芳基；R2代表氢；C1-C8直链或支链的烷烃；芳基取代的C1-C5直链或支链的烷烃；氨基或取代氨基取代的C1-C5直链或支链的烷烃；R3代表氢；羟基取代或无取代基的C1-C8直链或支链的烷烃；C1-C5直链或支链烷基或烷氧基取代或无取代的芳基；R4代表氢；苯基、C1-C5直链或支链烷基；C1-C5直链或支链烷氧基；羟基；氨基或C1-C2烷基取代氨基；前述蝶呤类化合物或其药学上可接受的盐，其中较好的是R1代表C1-C8直链或支链的烷烃；苯基、对甲氧基苯基、对甲基苯基、苄基、β-苯乙基、吡啶基。
R2代表氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、苄基、β-苯乙基、二甲氨基乙基、二甲氨基丙基、二乙氨基乙基、邻苯二甲酰亚氨基乙基、丁二酰亚氨基乙基。
R3代表氢、苯基、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、对甲氧基苯基、对甲基苯基。
R4代表氢、甲基、乙基、羟基、甲氧基、氨基。
前述蝶呤类化合物或其药学上可接受的盐，其中更为合适的是R1代表苯基、对甲氧基苯基、吡啶基；R2代表甲基、异丙基、苄基、β-苯乙基、二甲氨基乙基、邻苯二甲酰亚氨基乙基、丁二酰亚氨基乙基；R3代表氢、苯基、、对甲氧基苯基、对甲基苯基；R4代表氢、甲基、乙基、羟基。
以上所述的烷基、烷氧基和胺基中的烷基可以是直链烷基，或是有侧链的烷基，或是环状烷基。在分子式中如果出现有立体异构体和互变异构体，则本发明中的化合物包括这些全部的立体异构体和互变异构体。
前述通式(I)表示的蝶呤类化合物或其药学上可接受的盐在制备抑制诱导型一氧化氮合酶药物中的应用。
所述通式(I)表示的蝶呤类化合物或其药学上可接受的盐在制备抑制诱导型一氧化氮合酶药物中的较具体的应用是制备在败血性或出血性休克或用细胞毒素进行肿瘤化学治疗和肝硬化或肝萎缩和/或肝功能衰退时所引起的血压下降或/和止血障碍药物。更具体的应用，是制备预防和治疗异体器官和组织移植的排斥反应药物以及胰岛素依赖型糖尿病药物；是制备预防和治疗炎症疾病的药物；是制备预防和治疗细胞毒素进行肿瘤化学治疗、化学药物或化学物质以及慢性肝炎引发的多种肝损伤、肝功能衰退以及预防和治疗心肌梗塞损伤、病毒型心肌炎的药物；是制备预防和治疗脑缺血后的炎症反应、病毒性脑炎以及早老性痴呆症的药物；是制备预防和治疗病毒性神经退化疾病及痛觉过敏、癫痫、偏头痛的药物。
药物组合物，其中含有治疗有效量的通式(I)表示的蝶呤类化合物或其药学上可接受的盐，并含有常规药用载体。
本发明所用的通式(I)表示的化合物可以是它们的中性形式，也可以是和无机酸或有机酸加成形成相应的盐使用，对药物中所用的酸包括有如盐酸、溴化氢、磷酸硝酸、硫酸、酒石酸、乳酸、水杨酸、草酸、苯甲酸、甲酸、乙酸、丙酸、戊酸、乙二酸、丙二酸、丁二酸、庚二酸、己二酸、乙二酸、马来酸、苹果酸、氨基磺酸、琥珀酸酸、富马酸、苯丙酸、葡糖酸、异烟酸、抗坏血酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸以及氨基酸等。通式(II)表示的化合物可以和多摩尔的酸加成形成相应的盐，这些多摩尔的酸可以是单一的也可以是组合的，这主要根据需要用相应的溶剂或稀释剂的情况来定。这些加成的盐可通过阴离子交换去除。对于通式(II)表示的化合物中含有酸性组分的化合物，也可和相应的无机碱或有机碱或碱性氨基酸加成形成相应的盐，例如对于这些盐有碱金属的盐，特别有效的是钠、钾和铵盐，以及与有机胺和碱性氨基酸等组成相应的盐。
本发明所涉及的蝶呤类衍生物和它们相应的盐可和适当的辅料(包括相应的医药上允许应用的赋形剂、缓释剂、粘和剂、稳定剂、调味剂、香料、色素等)作成片剂或胶囊，也可作成相应的针剂用于临床。
本发明通式(I)表示的蝶呤类化合物是本次发明新合成的化合物，新合成的化合物均经过各种物理方法进行了结构鉴定，包括1H-NMR、MS和元素分析。
通式(I)化合物的合成有以下步骤
1、取代酮肟(A)的合成 式中R3＝H；CH3；CH3O等。
相应的取代苯乙酮在二氧六环和水的混合溶液中，用二氧化硒氧化羰基的α位得二羰基化合物，接着和丙酮肟反应得到取代酮肟(A)。
2、2-氨基-4-羟基-6-取代蝶啶(B)的合成 在回流的2，5，6-三氨基嘧啶酮盐酸盐甲醇混悬液中，滴加取代酮肟(A)的甲醇溶液，反应3小时后即可区域选择性的得到6-取代蝶啶化合物(B)。
3、2-取代酰氨基-4-羟基-6-取代蝶啶(C)的合成 蝶啶化合物(B)与相应的酰氯在吡啶中室温下反应即可得到(C)。
4、目标化合物(D)的合成
化合物C和相应的醇在无水二氧六环中，加入三苯基磷和偶氮二甲酸二乙酯，即可反应得到目标化合物(D)。
本发明可用于制备预防和治疗败血性或出血性休克、器官移植的排斥反应、脑缺血后的炎症反应、病毒性脑炎以及早老性痴呆症的药物具体实施方式
(1)、化合物制备2-乙酰氨基-4-异丙氧基-6-对甲氧基苯基蝶啶(1)将0.6g(2.23mmol)化合物C(式中R1为甲基，R3为-对甲氧基苯基)和三苯基磷1.17g(4.46mmol)加入到无水二氧六环中，趁热加入偶氮二甲酸二乙酯0.77g(4.46mmol)，不溶固体逐渐溶解，待溶液澄清后，加入无水异丙醇0.27g(2.23mmol)，搅拌加热回流24小时，减压除去二氧六环，残留物经硅胶柱层析[乙酸乙酯∶石油醚＝1∶1]纯化，用乙酸乙酯重结晶，得0.25g黄色固体1，产率31.7％，m.p.240～242℃.1H-NMR(AV-300 CDCl3)δ9.36(s，1H，7-H)，8.11(d，J＝8.8Hz，2H，Ph-H)，7.04(d，J＝8.8Hz，2H，Ph-H)，5.61(m，1H，-CH)，3.88(s，3H，-OCH3)，2.72(s，3H，-COCH3)，1.55(d，6H，-CH3).ESI-MS(70V)376.1[M+Na]+.Anal.Calcd for C18H19N5O3*0.25H2O(353.38)C60.41，H5.49，N19.57；FoundC60.39，H5.19，N19.83.
2-乙酰氨基-4-异丙氧基-6-对甲基苯基蝶啶(2)按照化合物(1)的制备方法，投入0.6g(2.37mmol)化合物C(式中R1为甲基，R3为-对甲基苯基)，加入三苯基磷、偶氮二甲酸二乙酯和异丙醇，0.20g黄色固体2，产率25.2％；m.p.253～255℃.1HNMR(AV-300 CDCl3)δ9.38(s，1H，7-H)，8.13(bs，1H，2-NH)，8.03(d，J＝8.1Hz，2H，Ph-H)，7.34(d，J＝8.1Hz，2H，Ph-H)，5.58(m，1H，-CH)，2.72(s，3H，-COCH3)2.43(s，3H，Ph-CH3)，1.55(d，6H，-CH3).ESI-MS360.1[M+Na]+.AnalCalcd for C18H19N5O2*0.25H2O(341.88)C63.23，H5.74，N20.48；FoundC63.03，H5.44，N20.672-乙酰氨基-4-苄氧基-6-对甲氧基苯基蝶啶(3)。
按照化合物(1)的制备方法，投入0.6g(2.23mmol)化合物C(式中R1为甲基，R3为对甲氧基苯基)，加入三苯基磷、偶氮二甲酸二乙酯和苯甲醇，得0.28g黄色固体，产率31.3％，m.p.235～236℃.1H-NMR(AV-300 CDCl3)δ9.38(s，1H，7-H)，8.11(d，J＝9.0Hz，2H，Ph-H)，7.58(d，2H，Ph-H)，7.39(m，3H，Ph-H)，7.04(d，J＝9.0Hz，2H，Ph-H)，5.75(s，2H，Ph-CH2)，3.88(s，3H，-OCH3)，2.71(s，3H，-COCH3)ESI-MS424.1[M+Na]+.Anal.Calcd for C22H19N5O3*0.25H2O(405.92)C65.09，H4.84，N17.25；FoundC65.03，H4.58，N17.232-乙酰氨基-4-苄氧基-6-对甲基苯基蝶啶(4)按照化合物(1)的制备方法，投入0.6g(2.37mmol)化合物C(式中R1为甲基，R3为对甲基苯基)，加入三苯基磷、偶氮二甲酸二乙酯和苯甲醇，得0.28g黄色固体4，产率24.3％，m.p.232～234℃.1H-NMR(AV-300 CDCl3)δ9.40(s，1H，7-H)，8.15(bs，1H，2-NH)，8.03(d，2H，Ph-H)，7.56(m，2H，Ph-H)，7.38(m，5H，Ph-H)，5.71(s，2H，Ph-CH2)，2.71(s，3H，-COCH3)，2.42(s，3H，Ph-CH3).ESI-MS408.1[M+Na]+.Anal.Calcd for C22H19N5O2*1.25H2O(407.94)C64.77，H5.31，N17.16；FoundC65.21，H4.78，N17.162-乙酰氨基-4-(2-苯基)乙氧基-6-对甲氧基苯基蝶啶(5)按照化合物(1)的制备方法，投入0.6g(2.23mmol)化合物C(式中R1为甲基，R3为对甲氧基苯基)，加入三苯基磷、偶氮二甲酸二乙酯和β-苯乙醇，得0.29g黄色固体5，产率31.2％，m.p.236～237℃.1H-NMR(AV-300 CDCl3)δ9.40(s，1H，7-H)，8.25(bs，1H，2-NH)，8.14(d，J＝8.7Hz，2H，Ph-H)，7.37(m，5H，Ph-H)，7.08(d，J＝8.7Hz，2H，Ph-H)，4.85(t，J＝14.4Hz，2H，-OCH2)，3.92(s，3H，-OCH3)，3.29(t，J＝14.4Hz，2H，PhCH2)，2.72(s，3H，-COCH3).ESI-MS416.2[M+H]+.Anal.Calcd for C23H21N5O3*0.5CH3COOH(415.44)C64.71，H5.20，N15.72；FoundC65.19，H5.04，N16.022-乙酰氨基-4-(2-苯基)乙氧基-6-对甲基苯基蝶啶(6)按照化合物(1)的制备方法，投入0.6g(2.37mmol)化合物C(式中R1为甲基，R3为对甲基苯基)，加入三苯基磷、偶氮二甲酸二乙酯和β-苯乙醇，反应完经硅胶柱层析[乙酸乙酯∶石油醚＝1∶1]得0.24g黄色固体6，产率25.6％，m.p.264～266℃.1H-NMR(AV-300 CDCl3)δ9.41(s，1H，7-H)，8.28(bs，1H，2-NH)，8.06(d，2H，Ph-H)，7.35(m，7H，Ph-H)，4.84(t，J＝14.1Hz，2H，-OCH2)，3.27(t，J＝14.1Hz，2H，Ph-CH2)，2.71(s，3H，-COCH3)2.45(s，3H，Ph-CH3).
ESI-MS422.0[M+Na]+；Anal.Calcdfor C23H21N5O2*0.25H2O(403.94)C68.39，H5.36，N17.34；FoundC68.19 H5.14，N17.232-乙酰氨基-4-(2-邻苯二甲酰亚氨基)乙氧基-6-对甲基苯基蝶啶(7)按照化合物(1)的制备方法，投入0.6g(2.37mmol)化合物C(式中R1为甲基，R3为对甲基苯基)，加入三苯基磷、偶氮二甲酸二乙酯和邻苯二甲酰氨基乙醇，反应完毕经硅胶柱层析[乙酸乙酯∶石油醚＝1∶1]得0.21g黄色固体7，产率19.4％，m.p.245～248℃..1H-NMR(AV-300 CDCl3)δ9.40(s，1H，7-H)，8.01(m，3H，Ph-H)，7.84(m，2H，Ph-H)，7.73(m，2H，Ph-H)，7.32(m，2H，Ph-H)，4.90(t，J＝11.1Hz，2H，-OCH2)，4.30(t，J＝11.1Hz，2H，-NCH2)，2.69(s，3H，-COCH3)，2.45(s，3H，Ph-CH3)；ESI-MS491.1[M+Na]+.Anal.Calcd for C25H20N6O4*H2O(486.48)C61.72，H4.55 N17.27；FoundC61.78，H4.28，N17.232-氨基-4-甲氧基-6-对甲基苯基蝶啶(8)按照化合物(1)的制备方法，投入0.6g(2.37mmol)化合物C(式中R1为甲基，R3为对甲基苯基)，加入三苯基磷、偶氮二甲酸二乙酯和甲醇，反应完毕经硅胶柱层析[乙酸乙酯∶石油醚＝1∶1]得0.20g黄色固体，将此黄色固体加入甲醇中，滴加几滴浓硫酸室温下搅拌10小时，浓缩溶液即得黄色固体(8)0.16g产率25.5％，m.p.261～264.1H-NMR(AV-300 CD3OD)δ9.41(s，1H，7-H)，8.07(d，J＝8.4Hz，2H，Ph-H)，7.37(d，J＝8.4Hz，2H，Ph-H)，4.36(s，3H，-OCH3)，2.43(s，3H，Ph-CH3)ESI-MS268.1[M+H]+Anal.Calcd forC14H13N5O*0.5H2SO4*H2O(334.33)C50.29，H4.82，N 20.94；FoundC50.13，H4.57，N20.812-苯甲酰氨基-4-羟基-6-对甲氧基苯基蝶啶(9)将0.6g(2.64mmol)化合物B(式中R3为-对甲氧基苯基)加到干燥的吡啶中，向此混合物中滴加苯甲酰氯的吡啶溶液，保持温度在80～90℃下反应4小时，将反应液倾入冰水中，有大量固体析出，过滤，固体经硅胶柱层析[氯仿∶甲醇＝20∶1]分离得粗品，用DMF和水混合溶液重结晶得化合物(9)0.28g产率28.2％，m.p..195～198℃.1H-NMR(AV-300 CDCl3)δ9.13(s，1H，7-H)，8.03(m，4H，Ph-H)7.61(m，1H，Ph-H)，7.52(m，2H，Ph-H)，6.94(m，2H，Ph-H)，3.81(s，3H，-OCH3)；ESI-MS372.1[M-H]-Anal.Calcd for C20H15N5O3*0.25DMF*0.25H2O(396.15)C62.91，H4.39，N18.56；FoundC63.01，H3.92，N18.94.
2-(3-吡啶甲酰基)氨基-4-羟基-6-对甲氧基苯基蝶啶(10)将0.6g(2.64mmol)化合物B(式中R3为-对甲氧基苯基)加到干燥的吡啶中，向此混合物中滴加烟酰氯的吡啶溶液，保持温度在80～90℃下反应4小时，将反应液倾入冰水中，有大量固体析出，过滤，固体经硅胶柱层析[乙酸乙酯∶甲醇＝6∶1]分离得0.15g黄色固体10；产率15.6％ m.p..174～177℃.1H-NMR(AV-300 D6-DMSO)δ9.51(s，1H，7-H)，9.21(d，1H，Py-H)，8.83(m，1H，Py-H)，8.44(m，1H，Py-H)，8.20(d，J＝8.9Hz，2H，Ph-H)，7.61(m，1H，Py-H)，7.13(d，J＝8.9Hz，2H，Ph-H)，3.86(s，3H，-OCH3)ESI-MS373.0[M-H]-Anal.Calcd for C19H14N6O3*0.5CH3COOC2H5(418.41)C60.28，H4.33，N20.08；FoundC59.98，H4.15，N20.13(2)化合物生物活性的测试1.样品与试剂蝶呤类衍生物本论文中合成了10个化合物，进行了iNOS的抑制活性研究，活性测定是以DMSO作溶剂进行。
1.2诱导型一氧化氮合成酶是由Cayman Chemical公司提供。
1.3四氢生物蝶呤二盐酸盐，纯度＞99％，由Cayman Chemical公司提供。
1.4一氧化氮试剂盒 由南京建成生物工程研究所提供，批号200405112.主要仪器2.1 HH-4型数显恒温水浴锅 常州国华电器有限公司2.2 BS110S分析天平 北京赛多利天平有限公司2.3 752紫外可见光分光光度计上海分析仪器总厂3.药物体外抑制诱导型一氧化氮百分率的测定3.1试验方法在一氧化氮试剂盒的1号试剂中不加入四氢生物蝶呤(BH4)，按试剂盒方法分别在试管中加入试剂1、试剂2、试剂3、iNOS样品、BH4、受试药物后混匀，37摄氏度水浴下准确反应20分钟，加入试剂4终止反应，再加入终止液后混匀，530nm处，1cm光径，蒸馏水调零，比色测定吸光值。
3.2测定BH4的饱和浓度按照试剂盒方法按步骤加入试剂，各个试管中分别加入不同浓度的BH4，测定各管吸光值，并计算其饱和浓度。
3.3测定化合物的抑制百分率根据文献，我们配制药物浓度为BH4饱和浓度的48倍，同样按试剂盒的方法测定吸光值，并计算出抑制百分率。
抑制百分率＝(标准管吸光值-测定管吸光值)/(标准管吸光值-空白管吸光值)×100％4.各化合物IC50(半数抑制浓度)的测定根据前一次试验BH4饱和浓度测定结果，以及药物的抑制百分率达100％的药物浓度，我们推荐以下几个剂量，分别为32倍、24倍、18倍、13.5倍(剂量比为1∶0.75)。实验中每个试管中加入的诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)和BH4的浓度是固定的。测得各管在530nm处的吸光度，用直线回归的方法计算出各自的半数抑制浓度(见下表)。
表蝶呤类化合物对iNOS的抑制效果
注(1)表中iNOS活性数据测定时的抑制剂浓度均为96μmol/L、BH4的浓度为2μmol/L。Vmax为没有抑制剂时在2μM(饱和浓度)BH4作用下的iNOS活性；(2)ND表示没测定。
权利要求
1.下述通式(I)表示化合物 R1代表C1-C8直链或支链的烷烃；C1-C5直链或支链烷基或烷氧基取代或无取代的芳基或杂环芳基；R2代表氢；C1-C8直链或支链的烷烃；芳基取代的C1-C5直链或支链的烷烃；氨基或取代氨基取代的C1-C5直链或支链的烷烃；R3代表氢；羟基取代或无取代基的C1-C8直链或支链的烷烃；C1-C5直链或支链烷基或烷氧基取代或无取代的芳基；R4代表氢；苯基、C1-C5直链或支链烷基；C1-C5直链或支链烷氧基；羟基；氨基或C1-C2烷基取代氨基；
2.根据权利要求1所述的化合物，其中R1代表C1-C8直链或支链的烷烃；苯基、对甲氧基苯基、对甲基苯基、苄基、β-苯乙基、吡啶基。R2代表氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、苄基、β-苯乙基、二甲氨基乙基、二甲氨基丙基、二乙氨基乙基、邻苯二甲酰亚氨基乙基、丁二酰亚氨基乙基。R3代表氢、苯基、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、对甲氧基苯基、对甲基苯基。R4代表氢、甲基、乙基、羟基、甲氧基、氨基。
3.根据权利要求1或2所述的化合物，其中R1代表苯基、对甲氧基苯基、吡啶基；R2代表甲基、异丙基、苄基、β-苯乙基、二甲氨基乙基、邻苯二甲酰亚氨基乙基、丁二酰亚氨基乙基；R3代表氢、苯基、、对甲氧基苯基、对甲基苯基；R4代表氢、甲基、乙基、羟基。
4.权利要求1-3任意一项的化合物在制备抑制诱导型一氧化氮合酶药物中的应用。
5.权利要求1-3任意一项的化合物在制备在败血性或出血性休克或用细胞毒素进行肿瘤化学治疗和肝硬化或肝萎缩和/或肝功能衰退时所引起的血压下降或/和止血障碍药物中的应用。
6.权利要求1-3任意一项的化合物在制备预防和治疗异体器官和组织移植的排斥反应药物以及胰岛素依赖型糖尿病药物中的应用。
7.权利要求1-3任意一项的化合物在制备预防和治疗炎症疾病的药物中的应用。
8.权利要求1-3任意一项的化合物在制备预防和治疗细胞毒素进行肿瘤化学治疗化学药物或化学物质以及慢性肝炎引发的多种肝损伤、肝功能衰退以及预防和治疗心肌梗塞损伤、病毒型心肌炎的药物中的应用。
9.权利要求1-3任意一项的化合物在制备预防和治疗脑缺血后的炎症反应、病毒性脑炎以及病毒性神经退化疾病、痛觉过敏癫痫、偏头痛早老性痴呆症的药物。
10.一种药物组合物，其中含有治疗有效量的权利要求1-3任意一项的化合物并含有常规药用载体。
全文摘要
本发明涉及到具有抑制一氧化氮合酶作用的蝶呤衍生物，它具有通式(I)所述的化学结构。本发明可用于制备预防和治疗败血性或出血性休克、器官移植的排斥反应、脑缺血后的炎症反应、病毒性脑炎以及早老性痴呆症的药物。
文档编号A61P9/00GK1583747SQ20041004487
公开日2005年2月23日 申请日期2004年5月26日 优先权日2004年5月26日
发明者姚其正, 郭平, 冯明声, 姜力勋, 石静波 申请人:中国药科大学
技术领域：
本发明涉及到设计与合成具有控制体内一氧化氮(NO)过多产生的蝶呤类衍生物，尤其是具有抑制诱导型一氧化氮合成酶作用的蝶呤类衍生物，是用以制备预防和治疗因体内NO水平升高而介导的疾病的药物。
背景技术：
NO作为一种新型信号分子，具有调节内皮细胞、平滑肌细胞和神经细胞等功能；作为—效应分子，参与炎症与组织损伤恢复，在呼吸、消化、循环、免疫等全身多系统的生理、病理生理及有关临床疾病中起着重要作用。
NO的生物合成是由左旋精氨酸(L-Arg)在一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)作用下与O2结合，生成左旋瓜氨酸(L-Cit)，并释放出一氧化氮。NOS含有4个辅助因子黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、黄素单核苷酸(FMN)、血红素(铁原IX)和四氢生物蝶呤(BH4)。NOS为一个双区结构，C端为还原酶区，含有NADPH、FAD、FMN同钙调节蛋白的结合位点；N端为氧化酶区，含有血红素、BH4同左旋精氨酸的结合位点。根据NOS存在的细胞类型来分共3种，即一类包括神经元性NOS(nNOS)和内皮细胞性NOS(eNOS)，另一类是iNOS，包括细胞因子诱导性NOS和巨噬细胞性NOS(MacNOS)。而其中iNOS是体内一氧化氮水平异常增高的最大的元凶，因为iNOS可被细胞因子、内毒素等许多体液性物质所诱导，而iNOS是三种一氧化氮合酶中唯一的非钙依赖型NOS，它与钙调节蛋白有很强的亲合力，即使在极低的Ca2+浓度下也能引起快通道开放，启动一氧化氮合成，而且iNOS的mRNA的半衰期特别长，一旦被诱导合成即可长时间翻译合成iNOS，所以iNOS一旦被诱导即可持续产生大量的NO，直至底物耗尽。而大量的NO可直接造成组织和细胞的损害甚至死亡，NO可直接与带巯基的功能蛋白结合，从而抑制其正常的生理功能，NO还能抑制ATP的生成，从而影响细胞的能量代谢，NO还可抑制DNA的合成并诱发基因突变。
过量的一氧化氮导致了许多疾病的产生，加剧了疾病的病理进程，但NO在某些方面也具有保护作用，例如内皮细胞性NOS释放出的一氧化氮能舒张血管对抗交感神经兴奋引起的血管收缩。研究表明nNOS、eNOS和iNOS在精氨酸和BH4结合位点上存在差异，这为我们开发应用iNOS的选择性抑制剂而保留nNOS、eNOS的生理功能提供了方向。
目前NOS抑制剂主要有以内源性底物左旋精氨酸为靶点的L-Arg类似物，而以NOS辅助因子FAD、FMN、血红素、BH4为靶点的化合物亦有文献报道。其中BH4在NO的生物合成又扮演了极其重要的角色，它能增加NOS的活性和稳定性，因而以BH4为靶点的化合物同其他NOS抑制剂相比在选择性上有着极大的优越性。
发明内容
巨噬细胞iNOS为一个同型二聚体酶，由两个相同的130000u(130kDa)亚基组成，亚基二聚体化为iNOS活性所必需。用凝胶滤过分离的iNOS亚基仅可结合FAD、FMN和CaM，但不含血红素和BH4，分离所得的亚基不能产生NO，只可催化电子从NADPH向接受体如细胞色素C传递。亚基聚合不能自动发生，而需要BH4、L-精氨酸和血红素共同存在，上述物质细胞内水平不足，将影响iNOS单体(亚基)聚合成有活性的二聚体。iNOS亚基聚合的一般过程如下合成的酶蛋白起初为单体，含有一个非功能性的氧化酶区和一个功能性的还原酶区。后者与FAD、FMN及CaM结合。在L-精氨酸存在的情况下，BH4、血红素(heme)与两个单体的氧化酶区相互作用形成一个二聚体。二聚体化才使iNOS具有催化NO合成的功能。在这个过程中，BH4是必不可缺的，而蝶啶类化合物具有与BH4相同母核，能竞争性的与NOS结合，降低NOS的活性和稳定性，从而降低体内一氧化氮水平。另外，BH4同时也是一些芳香氨基酸羟化酶(如苯丙氨酸羟化酶、酪氨酸羟化酶、色氨酸羟化酶等)的辅酶，而这些芳香氨基酸是构成神经递质的重要组分。但是，BH4作为NOS的辅酶的结合位点与作为芳香氨基酸羟化酶的辅酶的结合位点是不同的[Tayeh，M.A.，and Marletta，M.A.(1989)J.Biol.Chem.264，19654-19658]，而且有文献报道以BH4为靶点的蝶啶类NOS抑制剂并不抑制苯丙氨酸羟化酶的活性[Bmmel，HM.，Reif.A.，et al，(1998)J.Biol.Chem.273，33142-33179]。在我们先前专利中(姚其正，王秋娟等，中国专利，申请号200310106588.0；2003-12-10)已合成了一批具有iNOS抑制活性的4-氨基和4-取代氨基蝶啶化合物，但是2，4-二氨基和2-氨基-4-取代氨基蝶啶类同抗叶酸的二氢叶酸还原酶和二氢蝶呤还原酶的抑制剂结构非常相似，因此2，4-二氨基和2-氨基-4-取代氨基蝶啶类化合物可能对叶酸和BH4的生物合成有抑制作用。为此，本发明设计并合成一批2-氨基-4-羰基(或烷氧基)蝶啶(蝶呤)化合物，而2-氨基-4-羰基蝶啶类可作为芳香氨基酸羟化酶中辅酶BH4的替代物[Levine，R.A.；Zoephel，G..P.；Curtius，H.-C.In Biochemical and Clinical Aspect of Pterdines；Curtius，H.-C.，Pfleiderer，W.，Wacher，H.Berline，1985；Vol.4]。另外，2-氨基-4-羰基蝶啶类化合物对二氢叶酸还原酶和二氢蝶呤还原酶没有抑制作用，而且其与BH4相似程度较2-氨基-4-氨基蝶啶类更高，从而蝶呤类化合物具有对NOS更高的亲合力，因此蝶呤类较2-氨基-4-氨基蝶啶类具有更高的iNOS抑制选择性。在iNOS结构中BH4的2-位氨基同血红素以氢键相连，本发明对蝶呤2-位氨基用芳香等酰基进行了修饰，期望能干扰血红素在NO合成中的电子转移作用，以进一步增强对iNOS抑制活性。这些蝶呤类化合物经用iNOS进行生物活性测试，发现具有抑制NO产生的作用，可用作治疗因体内NO升高而引发的疾病的药物。
下列通式(I)表示的蝶呤类化合物或其药学上可接受的盐 R1代表C1-C8直链或支链的烷烃；C1-C5直链或支链烷基或烷氧基取代或无取代的芳基或杂环芳基；R2代表氢；C1-C8直链或支链的烷烃；芳基取代的C1-C5直链或支链的烷烃；氨基或取代氨基取代的C1-C5直链或支链的烷烃；R3代表氢；羟基取代或无取代基的C1-C8直链或支链的烷烃；C1-C5直链或支链烷基或烷氧基取代或无取代的芳基；R4代表氢；苯基、C1-C5直链或支链烷基；C1-C5直链或支链烷氧基；羟基；氨基或C1-C2烷基取代氨基；前述蝶呤类化合物或其药学上可接受的盐，其中较好的是R1代表C1-C8直链或支链的烷烃；苯基、对甲氧基苯基、对甲基苯基、苄基、β-苯乙基、吡啶基。
R2代表氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、苄基、β-苯乙基、二甲氨基乙基、二甲氨基丙基、二乙氨基乙基、邻苯二甲酰亚氨基乙基、丁二酰亚氨基乙基。
R3代表氢、苯基、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、对甲氧基苯基、对甲基苯基。
R4代表氢、甲基、乙基、羟基、甲氧基、氨基。
前述蝶呤类化合物或其药学上可接受的盐，其中更为合适的是R1代表苯基、对甲氧基苯基、吡啶基；R2代表甲基、异丙基、苄基、β-苯乙基、二甲氨基乙基、邻苯二甲酰亚氨基乙基、丁二酰亚氨基乙基；R3代表氢、苯基、、对甲氧基苯基、对甲基苯基；R4代表氢、甲基、乙基、羟基。
以上所述的烷基、烷氧基和胺基中的烷基可以是直链烷基，或是有侧链的烷基，或是环状烷基。在分子式中如果出现有立体异构体和互变异构体，则本发明中的化合物包括这些全部的立体异构体和互变异构体。
前述通式(I)表示的蝶呤类化合物或其药学上可接受的盐在制备抑制诱导型一氧化氮合酶药物中的应用。
所述通式(I)表示的蝶呤类化合物或其药学上可接受的盐在制备抑制诱导型一氧化氮合酶药物中的较具体的应用是制备在败血性或出血性休克或用细胞毒素进行肿瘤化学治疗和肝硬化或肝萎缩和/或肝功能衰退时所引起的血压下降或/和止血障碍药物。更具体的应用，是制备预防和治疗异体器官和组织移植的排斥反应药物以及胰岛素依赖型糖尿病药物；是制备预防和治疗炎症疾病的药物；是制备预防和治疗细胞毒素进行肿瘤化学治疗、化学药物或化学物质以及慢性肝炎引发的多种肝损伤、肝功能衰退以及预防和治疗心肌梗塞损伤、病毒型心肌炎的药物；是制备预防和治疗脑缺血后的炎症反应、病毒性脑炎以及早老性痴呆症的药物；是制备预防和治疗病毒性神经退化疾病及痛觉过敏、癫痫、偏头痛的药物。
药物组合物，其中含有治疗有效量的通式(I)表示的蝶呤类化合物或其药学上可接受的盐，并含有常规药用载体。
本发明所用的通式(I)表示的化合物可以是它们的中性形式，也可以是和无机酸或有机酸加成形成相应的盐使用，对药物中所用的酸包括有如盐酸、溴化氢、磷酸硝酸、硫酸、酒石酸、乳酸、水杨酸、草酸、苯甲酸、甲酸、乙酸、丙酸、戊酸、乙二酸、丙二酸、丁二酸、庚二酸、己二酸、乙二酸、马来酸、苹果酸、氨基磺酸、琥珀酸酸、富马酸、苯丙酸、葡糖酸、异烟酸、抗坏血酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸以及氨基酸等。通式(II)表示的化合物可以和多摩尔的酸加成形成相应的盐，这些多摩尔的酸可以是单一的也可以是组合的，这主要根据需要用相应的溶剂或稀释剂的情况来定。这些加成的盐可通过阴离子交换去除。对于通式(II)表示的化合物中含有酸性组分的化合物，也可和相应的无机碱或有机碱或碱性氨基酸加成形成相应的盐，例如对于这些盐有碱金属的盐，特别有效的是钠、钾和铵盐，以及与有机胺和碱性氨基酸等组成相应的盐。
本发明所涉及的蝶呤类衍生物和它们相应的盐可和适当的辅料(包括相应的医药上允许应用的赋形剂、缓释剂、粘和剂、稳定剂、调味剂、香料、色素等)作成片剂或胶囊，也可作成相应的针剂用于临床。
本发明通式(I)表示的蝶呤类化合物是本次发明新合成的化合物，新合成的化合物均经过各种物理方法进行了结构鉴定，包括1H-NMR、MS和元素分析。
通式(I)化合物的合成有以下步骤
1、取代酮肟(A)的合成 式中R3＝H；CH3；CH3O等。
相应的取代苯乙酮在二氧六环和水的混合溶液中，用二氧化硒氧化羰基的α位得二羰基化合物，接着和丙酮肟反应得到取代酮肟(A)。
2、2-氨基-4-羟基-6-取代蝶啶(B)的合成 在回流的2，5，6-三氨基嘧啶酮盐酸盐甲醇混悬液中，滴加取代酮肟(A)的甲醇溶液，反应3小时后即可区域选择性的得到6-取代蝶啶化合物(B)。
3、2-取代酰氨基-4-羟基-6-取代蝶啶(C)的合成 蝶啶化合物(B)与相应的酰氯在吡啶中室温下反应即可得到(C)。
4、目标化合物(D)的合成
化合物C和相应的醇在无水二氧六环中，加入三苯基磷和偶氮二甲酸二乙酯，即可反应得到目标化合物(D)。
本发明可用于制备预防和治疗败血性或出血性休克、器官移植的排斥反应、脑缺血后的炎症反应、病毒性脑炎以及早老性痴呆症的药物具体实施方式
(1)、化合物制备2-乙酰氨基-4-异丙氧基-6-对甲氧基苯基蝶啶(1)将0.6g(2.23mmol)化合物C(式中R1为甲基，R3为-对甲氧基苯基)和三苯基磷1.17g(4.46mmol)加入到无水二氧六环中，趁热加入偶氮二甲酸二乙酯0.77g(4.46mmol)，不溶固体逐渐溶解，待溶液澄清后，加入无水异丙醇0.27g(2.23mmol)，搅拌加热回流24小时，减压除去二氧六环，残留物经硅胶柱层析[乙酸乙酯∶石油醚＝1∶1]纯化，用乙酸乙酯重结晶，得0.25g黄色固体1，产率31.7％，m.p.240～242℃.1H-NMR(AV-300 CDCl3)δ9.36(s，1H，7-H)，8.11(d，J＝8.8Hz，2H，Ph-H)，7.04(d，J＝8.8Hz，2H，Ph-H)，5.61(m，1H，-CH)，3.88(s，3H，-OCH3)，2.72(s，3H，-COCH3)，1.55(d，6H，-CH3).ESI-MS(70V)376.1[M+Na]+.Anal.Calcd for C18H19N5O3*0.25H2O(353.38)C60.41，H5.49，N19.57；FoundC60.39，H5.19，N19.83.
2-乙酰氨基-4-异丙氧基-6-对甲基苯基蝶啶(2)按照化合物(1)的制备方法，投入0.6g(2.37mmol)化合物C(式中R1为甲基，R3为-对甲基苯基)，加入三苯基磷、偶氮二甲酸二乙酯和异丙醇，0.20g黄色固体2，产率25.2％；m.p.253～255℃.1HNMR(AV-300 CDCl3)δ9.38(s，1H，7-H)，8.13(bs，1H，2-NH)，8.03(d，J＝8.1Hz，2H，Ph-H)，7.34(d，J＝8.1Hz，2H，Ph-H)，5.58(m，1H，-CH)，2.72(s，3H，-COCH3)2.43(s，3H，Ph-CH3)，1.55(d，6H，-CH3).ESI-MS360.1[M+Na]+.AnalCalcd for C18H19N5O2*0.25H2O(341.88)C63.23，H5.74，N20.48；FoundC63.03，H5.44，N20.672-乙酰氨基-4-苄氧基-6-对甲氧基苯基蝶啶(3)。
按照化合物(1)的制备方法，投入0.6g(2.23mmol)化合物C(式中R1为甲基，R3为对甲氧基苯基)，加入三苯基磷、偶氮二甲酸二乙酯和苯甲醇，得0.28g黄色固体，产率31.3％，m.p.235～236℃.1H-NMR(AV-300 CDCl3)δ9.38(s，1H，7-H)，8.11(d，J＝9.0Hz，2H，Ph-H)，7.58(d，2H，Ph-H)，7.39(m，3H，Ph-H)，7.04(d，J＝9.0Hz，2H，Ph-H)，5.75(s，2H，Ph-CH2)，3.88(s，3H，-OCH3)，2.71(s，3H，-COCH3)ESI-MS424.1[M+Na]+.Anal.Calcd for C22H19N5O3*0.25H2O(405.92)C65.09，H4.84，N17.25；FoundC65.03，H4.58，N17.232-乙酰氨基-4-苄氧基-6-对甲基苯基蝶啶(4)按照化合物(1)的制备方法，投入0.6g(2.37mmol)化合物C(式中R1为甲基，R3为对甲基苯基)，加入三苯基磷、偶氮二甲酸二乙酯和苯甲醇，得0.28g黄色固体4，产率24.3％，m.p.232～234℃.1H-NMR(AV-300 CDCl3)δ9.40(s，1H，7-H)，8.15(bs，1H，2-NH)，8.03(d，2H，Ph-H)，7.56(m，2H，Ph-H)，7.38(m，5H，Ph-H)，5.71(s，2H，Ph-CH2)，2.71(s，3H，-COCH3)，2.42(s，3H，Ph-CH3).ESI-MS408.1[M+Na]+.Anal.Calcd for C22H19N5O2*1.25H2O(407.94)C64.77，H5.31，N17.16；FoundC65.21，H4.78，N17.162-乙酰氨基-4-(2-苯基)乙氧基-6-对甲氧基苯基蝶啶(5)按照化合物(1)的制备方法，投入0.6g(2.23mmol)化合物C(式中R1为甲基，R3为对甲氧基苯基)，加入三苯基磷、偶氮二甲酸二乙酯和β-苯乙醇，得0.29g黄色固体5，产率31.2％，m.p.236～237℃.1H-NMR(AV-300 CDCl3)δ9.40(s，1H，7-H)，8.25(bs，1H，2-NH)，8.14(d，J＝8.7Hz，2H，Ph-H)，7.37(m，5H，Ph-H)，7.08(d，J＝8.7Hz，2H，Ph-H)，4.85(t，J＝14.4Hz，2H，-OCH2)，3.92(s，3H，-OCH3)，3.29(t，J＝14.4Hz，2H，PhCH2)，2.72(s，3H，-COCH3).ESI-MS416.2[M+H]+.Anal.Calcd for C23H21N5O3*0.5CH3COOH(415.44)C64.71，H5.20，N15.72；FoundC65.19，H5.04，N16.022-乙酰氨基-4-(2-苯基)乙氧基-6-对甲基苯基蝶啶(6)按照化合物(1)的制备方法，投入0.6g(2.37mmol)化合物C(式中R1为甲基，R3为对甲基苯基)，加入三苯基磷、偶氮二甲酸二乙酯和β-苯乙醇，反应完经硅胶柱层析[乙酸乙酯∶石油醚＝1∶1]得0.24g黄色固体6，产率25.6％，m.p.264～266℃.1H-NMR(AV-300 CDCl3)δ9.41(s，1H，7-H)，8.28(bs，1H，2-NH)，8.06(d，2H，Ph-H)，7.35(m，7H，Ph-H)，4.84(t，J＝14.1Hz，2H，-OCH2)，3.27(t，J＝14.1Hz，2H，Ph-CH2)，2.71(s，3H，-COCH3)2.45(s，3H，Ph-CH3).
ESI-MS422.0[M+Na]+；Anal.Calcdfor C23H21N5O2*0.25H2O(403.94)C68.39，H5.36，N17.34；FoundC68.19 H5.14，N17.232-乙酰氨基-4-(2-邻苯二甲酰亚氨基)乙氧基-6-对甲基苯基蝶啶(7)按照化合物(1)的制备方法，投入0.6g(2.37mmol)化合物C(式中R1为甲基，R3为对甲基苯基)，加入三苯基磷、偶氮二甲酸二乙酯和邻苯二甲酰氨基乙醇，反应完毕经硅胶柱层析[乙酸乙酯∶石油醚＝1∶1]得0.21g黄色固体7，产率19.4％，m.p.245～248℃..1H-NMR(AV-300 CDCl3)δ9.40(s，1H，7-H)，8.01(m，3H，Ph-H)，7.84(m，2H，Ph-H)，7.73(m，2H，Ph-H)，7.32(m，2H，Ph-H)，4.90(t，J＝11.1Hz，2H，-OCH2)，4.30(t，J＝11.1Hz，2H，-NCH2)，2.69(s，3H，-COCH3)，2.45(s，3H，Ph-CH3)；ESI-MS491.1[M+Na]+.Anal.Calcd for C25H20N6O4*H2O(486.48)C61.72，H4.55 N17.27；FoundC61.78，H4.28，N17.232-氨基-4-甲氧基-6-对甲基苯基蝶啶(8)按照化合物(1)的制备方法，投入0.6g(2.37mmol)化合物C(式中R1为甲基，R3为对甲基苯基)，加入三苯基磷、偶氮二甲酸二乙酯和甲醇，反应完毕经硅胶柱层析[乙酸乙酯∶石油醚＝1∶1]得0.20g黄色固体，将此黄色固体加入甲醇中，滴加几滴浓硫酸室温下搅拌10小时，浓缩溶液即得黄色固体(8)0.16g产率25.5％，m.p.261～264.1H-NMR(AV-300 CD3OD)δ9.41(s，1H，7-H)，8.07(d，J＝8.4Hz，2H，Ph-H)，7.37(d，J＝8.4Hz，2H，Ph-H)，4.36(s，3H，-OCH3)，2.43(s，3H，Ph-CH3)ESI-MS268.1[M+H]+Anal.Calcd forC14H13N5O*0.5H2SO4*H2O(334.33)C50.29，H4.82，N 20.94；FoundC50.13，H4.57，N20.812-苯甲酰氨基-4-羟基-6-对甲氧基苯基蝶啶(9)将0.6g(2.64mmol)化合物B(式中R3为-对甲氧基苯基)加到干燥的吡啶中，向此混合物中滴加苯甲酰氯的吡啶溶液，保持温度在80～90℃下反应4小时，将反应液倾入冰水中，有大量固体析出，过滤，固体经硅胶柱层析[氯仿∶甲醇＝20∶1]分离得粗品，用DMF和水混合溶液重结晶得化合物(9)0.28g产率28.2％，m.p..195～198℃.1H-NMR(AV-300 CDCl3)δ9.13(s，1H，7-H)，8.03(m，4H，Ph-H)7.61(m，1H，Ph-H)，7.52(m，2H，Ph-H)，6.94(m，2H，Ph-H)，3.81(s，3H，-OCH3)；ESI-MS372.1[M-H]-Anal.Calcd for C20H15N5O3*0.25DMF*0.25H2O(396.15)C62.91，H4.39，N18.56；FoundC63.01，H3.92，N18.94.
2-(3-吡啶甲酰基)氨基-4-羟基-6-对甲氧基苯基蝶啶(10)将0.6g(2.64mmol)化合物B(式中R3为-对甲氧基苯基)加到干燥的吡啶中，向此混合物中滴加烟酰氯的吡啶溶液，保持温度在80～90℃下反应4小时，将反应液倾入冰水中，有大量固体析出，过滤，固体经硅胶柱层析[乙酸乙酯∶甲醇＝6∶1]分离得0.15g黄色固体10；产率15.6％ m.p..174～177℃.1H-NMR(AV-300 D6-DMSO)δ9.51(s，1H，7-H)，9.21(d，1H，Py-H)，8.83(m，1H，Py-H)，8.44(m，1H，Py-H)，8.20(d，J＝8.9Hz，2H，Ph-H)，7.61(m，1H，Py-H)，7.13(d，J＝8.9Hz，2H，Ph-H)，3.86(s，3H，-OCH3)ESI-MS373.0[M-H]-Anal.Calcd for C19H14N6O3*0.5CH3COOC2H5(418.41)C60.28，H4.33，N20.08；FoundC59.98，H4.15，N20.13(2)化合物生物活性的测试1.样品与试剂蝶呤类衍生物本论文中合成了10个化合物，进行了iNOS的抑制活性研究，活性测定是以DMSO作溶剂进行。
1.2诱导型一氧化氮合成酶是由Cayman Chemical公司提供。
1.3四氢生物蝶呤二盐酸盐，纯度＞99％，由Cayman Chemical公司提供。
1.4一氧化氮试剂盒 由南京建成生物工程研究所提供，批号200405112.主要仪器2.1 HH-4型数显恒温水浴锅 常州国华电器有限公司2.2 BS110S分析天平 北京赛多利天平有限公司2.3 752紫外可见光分光光度计上海分析仪器总厂3.药物体外抑制诱导型一氧化氮百分率的测定3.1试验方法在一氧化氮试剂盒的1号试剂中不加入四氢生物蝶呤(BH4)，按试剂盒方法分别在试管中加入试剂1、试剂2、试剂3、iNOS样品、BH4、受试药物后混匀，37摄氏度水浴下准确反应20分钟，加入试剂4终止反应，再加入终止液后混匀，530nm处，1cm光径，蒸馏水调零，比色测定吸光值。
3.2测定BH4的饱和浓度按照试剂盒方法按步骤加入试剂，各个试管中分别加入不同浓度的BH4，测定各管吸光值，并计算其饱和浓度。
3.3测定化合物的抑制百分率根据文献，我们配制药物浓度为BH4饱和浓度的48倍，同样按试剂盒的方法测定吸光值，并计算出抑制百分率。
抑制百分率＝(标准管吸光值-测定管吸光值)/(标准管吸光值-空白管吸光值)×100％4.各化合物IC50(半数抑制浓度)的测定根据前一次试验BH4饱和浓度测定结果，以及药物的抑制百分率达100％的药物浓度，我们推荐以下几个剂量，分别为32倍、24倍、18倍、13.5倍(剂量比为1∶0.75)。实验中每个试管中加入的诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)和BH4的浓度是固定的。测得各管在530nm处的吸光度，用直线回归的方法计算出各自的半数抑制浓度(见下表)。
表蝶呤类化合物对iNOS的抑制效果
注(1)表中iNOS活性数据测定时的抑制剂浓度均为96μmol/L、BH4的浓度为2μmol/L。Vmax为没有抑制剂时在2μM(饱和浓度)BH4作用下的iNOS活性；(2)ND表示没测定。
权利要求
1.下述通式(I)表示化合物 R1代表C1-C8直链或支链的烷烃；C1-C5直链或支链烷基或烷氧基取代或无取代的芳基或杂环芳基；R2代表氢；C1-C8直链或支链的烷烃；芳基取代的C1-C5直链或支链的烷烃；氨基或取代氨基取代的C1-C5直链或支链的烷烃；R3代表氢；羟基取代或无取代基的C1-C8直链或支链的烷烃；C1-C5直链或支链烷基或烷氧基取代或无取代的芳基；R4代表氢；苯基、C1-C5直链或支链烷基；C1-C5直链或支链烷氧基；羟基；氨基或C1-C2烷基取代氨基；
2.根据权利要求1所述的化合物，其中R1代表C1-C8直链或支链的烷烃；苯基、对甲氧基苯基、对甲基苯基、苄基、β-苯乙基、吡啶基。R2代表氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、苄基、β-苯乙基、二甲氨基乙基、二甲氨基丙基、二乙氨基乙基、邻苯二甲酰亚氨基乙基、丁二酰亚氨基乙基。R3代表氢、苯基、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、对甲氧基苯基、对甲基苯基。R4代表氢、甲基、乙基、羟基、甲氧基、氨基。
3.根据权利要求1或2所述的化合物，其中R1代表苯基、对甲氧基苯基、吡啶基；R2代表甲基、异丙基、苄基、β-苯乙基、二甲氨基乙基、邻苯二甲酰亚氨基乙基、丁二酰亚氨基乙基；R3代表氢、苯基、、对甲氧基苯基、对甲基苯基；R4代表氢、甲基、乙基、羟基。
4.权利要求1-3任意一项的化合物在制备抑制诱导型一氧化氮合酶药物中的应用。
5.权利要求1-3任意一项的化合物在制备在败血性或出血性休克或用细胞毒素进行肿瘤化学治疗和肝硬化或肝萎缩和/或肝功能衰退时所引起的血压下降或/和止血障碍药物中的应用。
6.权利要求1-3任意一项的化合物在制备预防和治疗异体器官和组织移植的排斥反应药物以及胰岛素依赖型糖尿病药物中的应用。
7.权利要求1-3任意一项的化合物在制备预防和治疗炎症疾病的药物中的应用。
8.权利要求1-3任意一项的化合物在制备预防和治疗细胞毒素进行肿瘤化学治疗化学药物或化学物质以及慢性肝炎引发的多种肝损伤、肝功能衰退以及预防和治疗心肌梗塞损伤、病毒型心肌炎的药物中的应用。
9.权利要求1-3任意一项的化合物在制备预防和治疗脑缺血后的炎症反应、病毒性脑炎以及病毒性神经退化疾病、痛觉过敏癫痫、偏头痛早老性痴呆症的药物。
10.一种药物组合物，其中含有治疗有效量的权利要求1-3任意一项的化合物并含有常规药用载体。
全文摘要
本发明涉及到具有抑制一氧化氮合酶作用的蝶呤衍生物，它具有通式(I)所述的化学结构。本发明可用于制备预防和治疗败血性或出血性休克、器官移植的排斥反应、脑缺血后的炎症反应、病毒性脑炎以及早老性痴呆症的药物。
文档编号A61P9/00GK1583747SQ20041004487
公开日2005年2月23日 申请日期2004年5月26日 优先权日2004年5月26日
发明者姚其正, 郭平, 冯明声, 姜力勋, 石静波 申请人:中国药科大学
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