氨基生物蝶呤衍生物及其药学上的用途的制作方法
专利名称：氨基生物蝶呤衍生物及其药学上的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及到设计与合成具有控制体内一氧化氮自由基(简写为NO)过多产生的氨基生物蝶呤衍生物，尤其是具有抑制诱导型一氧化氮合成酶(简写为iNOS)作用的氨基生物蝶呤衍生物，用以制备具有预防和治疗体内一氧化氮水平升高而产生的各种疾病的药物。
背景技术：
NO是一种低分子量疏水性的具有高度反应活性的自由基，NO分子可以自由穿过细胞膜，作用于细胞内的靶分子，理论上讲NO存在于细胞和组织内任何部位，故能在体内调控多种细胞功能，产生广泛的生物效应。作为化学介质NO能调节心血管系统具有维持血管平滑肌紧张度，抑制血小板聚集和黏附，调节血管平滑肌细胞的增生，介导巨噬细胞对低密度脂蛋白的氧化修饰等功能。作为神经递质或神经调质，NO参与信息传递包括在中枢神经系统中参与记忆的形成、进行神经与血管之间的协调、参与一些行为调节、维持与强化痛觉；作用于植物神经参与前列腺素介导的交感神经活化作用；在外周神经系统具有特殊的神经信使功能，包括调节胃肠道功能、调节呼吸功能、调节生殖泌尿功能、介导某些神经元性血管舒张作用、抑制嗜铬细胞释放儿茶酚胺和作为胰岛素分泌过程的重要调质。NO作为病理生理性信使介导炎症过程和免疫反应的作用已被确立，一方面，NO和O2-，形成超氧负离子ONOO-，产生强大的细胞毒性；另一方面，NO上调使巨噬细胞释放活性氧中间体和炎症性细胞因子，对机体起到炎症介导过程，又起到对细胞生长分化调节作用。NO在炎症和免疫反应中起着关键的损伤和保护双重作用。
NO水平升高而引起的疾病和病症主要包括病理性血压下降，例如败血症或出血性休克；用细胞毒素进行肿瘤的化学治疗、化学物质或药物以及慢性肝炎引发的多种肝损伤(即化学性，病毒性和免疫性肝损伤)，肝硬化或肝萎缩，和肝功能衰退；也包括进行性炎症，如类风湿性关节炎和溃疡性结肠炎，以及胰岛素依赖型糖尿病和器官移植排斥反应等。
另外，下列一些疾病也与诱导产生的NO水平升高有关，在心血管循环方面，如心肌梗塞损伤、病毒性感染引起的心肌炎；在神经和中枢神经方面，如病毒性神经退化(变性)疾病，以及痛觉过敏、癫痫、偏头痛等。总之，过量NO产生与许多疾病有关，尤其iNOS的激活产生过多的NO是重要的致病因素，因此，研制iNOS选择抑制剂是十分必要的。
鉴于NO的广泛的病理生理功能，其调控剂的研究已成为当代生物医学和药学研究的热点与前沿。内源性的NO的来源是一氧化氮合成酶(NO Synthase，简写为NOS)，以L-精氨酸(L_Arginine，简写为L-Arg)和分子氧为底物，催化L-Arg中的两个等价胍基氮之一，经氧化反应生成的，同时生成L-瓜氨酸(L-Citrulline，简写为L-Cit)。
至今三种结构独特的NOS异构酶已被分离、克隆和确定(参见FoerstermannU，Gath I，et al，Biochem Pharmacol，1995，501321-1332)，根据这三种NOS亚型来源于细胞或组织的不同和其表达方式而分别给与不同的命名，如集中于血管内皮细胞中的亚型称为内皮型NOS(endothelial NOS，eNOS或NOS-III)，存在神经组织中的称为神经元型NOS(neuronal NOS，nNOS或NOS-I)，这两种异构酶在细胞处于生理状态下即有表达，一般来说，它们是通过机体对Ca2+水平的控制而维持在低水平的持续表达状态，在NO保持在低浓度下发挥生理功能，故常又将eNO和nNOS合称为结构型NOS(Constitutive NOS，cNOS)。第三种异构酶即所谓的诱导型NOS(inducible NOS，iNOS或NOS-II)，它在巨噬细胞和许多暴露在细胞素下的细胞中表达，并且在对细胞毒素物质产生的早期免疫应答反应方面起到关键作用。一般认为iNOS在生理作用下不表达，不依赖于体内的Ca2+水平和调钙蛋白，重要的是它通过诱导后被合成，如败血性休克，感染性、免疫性疾病，以及细胞因子，内毒素等许多因素均诱导iNOS大量合成。一旦NO大量的生成，就会产生广泛的损害。
初期的NOS抑制剂主要是内源性底物L-Arg的类似物，即结构修饰了的L-Arg。在生物化学水平上NOS的一些辅因子已经鉴明，它们有还原性尼克酰胺腺苷二核苷酸磷酸(NADPH)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FDA)、黄素单核苷酸(FMN)、血红素和四氢生物蝶呤(BH4)。故除以上L-Arg型的NOS抑制剂外，NOS上其它的结合位置也可以作为药理学上的靶点，如考虑干扰NOS还原酶区黄素辅酶的结合位点，有人开发了二亚苯基碘鎓(DPI)(参见Griffith OW，Gross SS，InMethods in Nitric Oxide ResearchFeelisch M，Stamler JS，ed；JohnWiley & Sons；New York，1996，p187-208。)和一喹啉类化合物(Fujisawa PharmCo Ltd.，WO 970225，1977)；针对NOS氧化酶区，Griffith和Gross合成出不同类型的吲哚和咪唑作为配体结合到血红素辅基上，来达到抑制NOS的目的。但是上面介绍的NOS抑制剂都缺乏相当明显的对iNOS异构酶的抑制选择性。
生物蝶呤(Biopterin，BP)四氢生物蝶呤(Tetrahydrobiopterin，BH4)BH4是被第一个发现的，已经被鉴定的最重要的NOS辅酶之一，经iNOS和BH4共结晶的X光衍射结构分析，可以看到在iNOS的氧化酶区有一个带有血红素、L-Arg、Phe470、Ser112和Trp457等氨基酸所形成供嵌入BH4的iNOS的蝶啶结合区，在这里BH4分子中的N-3、O4、N-5、C6侧链和血红素上的丙酸基、Arg375、Phe470、Ser112等由亲水或/和亲脂的相互作用(参见Crane BR.et al，Science，1998，2972121-2126)，BH4的辅助作用主要是在iNOS发生催化作用的第一步，即L-Arg转变为Nω-羟基-L-Arg(NHA)时，向血红素的丙酰基提供一个电子和BH4的3，4-酰胺上的一个氢质子(参见Crane BR，et al，Biochemistry，2000，394608-4621)。
虽然目前对BH4催化NOS的机制还没有完全研究清楚，但是有关研究已表明NOS以二聚体的形式才能发挥作用，而BH4对iNOS二聚体组装及稳定性起关键作用(Alderton WK，Cooper CE，Knowles RG，et al.Nitric Oxide SynthaseStruture，Function and Inhibition[J]，Biochem J，2001，357593-615)；BH4能催化促进各种NOS达到最大催化活性，哺乳动物生物体内BH4生成越多，NOS的催化活性越高(参见Gross SS，Levi RJ，Biol Chem，1992，26725722)；细胞因子，内毒素等也能诱导BH4的大量生成，其原因是在生物体内有从头合成和补救合成两条途径来合成BH4，而BH4的从头合成的关键酶GTP环水解酶和iNOS一样，其表达也受内毒素或细胞因子诱导，从而会增加细胞中的BH4的产生和水平的提高。有关BH4的研究还表明BH4是芳香氨基酸羟化酶的辅因子，而这些氨基酸羟化的产物是人体合成神经递质的原料，直接抑制体内BH4的生物合成必然会引起严重的副反应。然而，BH4对NOS的催化机理同催化芳香氨基酸羟化酶的机理是不同的(Thny B，Auerbach G，Blau N；Tetrahydrobiopterin biosynthesis，regeneration and functions，Biochem.J.2000，3471-16.)在蝶啶化合物中，蝶呤类化合物(4-羰基化合物)和大多数4-氨(胺)基化合物都是芳香氨基酸羟化酶的辅因子(Kappock TJ，Caradonna JP，Pterin-Dependent Amino Acid Hydroxylase，Chem.Rev.1996，96，2650-2756)，故氨基生物蝶呤类NOS抑制剂不会对芳香氨基酸羟化酶产生不良影响。另外研究表明，BH4对iNOS的催化活性远强于对另外两种NOS催化活性(Gibraeil HD，Dittrich P，Saleh S，et al.Inhibition ofendotoxin-induced vascular hyporeactivity by 4-amino-tetrahydrobiopterin.British J.of Pharmacology，2000，1311757-1765)。因此，BH4与其iNOS的结合区可作为理想的选择性药理干预靶点，基于此思想，我们设计合成了一系列的氨基生物蝶呤类衍生物，结构式用分子式(I)表示。这些氨基生物蝶呤类衍生物可和BH4竞争地结合到iNOS中的BH4结合区，从而改变iNOS结构或电学性质，达到抑制iNOS活性的目的。经过生物活性测试的结果表明，氨基生物蝶呤类衍生物具有抑制iNOS活性的作用，可用于处理iNOS体内过量表达导致NO升高而引发的疾病。
发明内容
本发明要解决的技术问题就是设计与合成具有控制体内一氧化氮自由基(简写为NO)过多产生的氨基生物蝶呤衍生物，尤其是具有抑制诱导型一氧化氮合成酶(简写为iNOS)作用的氨基生物蝶呤衍生物，用以制备具有预防和治疗体内一氧化氮水平升高而产生的各种疾病的药物。
以BH4为靶点，合成较好的iNOS的抑制剂必须满足以下条件(1)抑制剂应是BP类似物，这样才有可能适应iNOS中的BH4结合区结构上的需求；(2)所合成的BH4衍生物可以是非还原型的BP类似物，并且在BP的4-位和6-位的1，2-二羟基丙基上有较多的修饰基团的变化，其作用和BH4竞争地与iNOS结合。根据这两点，本发明提供了一般通式为(I)的氨基生物蝶呤类衍生物能成为iNOS抑制剂。
下述通式(I)表示氨基生物蝶呤衍生物或其药学上可接受的盐或其水合物 R1和R2相同或不同，各自独立的表示有取代基、无取代基的C1-C6直链、支链烷基或芳基；苄基；R1、R2、R3和R4不同时为H；R1为H或甲基时，R2代表有取代基的或无取代基的三元～六元环烷基；-(CH2)nOH(n＝1～6)；-C6H4COGlu、-C6H4CH2COGlu、-C6H4COGlu、-C6H4CH2COGlu，Glu代表-NHCH(COOR5)CH2CH2COOR6，R5与R6相同或不同，各自独立地表示H、甲基或乙基等；-C6H4COOR7R8、-C6H4CH2COOR7R8，R7和R8相同或不同，各自独立地表示H、甲基、乙基等；或NR1R2代表哌啶基、哌嗪基甲、基哌嗪基或三元～六元脂肪环单或二取代氨基。
R3和R4相同或不同，各自独立的表示H、C1-C6直链或支链烷基；各种取代的酰基R9CO-、R9C6H4(CH2)nCO-等(n＝0～6)，其中R9为C1-C6直链或支链烷基、烷氧基；R10C6H4(CH2)nCH2-等(n＝0～5)，R10为相同或不同的C1-C6直链或支链烷基、烷氧基；通式(I)表示的氨基生物蝶呤衍生物或其药学上可接受的盐、水合物，其中较好的是R1和R2相同，为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、苄基；R1代表H时，R2为甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、异丁基、环丁基、环己基、苄基、-CH2CH2OH。
R3和R4相同或不同，各自独立的表示H、C1-C6直链或支链烷基；各种取代的酰基如R9CO-、R9C6H4(CH2)nCO-等(n＝0～6)，其中R9为C1-C6直链或支链烷基、烷氧基；R10C6H4(CH2)nCH2-等(n＝0～5)，R10为相同或不同的C1-C6直链或支链烷基、烷氧基；或者NR1R2代表哌啶基、哌嗪基、甲基哌嗪基或三元～六元脂肪环胺基。
氨基生物蝶呤衍生物I或其药学上可接受的盐、水合物，其中更为合适的是R1和R2相同，为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、苄基；R1代表H时，R2为甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、异丁基、环丁基、环己基、苄基、-CH2CH2OH；R3、R4代表H、甲酰基、乙酰基、苯甲酰基。
以上所述的烷基、烷氧基、和胺基中的烷基可以是直链的烷基，或是有侧链的烷基，或是环状烷基。在分子式中如果出现立体异构体，则本发明中的化合物包括这些全部的互变异构体和立体异构体。
由前述通式(I)表示的氨基生物蝶呤衍生物或其药学上可接受的盐、水合物在制备抑制诱导性一氧化氮合酶药物中的应用。
前述通式(I)表示的氨基生物蝶呤衍生物或其药学上可接受的盐、水合物在制备抑制诱导性一氧化氮合酶药物中的较具体的应用是制备在败血性和(或)出血性休克，或用细胞毒素进行肿瘤化学治疗，肝硬化或肝萎缩和(或)肝功能衰退时所引起的血压下降或(和)止血障碍药物。更进一步的应用，是制备预防和治疗炎症疾病药物；是制备预防和治疗异体器官和组织移植的排斥反应药物以及胰岛素依赖型糖尿病药物；是制备预防和治疗细胞毒素进行肿瘤的化学治疗、化学物质或药物以及慢性肝炎引发的多种肝损伤、肝功能衰退以及预防和治疗心肌梗塞损伤、病毒性心肌炎药物。所述的应用还包括，是制备预防和治疗病毒性神经退化、变化疾病及痛觉过敏、癫痫、偏头痛药物。
药物组合物，其中含有治疗有效量的通式(I)氨基生物蝶呤衍生物或其药学上可接受的盐或其水合物，并含有常规药用载体。
本发明所用的通式I表示的化合物可以它们的中性形式，也可以和无机酸或者有机酸加成形成相应的盐使用，对药物中所能用的酸包括有如盐酸、溴化氢、萘二磺酸(1，5)、磷酸、硝酸、硫酸、草酸、酒石酸、乳酸、水杨酸、苯甲酸、甲酸、乙酸、丙酸、戊酸、二乙基乙酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、丁二酸、庚二酸、己二酸、马来酸、苹果酸、氨基磺酸、苯丙酸、葡糖酸、抗坏血酸、异烟酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸，以及氨基酸等。通式II表示的化合物可和多摩尔的酸加成形成盐，这些多摩尔的酸可以是单一的也可以是组合的，这主要根据需要用相应的溶剂或稀释剂的情况来决定。这些盐也可以它们的水合物形式存在。这些加成的盐可通过阴离子交换而去除。
本发明所涉及的氨基生物蝶呤衍生物和它们相应的盐类可和适合辅料(包括相应的医药上准许应用的赋形剂、粘合剂、缓释剂、稳定剂、香料、调味剂和色素等)做成片剂或胶囊口服，也可做成相应的针剂用于临床。
对本发明中的通式I氨基生物蝶呤衍生物抑制iNOS活性的测定，根据已知的测定方法(参见钟慈声，孙安阳 主编一氧化氮的生物医学，上海上海医科大学出版社，1997，p.361-363，381-385)进行。
本发明通式I所表示的化合物是本发明首次合成的新化合物，均经过各种分析方法进行了结构鉴定，包括1H-NMR、MS、和元素分析。所有氨基生物蝶呤衍生物都是按照或者参照已发表的Viscontini方法进行合成(参见Schircks B，Bieri JH，Viscontoni M；Helv Chim Acta，1985，681639-1643)。
通式I化合物的合成有以下步骤(1)中间体2，5，6-三氨基-4-取代胺嘧啶(A)的合成
式中NR1R2＝N(C2H5)2；HNCH(CH3)2；N(CH2CH2)2NCH3；HN(CH2)5；HNCH(CH2)2；HNCH(CH2)5；HNCH2CH2CH2CH3；N(CH2CH2CH2CH3)2；HNCH2CH2OH；HNCH2C(CH3)3等(与权力要求1中一致)。
首先将对氯苯胺重氮化，然后和2，6-二氨基-4-氯嘧啶结合生成2，6-二氨基-4-氯-5-对氯苯偶氮嘧啶，接着用取代胺取代氯，所得的化合物用锌粉在酸性条件下还原偶氮基得化合物2，5，6-三氨基-4-取代胺嘧啶(嘧啶衍生物的合成方法参考Froehlich L，Kotsonis P，Traub H，et al，J Med Chem，1999，424108-4121。)(2)中间体2，3，4-三乙酰氧基-5-脱氧阿拉伯苯腙(B)的合成 出于简化制备操作的目的，采用了“一锅煮”的方法首先，将L-鼠李糖与乙硫醇在低温下缩合成缩硫醛，以有机酸(甲酸，乙酸等)为介质用双氧水氧化分子中的硫原子，形成二乙磺酰基L-鼠李糖，此化合物在pH＝9～10的水溶液中脱去一分子的CH2(SO2CH2CH3)2生成5-脱氧阿拉伯糖④。将5-脱氧阿拉伯糖与苯肼反应后再经过乙酰化即得(B)。
表 设计合成的氨基生物蝶呤衍生物编号和对应结构 (3)目的化合物的合成
将前面制得的中间体(A)和(B)同醋酸钠，保险粉在醇水溶液中缩合后，经用I2的醇溶液进行芳构化，得产品11，12，进一步皂化水解得产品1-10。因部分中间体易于被氧化，所以反应过程中必要的步骤需在氮气保护下进行。
具体实施例方式
1.合成中间体(A)按照文献(Froehlich L，Kotsonis P，Traub H，et al，J Med Chem，1999，424108-4121)方法制备。
中间体(B)的制备(主要参见专利EP A1 0153095和文献Schircks B，Bieri JHand Viscontoni M；Helv Chim Acta，1985，681639-1643.)L-鼠李糖二乙基缩硫醛②取L-鼠李糖一水合物40克加入到40mL 37％的浓盐酸中，0℃下快速搅拌中再加入60mL乙硫醇，约15分钟后有大量固体生成，产物略带粉色。继续搅拌15分钟后加入50mL水搅拌，过滤水洗，五氧化二磷真空干燥，得白色固体②39克，m.p183-184℃，收率66.8％。
1，1-二乙磺酰基-L-鼠李糖③取L-鼠李糖二乙基缩硫醛②2.7克(0.01mol)溶于10mL乙酸中冷却到0℃，控温在0℃以下滴加5.1克30％H2O2(0.08mol)，加毕维持温度1小时后升到室温下反应48小时。反应完毕减压蒸去乙酸和过量的双氧水，得无色或浅黄色粘稠液③，用于下一步。
5-脱氧-L-阿拉伯糖④将上一步制得的产品③溶于20mL水中，用浓氨水调pH＝9.5，于室温下搅拌24小时，有白色固体[脱下来的CH2(SO2CH2CH3)2]生成，过滤，用20mL氯仿萃取12小时，将水层减压蒸去水得黄色油状物，即产品④，产率为65％(以②计算)。
5-脱氧-L-阿拉伯糖苯腙⑤将上步制得的产品④(0.0075mol)溶于20mL甲醇中。取苯肼0.89克(0.00825mol)加入到④的甲醇液中，再加入一滴冰醋酸，氮气保护下于室温搅拌反应2小时。真空浓缩蒸干后得橙红色粘稠液。将此粘稠液用乙醚洗两次(10mL/次)得橙色固化物，将此固体物溶于50mL乙酸乙酯中，用水洗两次(50mL/次)，乙酸乙酯液用无水硫酸钠干燥后，蒸干得橙色固体⑤1.91克(含有溶剂乙酸乙酯，到此总收率按②算为45％～50％)。
2，3，4-三乙酰氧基-5-脱氧-L-阿拉伯糖苯腙(B)将上步制得的产品1.91克⑤溶于10mL吡啶中，0℃以下滴加10mL乙酸酐，加毕氮气保护下保温搅拌30分钟后，升至室温反应5小时，减压浓缩后，低温下溶于50mL甲醇中得产品(B)的甲醇溶液，备用。
2-氨基-4-二乙氨基-6-〔(1S，2R)-二羟基丙基〕蝶啶(1)的“一锅法”制备第一步缩合配制1.97克(0.024mol)NaAc，1.0克NaS2O4的40mL水溶液和1.67克(0.006mol)2，6-二氨基-4-二乙基胺基嘧啶盐酸盐，1.0克NaS2O4的60毫升水溶液，并先后加入上步制得的2，3，4-三乙酰氧基-5-脱氧-L-阿拉伯糖苯腙(按0.005mol计)甲醇液中，搅拌，在氮气保护下于35-40℃反应36小时。
第二步芳构化方法1室温下滴加I2/MeOH溶液，如淀粉碘化钾试纸检测碘过量，室温下反应3小时后，加入少量NaS2O4除去过量的碘，减压蒸干，再加入50mL甲醇溶解，滤去不溶物，减压蒸干后200～300目硅胶后柱层析(氯仿∶甲醇＝20∶1)。收集含产品部分。
方法2室温下搅拌并通入氧气24-48小时，芳构化完全后减压蒸干，再加入50mL甲醇溶解，滤去不溶物，减压蒸干后200～300目硅胶后柱层析(氯仿∶甲醇＝20∶1)。收集含产品部分。
第三步分离将芳构化所得的产品经硅胶(100～200目)柱层析(氯仿∶甲醇＝40∶1，20∶1)，得淡黄色固体，丙酮重结晶得淡黄色固体2-氨基-4-二乙基氨基-6-〔(1S，2R)-二乙酰氧基〕蝶啶(11)0.15克，总产率4.0％(按二乙磺酰基L-鼠李糖②计算)，m.p165-167℃。ESI-MS377.4[M+H]+，753.5[2M+1]+(C17H24N6O4，Mr＝376.4)；1H-NMR(Bruker AV-300，D6-DMSO)δ1.18(d，J＝6.54Hz，3H，3’-CH3)；1.19(bm，3H，N4-CH2CH3)；1.28(bm，3H，N4-CH2CH3)；1.97(s，3H，CH3-(OAc-2’))；2.28(s，3H，CH3-(OAc-1’))；3.83(bm，2H，N4-CH2CH3)；4.15～4.33(bm，2H，N4-CH2CH3)；5.33(m，1H，CH-2’)；5.96(d，J＝4.33Hz，1H，CH-1’)；8.86(s，1H，CH-7)。
Anal Calcd forC17H24N6O4·H2O(394.4)C51.77，H6.65，N21.30；FoundC52.21，H6.65，N20.75。
第四步水解方法1将含产品11部分，溶于20mL甲醇和20mL浓氨水的混合液中于50℃下反应3-5小时，反应完毕减压蒸干，用30mL水溶解，用浓盐酸调pH＝1，滤去不溶物，用稀NaOH/H2O调pH＝8减压蒸干，硅胶(200～300目)柱层析(氯仿∶甲醇＝20∶1～10∶1)。得黄色固体，用甲醇-丙酮重结晶得淡黄色粉末状产品2-氨基-4-二乙氨基-6-〔(1S，2R)-二羟基丙基〕蝶啶(1)，m.p154-156℃。
方法2将含产品11部分，溶于40mL浓氨水中于50℃下反应1-3小时，反应完毕减压蒸去氨气，滤去不溶物，处理后硅胶(200～300目)柱层析(氯仿∶甲醇＝10∶1)。得淡黄色固体，用甲醇-丙酮重结晶，得黄色固体粉末2-氨基-4-二乙氨基-6-〔(1S，2R)-二羟基丙基〕蝶啶(1)0.5克(0.00152mol)，m.p154-156℃。总收率为15.3％(按二乙磺酰基L-鼠李糖②计算)；ESI-MS293.2[M+H]+(C13H20N6O2，M＝292.2)；1H-NMR(AV-300，D6-DMSO)δ1.05(d，J＝6.31Hz，3H，CH3-3’)；1.24[t，6H，N4-(CH2CH3)2]；3.98-3.88[bm，4H，N4-(CH2CH3)2]；3.94(m，1H，CH-2’)；4.38(d，J＝5.48Hz，1H，CH-1’)；8.86(s，1H，CH-7)。Anal Calcd forC13H20N6O2·HCl(358.81)C，43.51，H，5.90 N，23.41；FoundC，43.23 H，5.71 N，22.822-氨基-4-异丙基氨基-6-〔(1S，2R)-二羟基丙基〕蝶啶(2)方法同于(1)的制备，用甲醇-丙酮重结晶，得黄色固体粉末(2)0.13克，总产率4.7％(按二乙磺酰基L-鼠李糖②计算)，m.p185-189℃；ESI-MS279.1[M+H]+，301.1[M+Na]+(C12H18N6O2，M＝278.1)；1H-NMR(Bruker AV-300，D6-DMSO)δ1.13(d，J＝6.30Hz，3H，CH3-3’)；1.25[d，J＝6.6Hz，6H，N4-CH(CH3)2]；4.43-4.35[m，2H，CH-1’，N4-CH(CH3)2]；3.94(m，1H，CH-2’)；4.39(d，1H，CH-1’)；8.68(s，1H，CH-7)。
Anal Calcd forC12H18N6O2·HCl(314.70)C，45.84 H，6.09 N，26.71；FoundC，45.33 H，6.51 N，26.532-氨基-4-(4-甲基)哌嗪胺基-6〔(1S，2R)-二羟基丙基〕蝶啶(3)方法同于(1)的制备，用甲醇-丙酮重结晶，得黄色粉末固体0.15克，产率4.7％(按二乙磺酰基L-鼠李糖②计算)，m.p189-192℃；ESI-MS320.1[M+H]+，342.2[M+Na]+(C14H21N7O2，M＝319.1)；1H-NMR(Bruker AV-300，D6-DMSO)δ1.08(d，J＝6.27Hz，3H，CH3-3’)；2.27(s，3H，NCH3)；2.54～2.49[m，4H，(-CH2)2NCH3]；3.90(bs，1H，CH-2’)；4.37(bs，1H，CH-1’)；4.30[bs，4H，N4(CH2-)2]；4.61(bs，1H，OH-2’)；5.50(bd，1H，OH-1’)；6.62(bs，2H，N2H2)；8.70(s，1H，CH-7)。
Anal Calcd forC14H21N7O2·0.5HCl·0.5CH3OH(353.62)C49.25，H6.70，N27.73；FoundC49.52，H6.70，N27.45.
2-氨基-4-吡嗪氨基-6-〔(1S，2R)-二乙酰氧基〕蝶啶(12)方法参见(11)的制备，将芳香化所得的产品经硅胶(100～200目)柱层析(氯仿∶甲醇＝40∶1～20∶1)，得淡黄色粉末固体，丙酮重结晶得产品(12_1)0.15克，产率3.9％(按二乙磺酰基L-鼠李糖②计算)，m.p170-172℃；ESI-MS389.1[M+H]+，411.1[M+Na]+(C18H24N6O4，M＝388.1)；1H-NMR(BrukerAV-300，D6-DMSO)δ1.17(d，J＝6.60Hz，3H，CH3-3’)，1.64[bm，6H，N4(CH2)2(CH2)3]；4.20[bs，4H，N4(CH2)2(CH2)3]，1.95[s，3H，CH3-(OAc-2’)]；2.12[s，3H，CH3-(OAc-1’)]；5.31[m，1H，CH-2’]；5.81[d，J＝4.5Hz，1H，CH-1’]；6.72(b，0.3H，N2H2)；8.65(s，1H，CH-7)Anal Calcd forC18H24N6O4·H2O(406.44)C，53.19 H，6.45 N，20.68；FoundC，53.46 H，6.28 N，21.212-氨基-4-吡嗪胺基-6-〔(1S，2R)-二羟基丙基〕蝶啶(4)方法同于(1)的制备，用甲醇-丙酮重结晶，得黄色粉末固体0.52克，产率16.4％(按二乙磺酰基L-鼠李糖②计算)，m.p160-161℃；
ESI-MS305.1[M+H]+，327.1[M+Na]+(C14H20N7O2，M＝304.1)；1H-NMR(BrukerAV-300，D6-DMSO)δ1.06(d，J＝6.30Hz，3H，CH3-3’)；1.68[s，6H，N4(CH2-)2(-CH2)3]；3.91(m，1H，CH-2’)；4.41(d，J＝4.50Hz，1H，CH-1’)；4.31[bs，4H，N4(CH2-)2]；4.67(bs，1H，OH-2’)；5.65(d，1H，OH-1’)；7.0-7.4(bs，2H，N2H2)；8.72(s，1H，CH-7)。Anal Calcd forC14H20N7O2·2HCl(377.46)C，44.55 H，5.87 N，22.26；FoundC，43.69 H，5.84 N，21.912-氨基-4-环己基胺基-6-〔(1S，2R)-二羟基丙基〕蝶啶(5)方法同于(1)的制备，用甲醇-丙酮重结晶，得黄色粉末固体产品0.27克，产率8.5％(按二乙磺酰基L-鼠李糖②计算)，m.p120-125℃；ESI-MS319.1[M+H]+(C15H22N6O2，M＝318.1)；1H-NMR(Bruker AV-300，D6-DMSO)δ1.14(d，J＝6.18Hz，3H，CH3-3’)；1.17-2.07[m，10H，N4-CH(-CH2-)5]；3.81(m，1H，CH-2’)；4.45(m，1H，CH-1’)；4.13(m，1H，N4-CH)；4.69(s，1H，OH-2’)；5.54(d，1H，OH-1’)；7.0-7.7(bs，2H，N2H2)；8.54(bd，1H，N4H)；8.75(s，1H，CH-7)。
Anal Calcd forC15H22N6O2·2.5HCl·0.5C2H5OH(432.56)C，44.43 H，6.39N，19.42；FoundC，44.16 H，5.62 N，19.232-氨基-4-环丙胺基-6-〔(1S，2R)-二羟基丙基〕蝶啶(6)方法同于(1)的制备，用甲醇-丙酮重结晶，得黄色粉末固体产品0.35克，产率12.7％(按二乙磺酰基L-鼠李糖②计算)，m.p198-200℃(分解)；ESI-MS277.1[M+H]+(C12H16N6O2，M＝276.1)；1H-NMR(Bruker AV-300，D6-DMSO)δ1.13(d，J＝6.22Hz，3H，CH3-3’)；0.73-0.82[m，4H，N4-CH(-CH2)2]；3.04(m，1H，N4-CH)；3.78(m，1H，CH-2’)；4.41(d，J＝6.47Hz，1H，CH-1’)；4.67(bs，1H，OH-2’)；5.43(bs，1H，OH-1’)；6.84(bs，2H，N2H2)；8.29(bs，1H，N4H)；8.71(s，1H，CH-7)。
Anal Calcd forC12H16N6O2·0.5HCl·CH3OH(326.57)C，47.81 H，6.32 N，25.73；FoundC，47.87 H，5.85 N，25.982-氨基-4-正丁基胺基-6-〔(1S，2R)-二羟基丙基〕蝶啶(7)方法同于(1)的制备，用甲醇-丙酮重结晶，得黄色粉末固体产品0.15克，产率5.1％(按二乙磺酰基L-鼠李糖②计算)，m.p178-187℃(分解)；ESI-MS293.2[M+H]+，315.2[M+Na]+(C13H20N6O2，M＝292.2)；1H-NMR(Bruker AV-500，D6-DMSO)δ1.12(d，J＝6.25Hz，3H，CH3-3’)；0.93(t，J＝7.44Hz，3H，N4-CH2CH2CH2CH3)；1.35(m，J＝7.32Hz，2H，N4-CH2CH2CH2CH3)；1.61(m，J＝7.41Hz，2H，N4-CH2CH2CH2CH3)；3.48(m，2H，N4-CH2CH2CH2CH3)；3.86(m，1H，CH-2’)；4.40(d，1H，CH-1’)；4.63(d，J＝5.39Hz，1H，OH-2’)；5.42(s，1H，OH-1’)；6.62(bs，2H，N2H2)；8.14(bs，1H，N4H)；8.70(s，1H，CH-7)。Anal Calcd forC13H20N6O2·0.5H2O(301.35)C51.77，H7.03，N27.89；FoundC51.85，H7.17，N27.30。
2-氨基-4-二正丁基胺基-6-〔(1S，2R)-二羟基丙基〕蝶啶(8)方法同于(1)的制备，用甲醇-丙酮重结晶，得黄色粉末固体产品0.31克，产率8.6％(按二乙磺酰基L-鼠李糖②计算)，m.p178-185℃(分解)；ESI-MS349.1[M+H]+，371.2[M+Na]+(C13H20N6O2M＝348.1)；1H-NMR(Bruker AV-500，D6-DMSO)δ1.07(d，J＝6.28Hz，3H，CH3-3’)；0.95[t，J＝7.37Hz，6H，N4(CH2CH2CH2CH3)2]；1.37[m，J＝7.37Hz，4H，N4(CH2CH2CH2CH3)2]；1.70[m，J＝7.37Hz，4H，N4(CH2CH2CH2CH3)2]；3.75-4.25[bm，5H，N4(CH2-)2，CH-2’]；3.86(m，1H，CH-2’)；4.43(d，J＝5.35Hz，1H，CH-1’)；4.67(bs，1H，OH-2’)；5.58(bs，1H，OH-1’)；6.83(bs，2H，N2H2)；8.72(s，1H，CH-7)；Anal Calcd forC17H28N6O2·1.75H2O(348.45)C，53.74 H，8.36 N，22.12；FoundC，54.12 H，8.36 N，21.632-氨基-4-(2-羟基乙基)胺基-6-〔(1S，2R)-二羟基丙基〕蝶啶(9)方法同于(1)的制备，用甲醇-丙酮重结晶，得黄色粉末固体产品0.23克，产率8.2％(按二乙磺酰基L-鼠李糖②计算)，m.p215-218℃(分解)。
ESI-MS281.0[M+H]+，303.1[M+Na]+(C11H16N6O3，M＝280)1H-NMR(Bruker AV-500，D6-DMSO)δ1.12(d，J＝6.24Hz，3H，CH3-3’)；3.65-3.58[m，4H，N4-CH2CH2OH]；3.89(m，1H，CH-2’)；4.47(d，1H，CH-1’)；4.72(bs，1H，OH-2’)；4.91[bs，1H，N4CH2CH2OH]；5.63(bd，1H，OH-1’)；7.25-7.75(bs，2H，N2H2)；8.81(s，1H，N4H)；8.79(s，1H，CH-7)；Anal Calcd forC11H16N6O3·HCl(316.64)C，41.69 H，5.41 N，26.54；FoundC，41.81 H，5.63 N，26.72
2-氨基-4-异丁氨基胺基-6-〔(1S，2R)-二羟基丙基〕蝶啶盐酸盐(10)方法同于(1)的制备，用甲醇-丙酮重结晶，得黄色粉末固体产品0.39克，产率12.0％(按二乙磺酰基L-鼠李糖②计算)，m.p275-280℃(分解)；ESI-MS293.2[M+H]+(C13H20N6O2，M＝292.2)；1H-NMR(Bruker AV-300，D6-DMSO)δ1.12(d，J＝6.24Hz，3H，CH3-3’)；0.93[d，6H，N4CH(CH3)2]；2.08(m，1H，N4CH2CH)；3.39-3.44(m，2H，N4CH2-)；3.92(m，1H，CH-2’)；4.54(d，J＝5.79Hz，1H，CH-1’)；4.79(bs，1H，OH-2’)；5.77(bs，1H，OH-1’)；7.89(bs，1H，N2H)；8.73(bs，1H，N2H)；8.85(s，1H，CH-7)；9.71(t，1H，N4H·HCl)；13.09(bs，1H，N4H·HCl)；Anal Calcd forC13H20N6O2·HCl·1.5H2O(355.2)C43.92，H6.81，N23.65；FoundC43.80，H6.73，N23.84。
表 设计合成目标化合物的编号和对应结构 2.诱导型一氧化氮合成酶抑制剂活性的研究
2.1样品与试剂氨基生物蝶呤衍生物本发明中合成的14个化合物，其中13个进行了iNOS的抑制活性研究，化合物121没有进行活性测试。活性测定是以水作溶剂进行的，将药品配制成DMSO溶液，按需要量取一定量的用水进行稀释，或加入到测定溶液中。
诱导型一氧化氮合成酶Rcombinnation from E.Col是Cayman Chenical公司产品。
四氢生物蝶呤(Tetrohtdro-L-biopterin)二盐酸盐，纯度＞99％，由CaymanChenical公司提供。
一氧化氮合成酶试剂盒由南京建成生物工程研究所提供提供，批号20040511。
2.2.主要仪器HH-4电热恒温水浴箱常州国华电器有限公司。
BS110S分析天平北京塞多利天平有限公司。
52紫外光栅分光光度计上海分析仪器总厂。
2.3.药物体外抑制诱导型一氧化氮百分率的测定试验方法在一氧化氮试剂盒的1号试剂中不加入四氢生物喋呤(BH4)，按试剂盒方法分别在试管中加入试剂1、试剂2、试剂3、iNOS样品、BH4、受试药物后混匀，37摄氏度水浴下准确反应20分钟，加入试剂4终止反应，再加入终止液后混匀，530nm处，1cm光径，蒸馏水调零，比色测定吸光值。
测定BH4的饱和浓度按照试剂盒方法按步骤加入试剂，各个试管中分别加入不同浓度的BH4，测定各管吸光值，并计算其饱和浓度。
3.2.4.测定氨基生物蝶呤(ABP)及13个氨基生物蝶呤衍生物的iNOS活性抑制百分率根据文献，配制药物浓度为BH4饱和浓度的48倍，同样按试剂盒的方法测定吸光值，并计算出抑制百分率。
抑制百分率＝(标准管吸光值-测定管吸光值)/(标准管吸光值-空白管吸光值)×100％3.2.5.氨基生物蝶呤衍生物IC50(半数抑制浓度)的测定根据前一次试验BH4饱和浓度测定结果，以及药物的抑制百分率达100％的药物浓度，我们推荐以下几个剂量，分别为32倍、24倍、18倍、13.5倍。实验中每个试管中加入的诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)和BH4的浓度是固定的。测得各管在530nm处的吸光度，用直线回归的方法计算出各自的半数抑制浓度。
表 氨基生物蝶呤衍生物对iNOS的抑制效果
注(1)表中iNOS活性数据测定时的抑制剂浓度均为110μmmol/L、BH4的饱和浓度2.3μM。Vmax为没有抑制剂时在的BH4饱和浓度作用下的iNOS活性(2)ND表示没有进行测定。(3)ABP为4-氨基生物蝶呤。
从活性测定结果可以看出，设计合成的化合物多数具有iNOS抑制效果，而12号和4号化合物同属类似结构，具有增加iNOS活性的作用，设计的化合物具有调节iNOS活性作用。
权利要求
1.下述通式(I)表示的化合物 R1和R2相同或不同，各自独立的表示有取代基、无取代基的C1-C6直链、支链烷基或芳基；苄基；R1、R2、R3和R4不同时为H；R1为H或甲基时，R2代表有取代基的或无取代基的三元～六元环烷基；-(CH2)nOH(n＝1～6)；-C6H4COGlu、-C6H4CH2COGlu、-C6H4COGlu、-C6H4CH2COGlu，Glu代表-NHCH(COOR5)CH2CH2COOR6，R5与R6相同或不同，各自独立地表示H、甲基或乙基等；-C6H4COOR7R8、-C6H4CH2COOR7R8，R7和R8相同或不同，各自独立地表示H、甲基、乙基等；或NR1R2代表哌啶基、哌嗪基甲、基哌嗪基或三元～六元脂肪环单或二取代氨基。R3和R4相同或不同，各自独立的表示H、C1-C6直链或支链烷基；各种取代的酰基如R9CO-、R9C6H4(CH2)nCO-等(n＝0～6)，其中R9为C1-C6直链或支链烷基、烷氧基；R10C6H4(CH2)nCH2-等(n＝0～5)，R10为相同或不同的C1-C6直链或支链烷基、烷氧基；
2.如权利要求1表示的化合物，其中R1和R2相同或不同，各自独立的表示有取代基、无取代基的C1-C6直链、支链烷基或芳基；苄基；R1、R2、R3和R4不同时为H；R1为H或甲基时，R2代表有取代基的或无取代基的三元～六元环烷基；-(CH2)nOH，n＝1～6；-C6H4COGlu、-C6H4CH2COGlu、-C6H4COGlu、-C6H4CH2COGlu，Glu代表-NHCH(COOR5)CH2CH2COOR6，R5与R6相同或不同，各自独立地表示H、甲基或乙基等；-C6H4COOR7R8、-C6H4CH2COOR7R8，R7和R8相同或不同，各自独立地表示H、甲基、乙基等；或NR1R2代表哌啶基、哌嗪基甲、基哌嗪基或三元～六元脂肪环单或二取代氨基。R3和R4相同或不同，各自独立的表示H、C1-C6直链或支链烷基；各种取代的酰基如R9CO-、R9C6H4(CH2)nCO-等，其中R9为C1-C6直链或支链烷基、烷氧基，(n＝0～6)；R10C6H4(CH2)nCH2-等，R10为相同或不同的C1-C6直链或支链烷基、烷氧基，(n＝0～5)；
3.权利要求1或2表示的化合物，其中R1和R2相同或不同，各自独立的表示有取代基、无取代基的C1-C6直链、支链烷基或芳基；R3和R4相同，表示H、C1-C6直链或支链烷基；各种取代的酰基如R5CO-、R5C6H4(CH2)nCO-(n＝0～6)等，其中R5为C1-C6直链或支链烷基、烷氧基；
4.权利要求1-3任意一项的化合物在制备诱导性一氧化氮合成酶药物中的应用。
5.权利要求1-3任意一项的化合物在制备在败血性和(或)出血性休克，或用细胞毒素进行肿瘤化学治疗和肝硬化或肝萎缩和(或)肝功能衰退时所引起的血压下降或(和)止血障碍药物中的应用。
6.权利要求1-3任意一项的化合物在制备预防和治疗炎症疾病药物中的应用。
7.权利要求1-3任意一项的化合物在制备预防和治疗异体器官和组织移植的排斥反应药物以及胰岛素依赖型糖尿病药物中的应用。
8.权利要求1-3任意一项的化合物在制备预防和治疗细胞毒素进行肿瘤的化学治疗、化学物质或药物以及慢性肝炎引发的多种肝损伤、肝功能衰退以及预防和治疗心肌梗塞损伤、病毒性心肌炎药物中的应用。
9.权利要求1-3任意一项的化合物在制备预防和治疗病毒性神经退化、变化疾病及痛觉过敏、癫痫、偏头痛药物中的应用。
10.一种药物组合物，其中含有治疗有效量的权利要求1-3任意一项的化合物并含有常规药用载体。
全文摘要
本发明设计并合成了一种具有控制体内一氧化氮自由基(简写为NO)过多产生的氨基生物蝶呤类衍生物，它具有通式(I)所述的化学结构。本发明具有选择性抑制诱导型一氧化氮合成酶的作用，可用以制备具有预防和治疗体内一氧化氮水平升高而产生的各种疾病的药物。
文档编号A61P29/00GK1583745SQ20041004487
公开日2005年2月23日 申请日期2004年5月26日 优先权日2004年5月26日
发明者姚其正, 姜力勋, 石静波, 冯明声, 郭平 申请人:中国药科大学
技术领域：
本发明涉及到设计与合成具有控制体内一氧化氮自由基(简写为NO)过多产生的氨基生物蝶呤衍生物，尤其是具有抑制诱导型一氧化氮合成酶(简写为iNOS)作用的氨基生物蝶呤衍生物，用以制备具有预防和治疗体内一氧化氮水平升高而产生的各种疾病的药物。
背景技术：
NO是一种低分子量疏水性的具有高度反应活性的自由基，NO分子可以自由穿过细胞膜，作用于细胞内的靶分子，理论上讲NO存在于细胞和组织内任何部位，故能在体内调控多种细胞功能，产生广泛的生物效应。作为化学介质NO能调节心血管系统具有维持血管平滑肌紧张度，抑制血小板聚集和黏附，调节血管平滑肌细胞的增生，介导巨噬细胞对低密度脂蛋白的氧化修饰等功能。作为神经递质或神经调质，NO参与信息传递包括在中枢神经系统中参与记忆的形成、进行神经与血管之间的协调、参与一些行为调节、维持与强化痛觉；作用于植物神经参与前列腺素介导的交感神经活化作用；在外周神经系统具有特殊的神经信使功能，包括调节胃肠道功能、调节呼吸功能、调节生殖泌尿功能、介导某些神经元性血管舒张作用、抑制嗜铬细胞释放儿茶酚胺和作为胰岛素分泌过程的重要调质。NO作为病理生理性信使介导炎症过程和免疫反应的作用已被确立，一方面，NO和O2-，形成超氧负离子ONOO-，产生强大的细胞毒性；另一方面，NO上调使巨噬细胞释放活性氧中间体和炎症性细胞因子，对机体起到炎症介导过程，又起到对细胞生长分化调节作用。NO在炎症和免疫反应中起着关键的损伤和保护双重作用。
NO水平升高而引起的疾病和病症主要包括病理性血压下降，例如败血症或出血性休克；用细胞毒素进行肿瘤的化学治疗、化学物质或药物以及慢性肝炎引发的多种肝损伤(即化学性，病毒性和免疫性肝损伤)，肝硬化或肝萎缩，和肝功能衰退；也包括进行性炎症，如类风湿性关节炎和溃疡性结肠炎，以及胰岛素依赖型糖尿病和器官移植排斥反应等。
另外，下列一些疾病也与诱导产生的NO水平升高有关，在心血管循环方面，如心肌梗塞损伤、病毒性感染引起的心肌炎；在神经和中枢神经方面，如病毒性神经退化(变性)疾病，以及痛觉过敏、癫痫、偏头痛等。总之，过量NO产生与许多疾病有关，尤其iNOS的激活产生过多的NO是重要的致病因素，因此，研制iNOS选择抑制剂是十分必要的。
鉴于NO的广泛的病理生理功能，其调控剂的研究已成为当代生物医学和药学研究的热点与前沿。内源性的NO的来源是一氧化氮合成酶(NO Synthase，简写为NOS)，以L-精氨酸(L_Arginine，简写为L-Arg)和分子氧为底物，催化L-Arg中的两个等价胍基氮之一，经氧化反应生成的，同时生成L-瓜氨酸(L-Citrulline，简写为L-Cit)。
至今三种结构独特的NOS异构酶已被分离、克隆和确定(参见FoerstermannU，Gath I，et al，Biochem Pharmacol，1995，501321-1332)，根据这三种NOS亚型来源于细胞或组织的不同和其表达方式而分别给与不同的命名，如集中于血管内皮细胞中的亚型称为内皮型NOS(endothelial NOS，eNOS或NOS-III)，存在神经组织中的称为神经元型NOS(neuronal NOS，nNOS或NOS-I)，这两种异构酶在细胞处于生理状态下即有表达，一般来说，它们是通过机体对Ca2+水平的控制而维持在低水平的持续表达状态，在NO保持在低浓度下发挥生理功能，故常又将eNO和nNOS合称为结构型NOS(Constitutive NOS，cNOS)。第三种异构酶即所谓的诱导型NOS(inducible NOS，iNOS或NOS-II)，它在巨噬细胞和许多暴露在细胞素下的细胞中表达，并且在对细胞毒素物质产生的早期免疫应答反应方面起到关键作用。一般认为iNOS在生理作用下不表达，不依赖于体内的Ca2+水平和调钙蛋白，重要的是它通过诱导后被合成，如败血性休克，感染性、免疫性疾病，以及细胞因子，内毒素等许多因素均诱导iNOS大量合成。一旦NO大量的生成，就会产生广泛的损害。
初期的NOS抑制剂主要是内源性底物L-Arg的类似物，即结构修饰了的L-Arg。在生物化学水平上NOS的一些辅因子已经鉴明，它们有还原性尼克酰胺腺苷二核苷酸磷酸(NADPH)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FDA)、黄素单核苷酸(FMN)、血红素和四氢生物蝶呤(BH4)。故除以上L-Arg型的NOS抑制剂外，NOS上其它的结合位置也可以作为药理学上的靶点，如考虑干扰NOS还原酶区黄素辅酶的结合位点，有人开发了二亚苯基碘鎓(DPI)(参见Griffith OW，Gross SS，InMethods in Nitric Oxide ResearchFeelisch M，Stamler JS，ed；JohnWiley & Sons；New York，1996，p187-208。)和一喹啉类化合物(Fujisawa PharmCo Ltd.，WO 970225，1977)；针对NOS氧化酶区，Griffith和Gross合成出不同类型的吲哚和咪唑作为配体结合到血红素辅基上，来达到抑制NOS的目的。但是上面介绍的NOS抑制剂都缺乏相当明显的对iNOS异构酶的抑制选择性。
生物蝶呤(Biopterin，BP)四氢生物蝶呤(Tetrahydrobiopterin，BH4)BH4是被第一个发现的，已经被鉴定的最重要的NOS辅酶之一，经iNOS和BH4共结晶的X光衍射结构分析，可以看到在iNOS的氧化酶区有一个带有血红素、L-Arg、Phe470、Ser112和Trp457等氨基酸所形成供嵌入BH4的iNOS的蝶啶结合区，在这里BH4分子中的N-3、O4、N-5、C6侧链和血红素上的丙酸基、Arg375、Phe470、Ser112等由亲水或/和亲脂的相互作用(参见Crane BR.et al，Science，1998，2972121-2126)，BH4的辅助作用主要是在iNOS发生催化作用的第一步，即L-Arg转变为Nω-羟基-L-Arg(NHA)时，向血红素的丙酰基提供一个电子和BH4的3，4-酰胺上的一个氢质子(参见Crane BR，et al，Biochemistry，2000，394608-4621)。
虽然目前对BH4催化NOS的机制还没有完全研究清楚，但是有关研究已表明NOS以二聚体的形式才能发挥作用，而BH4对iNOS二聚体组装及稳定性起关键作用(Alderton WK，Cooper CE，Knowles RG，et al.Nitric Oxide SynthaseStruture，Function and Inhibition[J]，Biochem J，2001，357593-615)；BH4能催化促进各种NOS达到最大催化活性，哺乳动物生物体内BH4生成越多，NOS的催化活性越高(参见Gross SS，Levi RJ，Biol Chem，1992，26725722)；细胞因子，内毒素等也能诱导BH4的大量生成，其原因是在生物体内有从头合成和补救合成两条途径来合成BH4，而BH4的从头合成的关键酶GTP环水解酶和iNOS一样，其表达也受内毒素或细胞因子诱导，从而会增加细胞中的BH4的产生和水平的提高。有关BH4的研究还表明BH4是芳香氨基酸羟化酶的辅因子，而这些氨基酸羟化的产物是人体合成神经递质的原料，直接抑制体内BH4的生物合成必然会引起严重的副反应。然而，BH4对NOS的催化机理同催化芳香氨基酸羟化酶的机理是不同的(Thny B，Auerbach G，Blau N；Tetrahydrobiopterin biosynthesis，regeneration and functions，Biochem.J.2000，3471-16.)在蝶啶化合物中，蝶呤类化合物(4-羰基化合物)和大多数4-氨(胺)基化合物都是芳香氨基酸羟化酶的辅因子(Kappock TJ，Caradonna JP，Pterin-Dependent Amino Acid Hydroxylase，Chem.Rev.1996，96，2650-2756)，故氨基生物蝶呤类NOS抑制剂不会对芳香氨基酸羟化酶产生不良影响。另外研究表明，BH4对iNOS的催化活性远强于对另外两种NOS催化活性(Gibraeil HD，Dittrich P，Saleh S，et al.Inhibition ofendotoxin-induced vascular hyporeactivity by 4-amino-tetrahydrobiopterin.British J.of Pharmacology，2000，1311757-1765)。因此，BH4与其iNOS的结合区可作为理想的选择性药理干预靶点，基于此思想，我们设计合成了一系列的氨基生物蝶呤类衍生物，结构式用分子式(I)表示。这些氨基生物蝶呤类衍生物可和BH4竞争地结合到iNOS中的BH4结合区，从而改变iNOS结构或电学性质，达到抑制iNOS活性的目的。经过生物活性测试的结果表明，氨基生物蝶呤类衍生物具有抑制iNOS活性的作用，可用于处理iNOS体内过量表达导致NO升高而引发的疾病。
发明内容
本发明要解决的技术问题就是设计与合成具有控制体内一氧化氮自由基(简写为NO)过多产生的氨基生物蝶呤衍生物，尤其是具有抑制诱导型一氧化氮合成酶(简写为iNOS)作用的氨基生物蝶呤衍生物，用以制备具有预防和治疗体内一氧化氮水平升高而产生的各种疾病的药物。
以BH4为靶点，合成较好的iNOS的抑制剂必须满足以下条件(1)抑制剂应是BP类似物，这样才有可能适应iNOS中的BH4结合区结构上的需求；(2)所合成的BH4衍生物可以是非还原型的BP类似物，并且在BP的4-位和6-位的1，2-二羟基丙基上有较多的修饰基团的变化，其作用和BH4竞争地与iNOS结合。根据这两点，本发明提供了一般通式为(I)的氨基生物蝶呤类衍生物能成为iNOS抑制剂。
下述通式(I)表示氨基生物蝶呤衍生物或其药学上可接受的盐或其水合物 R1和R2相同或不同，各自独立的表示有取代基、无取代基的C1-C6直链、支链烷基或芳基；苄基；R1、R2、R3和R4不同时为H；R1为H或甲基时，R2代表有取代基的或无取代基的三元～六元环烷基；-(CH2)nOH(n＝1～6)；-C6H4COGlu、-C6H4CH2COGlu、-C6H4COGlu、-C6H4CH2COGlu，Glu代表-NHCH(COOR5)CH2CH2COOR6，R5与R6相同或不同，各自独立地表示H、甲基或乙基等；-C6H4COOR7R8、-C6H4CH2COOR7R8，R7和R8相同或不同，各自独立地表示H、甲基、乙基等；或NR1R2代表哌啶基、哌嗪基甲、基哌嗪基或三元～六元脂肪环单或二取代氨基。
R3和R4相同或不同，各自独立的表示H、C1-C6直链或支链烷基；各种取代的酰基R9CO-、R9C6H4(CH2)nCO-等(n＝0～6)，其中R9为C1-C6直链或支链烷基、烷氧基；R10C6H4(CH2)nCH2-等(n＝0～5)，R10为相同或不同的C1-C6直链或支链烷基、烷氧基；通式(I)表示的氨基生物蝶呤衍生物或其药学上可接受的盐、水合物，其中较好的是R1和R2相同，为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、苄基；R1代表H时，R2为甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、异丁基、环丁基、环己基、苄基、-CH2CH2OH。
R3和R4相同或不同，各自独立的表示H、C1-C6直链或支链烷基；各种取代的酰基如R9CO-、R9C6H4(CH2)nCO-等(n＝0～6)，其中R9为C1-C6直链或支链烷基、烷氧基；R10C6H4(CH2)nCH2-等(n＝0～5)，R10为相同或不同的C1-C6直链或支链烷基、烷氧基；或者NR1R2代表哌啶基、哌嗪基、甲基哌嗪基或三元～六元脂肪环胺基。
氨基生物蝶呤衍生物I或其药学上可接受的盐、水合物，其中更为合适的是R1和R2相同，为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、苄基；R1代表H时，R2为甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、异丁基、环丁基、环己基、苄基、-CH2CH2OH；R3、R4代表H、甲酰基、乙酰基、苯甲酰基。
以上所述的烷基、烷氧基、和胺基中的烷基可以是直链的烷基，或是有侧链的烷基，或是环状烷基。在分子式中如果出现立体异构体，则本发明中的化合物包括这些全部的互变异构体和立体异构体。
由前述通式(I)表示的氨基生物蝶呤衍生物或其药学上可接受的盐、水合物在制备抑制诱导性一氧化氮合酶药物中的应用。
前述通式(I)表示的氨基生物蝶呤衍生物或其药学上可接受的盐、水合物在制备抑制诱导性一氧化氮合酶药物中的较具体的应用是制备在败血性和(或)出血性休克，或用细胞毒素进行肿瘤化学治疗，肝硬化或肝萎缩和(或)肝功能衰退时所引起的血压下降或(和)止血障碍药物。更进一步的应用，是制备预防和治疗炎症疾病药物；是制备预防和治疗异体器官和组织移植的排斥反应药物以及胰岛素依赖型糖尿病药物；是制备预防和治疗细胞毒素进行肿瘤的化学治疗、化学物质或药物以及慢性肝炎引发的多种肝损伤、肝功能衰退以及预防和治疗心肌梗塞损伤、病毒性心肌炎药物。所述的应用还包括，是制备预防和治疗病毒性神经退化、变化疾病及痛觉过敏、癫痫、偏头痛药物。
药物组合物，其中含有治疗有效量的通式(I)氨基生物蝶呤衍生物或其药学上可接受的盐或其水合物，并含有常规药用载体。
本发明所用的通式I表示的化合物可以它们的中性形式，也可以和无机酸或者有机酸加成形成相应的盐使用，对药物中所能用的酸包括有如盐酸、溴化氢、萘二磺酸(1，5)、磷酸、硝酸、硫酸、草酸、酒石酸、乳酸、水杨酸、苯甲酸、甲酸、乙酸、丙酸、戊酸、二乙基乙酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、丁二酸、庚二酸、己二酸、马来酸、苹果酸、氨基磺酸、苯丙酸、葡糖酸、抗坏血酸、异烟酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸，以及氨基酸等。通式II表示的化合物可和多摩尔的酸加成形成盐，这些多摩尔的酸可以是单一的也可以是组合的，这主要根据需要用相应的溶剂或稀释剂的情况来决定。这些盐也可以它们的水合物形式存在。这些加成的盐可通过阴离子交换而去除。
本发明所涉及的氨基生物蝶呤衍生物和它们相应的盐类可和适合辅料(包括相应的医药上准许应用的赋形剂、粘合剂、缓释剂、稳定剂、香料、调味剂和色素等)做成片剂或胶囊口服，也可做成相应的针剂用于临床。
对本发明中的通式I氨基生物蝶呤衍生物抑制iNOS活性的测定，根据已知的测定方法(参见钟慈声，孙安阳 主编一氧化氮的生物医学，上海上海医科大学出版社，1997，p.361-363，381-385)进行。
本发明通式I所表示的化合物是本发明首次合成的新化合物，均经过各种分析方法进行了结构鉴定，包括1H-NMR、MS、和元素分析。所有氨基生物蝶呤衍生物都是按照或者参照已发表的Viscontini方法进行合成(参见Schircks B，Bieri JH，Viscontoni M；Helv Chim Acta，1985，681639-1643)。
通式I化合物的合成有以下步骤(1)中间体2，5，6-三氨基-4-取代胺嘧啶(A)的合成
式中NR1R2＝N(C2H5)2；HNCH(CH3)2；N(CH2CH2)2NCH3；HN(CH2)5；HNCH(CH2)2；HNCH(CH2)5；HNCH2CH2CH2CH3；N(CH2CH2CH2CH3)2；HNCH2CH2OH；HNCH2C(CH3)3等(与权力要求1中一致)。
首先将对氯苯胺重氮化，然后和2，6-二氨基-4-氯嘧啶结合生成2，6-二氨基-4-氯-5-对氯苯偶氮嘧啶，接着用取代胺取代氯，所得的化合物用锌粉在酸性条件下还原偶氮基得化合物2，5，6-三氨基-4-取代胺嘧啶(嘧啶衍生物的合成方法参考Froehlich L，Kotsonis P，Traub H，et al，J Med Chem，1999，424108-4121。)(2)中间体2，3，4-三乙酰氧基-5-脱氧阿拉伯苯腙(B)的合成 出于简化制备操作的目的，采用了“一锅煮”的方法首先，将L-鼠李糖与乙硫醇在低温下缩合成缩硫醛，以有机酸(甲酸，乙酸等)为介质用双氧水氧化分子中的硫原子，形成二乙磺酰基L-鼠李糖，此化合物在pH＝9～10的水溶液中脱去一分子的CH2(SO2CH2CH3)2生成5-脱氧阿拉伯糖④。将5-脱氧阿拉伯糖与苯肼反应后再经过乙酰化即得(B)。
表 设计合成的氨基生物蝶呤衍生物编号和对应结构 (3)目的化合物的合成
将前面制得的中间体(A)和(B)同醋酸钠，保险粉在醇水溶液中缩合后，经用I2的醇溶液进行芳构化，得产品11，12，进一步皂化水解得产品1-10。因部分中间体易于被氧化，所以反应过程中必要的步骤需在氮气保护下进行。
具体实施例方式
1.合成中间体(A)按照文献(Froehlich L，Kotsonis P，Traub H，et al，J Med Chem，1999，424108-4121)方法制备。
中间体(B)的制备(主要参见专利EP A1 0153095和文献Schircks B，Bieri JHand Viscontoni M；Helv Chim Acta，1985，681639-1643.)L-鼠李糖二乙基缩硫醛②取L-鼠李糖一水合物40克加入到40mL 37％的浓盐酸中，0℃下快速搅拌中再加入60mL乙硫醇，约15分钟后有大量固体生成，产物略带粉色。继续搅拌15分钟后加入50mL水搅拌，过滤水洗，五氧化二磷真空干燥，得白色固体②39克，m.p183-184℃，收率66.8％。
1，1-二乙磺酰基-L-鼠李糖③取L-鼠李糖二乙基缩硫醛②2.7克(0.01mol)溶于10mL乙酸中冷却到0℃，控温在0℃以下滴加5.1克30％H2O2(0.08mol)，加毕维持温度1小时后升到室温下反应48小时。反应完毕减压蒸去乙酸和过量的双氧水，得无色或浅黄色粘稠液③，用于下一步。
5-脱氧-L-阿拉伯糖④将上一步制得的产品③溶于20mL水中，用浓氨水调pH＝9.5，于室温下搅拌24小时，有白色固体[脱下来的CH2(SO2CH2CH3)2]生成，过滤，用20mL氯仿萃取12小时，将水层减压蒸去水得黄色油状物，即产品④，产率为65％(以②计算)。
5-脱氧-L-阿拉伯糖苯腙⑤将上步制得的产品④(0.0075mol)溶于20mL甲醇中。取苯肼0.89克(0.00825mol)加入到④的甲醇液中，再加入一滴冰醋酸，氮气保护下于室温搅拌反应2小时。真空浓缩蒸干后得橙红色粘稠液。将此粘稠液用乙醚洗两次(10mL/次)得橙色固化物，将此固体物溶于50mL乙酸乙酯中，用水洗两次(50mL/次)，乙酸乙酯液用无水硫酸钠干燥后，蒸干得橙色固体⑤1.91克(含有溶剂乙酸乙酯，到此总收率按②算为45％～50％)。
2，3，4-三乙酰氧基-5-脱氧-L-阿拉伯糖苯腙(B)将上步制得的产品1.91克⑤溶于10mL吡啶中，0℃以下滴加10mL乙酸酐，加毕氮气保护下保温搅拌30分钟后，升至室温反应5小时，减压浓缩后，低温下溶于50mL甲醇中得产品(B)的甲醇溶液，备用。
2-氨基-4-二乙氨基-6-〔(1S，2R)-二羟基丙基〕蝶啶(1)的“一锅法”制备第一步缩合配制1.97克(0.024mol)NaAc，1.0克NaS2O4的40mL水溶液和1.67克(0.006mol)2，6-二氨基-4-二乙基胺基嘧啶盐酸盐，1.0克NaS2O4的60毫升水溶液，并先后加入上步制得的2，3，4-三乙酰氧基-5-脱氧-L-阿拉伯糖苯腙(按0.005mol计)甲醇液中，搅拌，在氮气保护下于35-40℃反应36小时。
第二步芳构化方法1室温下滴加I2/MeOH溶液，如淀粉碘化钾试纸检测碘过量，室温下反应3小时后，加入少量NaS2O4除去过量的碘，减压蒸干，再加入50mL甲醇溶解，滤去不溶物，减压蒸干后200～300目硅胶后柱层析(氯仿∶甲醇＝20∶1)。收集含产品部分。
方法2室温下搅拌并通入氧气24-48小时，芳构化完全后减压蒸干，再加入50mL甲醇溶解，滤去不溶物，减压蒸干后200～300目硅胶后柱层析(氯仿∶甲醇＝20∶1)。收集含产品部分。
第三步分离将芳构化所得的产品经硅胶(100～200目)柱层析(氯仿∶甲醇＝40∶1，20∶1)，得淡黄色固体，丙酮重结晶得淡黄色固体2-氨基-4-二乙基氨基-6-〔(1S，2R)-二乙酰氧基〕蝶啶(11)0.15克，总产率4.0％(按二乙磺酰基L-鼠李糖②计算)，m.p165-167℃。ESI-MS377.4[M+H]+，753.5[2M+1]+(C17H24N6O4，Mr＝376.4)；1H-NMR(Bruker AV-300，D6-DMSO)δ1.18(d，J＝6.54Hz，3H，3’-CH3)；1.19(bm，3H，N4-CH2CH3)；1.28(bm，3H，N4-CH2CH3)；1.97(s，3H，CH3-(OAc-2’))；2.28(s，3H，CH3-(OAc-1’))；3.83(bm，2H，N4-CH2CH3)；4.15～4.33(bm，2H，N4-CH2CH3)；5.33(m，1H，CH-2’)；5.96(d，J＝4.33Hz，1H，CH-1’)；8.86(s，1H，CH-7)。
Anal Calcd forC17H24N6O4·H2O(394.4)C51.77，H6.65，N21.30；FoundC52.21，H6.65，N20.75。
第四步水解方法1将含产品11部分，溶于20mL甲醇和20mL浓氨水的混合液中于50℃下反应3-5小时，反应完毕减压蒸干，用30mL水溶解，用浓盐酸调pH＝1，滤去不溶物，用稀NaOH/H2O调pH＝8减压蒸干，硅胶(200～300目)柱层析(氯仿∶甲醇＝20∶1～10∶1)。得黄色固体，用甲醇-丙酮重结晶得淡黄色粉末状产品2-氨基-4-二乙氨基-6-〔(1S，2R)-二羟基丙基〕蝶啶(1)，m.p154-156℃。
方法2将含产品11部分，溶于40mL浓氨水中于50℃下反应1-3小时，反应完毕减压蒸去氨气，滤去不溶物，处理后硅胶(200～300目)柱层析(氯仿∶甲醇＝10∶1)。得淡黄色固体，用甲醇-丙酮重结晶，得黄色固体粉末2-氨基-4-二乙氨基-6-〔(1S，2R)-二羟基丙基〕蝶啶(1)0.5克(0.00152mol)，m.p154-156℃。总收率为15.3％(按二乙磺酰基L-鼠李糖②计算)；ESI-MS293.2[M+H]+(C13H20N6O2，M＝292.2)；1H-NMR(AV-300，D6-DMSO)δ1.05(d，J＝6.31Hz，3H，CH3-3’)；1.24[t，6H，N4-(CH2CH3)2]；3.98-3.88[bm，4H，N4-(CH2CH3)2]；3.94(m，1H，CH-2’)；4.38(d，J＝5.48Hz，1H，CH-1’)；8.86(s，1H，CH-7)。Anal Calcd forC13H20N6O2·HCl(358.81)C，43.51，H，5.90 N，23.41；FoundC，43.23 H，5.71 N，22.822-氨基-4-异丙基氨基-6-〔(1S，2R)-二羟基丙基〕蝶啶(2)方法同于(1)的制备，用甲醇-丙酮重结晶，得黄色固体粉末(2)0.13克，总产率4.7％(按二乙磺酰基L-鼠李糖②计算)，m.p185-189℃；ESI-MS279.1[M+H]+，301.1[M+Na]+(C12H18N6O2，M＝278.1)；1H-NMR(Bruker AV-300，D6-DMSO)δ1.13(d，J＝6.30Hz，3H，CH3-3’)；1.25[d，J＝6.6Hz，6H，N4-CH(CH3)2]；4.43-4.35[m，2H，CH-1’，N4-CH(CH3)2]；3.94(m，1H，CH-2’)；4.39(d，1H，CH-1’)；8.68(s，1H，CH-7)。
Anal Calcd forC12H18N6O2·HCl(314.70)C，45.84 H，6.09 N，26.71；FoundC，45.33 H，6.51 N，26.532-氨基-4-(4-甲基)哌嗪胺基-6〔(1S，2R)-二羟基丙基〕蝶啶(3)方法同于(1)的制备，用甲醇-丙酮重结晶，得黄色粉末固体0.15克，产率4.7％(按二乙磺酰基L-鼠李糖②计算)，m.p189-192℃；ESI-MS320.1[M+H]+，342.2[M+Na]+(C14H21N7O2，M＝319.1)；1H-NMR(Bruker AV-300，D6-DMSO)δ1.08(d，J＝6.27Hz，3H，CH3-3’)；2.27(s，3H，NCH3)；2.54～2.49[m，4H，(-CH2)2NCH3]；3.90(bs，1H，CH-2’)；4.37(bs，1H，CH-1’)；4.30[bs，4H，N4(CH2-)2]；4.61(bs，1H，OH-2’)；5.50(bd，1H，OH-1’)；6.62(bs，2H，N2H2)；8.70(s，1H，CH-7)。
Anal Calcd forC14H21N7O2·0.5HCl·0.5CH3OH(353.62)C49.25，H6.70，N27.73；FoundC49.52，H6.70，N27.45.
2-氨基-4-吡嗪氨基-6-〔(1S，2R)-二乙酰氧基〕蝶啶(12)方法参见(11)的制备，将芳香化所得的产品经硅胶(100～200目)柱层析(氯仿∶甲醇＝40∶1～20∶1)，得淡黄色粉末固体，丙酮重结晶得产品(12_1)0.15克，产率3.9％(按二乙磺酰基L-鼠李糖②计算)，m.p170-172℃；ESI-MS389.1[M+H]+，411.1[M+Na]+(C18H24N6O4，M＝388.1)；1H-NMR(BrukerAV-300，D6-DMSO)δ1.17(d，J＝6.60Hz，3H，CH3-3’)，1.64[bm，6H，N4(CH2)2(CH2)3]；4.20[bs，4H，N4(CH2)2(CH2)3]，1.95[s，3H，CH3-(OAc-2’)]；2.12[s，3H，CH3-(OAc-1’)]；5.31[m，1H，CH-2’]；5.81[d，J＝4.5Hz，1H，CH-1’]；6.72(b，0.3H，N2H2)；8.65(s，1H，CH-7)Anal Calcd forC18H24N6O4·H2O(406.44)C，53.19 H，6.45 N，20.68；FoundC，53.46 H，6.28 N，21.212-氨基-4-吡嗪胺基-6-〔(1S，2R)-二羟基丙基〕蝶啶(4)方法同于(1)的制备，用甲醇-丙酮重结晶，得黄色粉末固体0.52克，产率16.4％(按二乙磺酰基L-鼠李糖②计算)，m.p160-161℃；
ESI-MS305.1[M+H]+，327.1[M+Na]+(C14H20N7O2，M＝304.1)；1H-NMR(BrukerAV-300，D6-DMSO)δ1.06(d，J＝6.30Hz，3H，CH3-3’)；1.68[s，6H，N4(CH2-)2(-CH2)3]；3.91(m，1H，CH-2’)；4.41(d，J＝4.50Hz，1H，CH-1’)；4.31[bs，4H，N4(CH2-)2]；4.67(bs，1H，OH-2’)；5.65(d，1H，OH-1’)；7.0-7.4(bs，2H，N2H2)；8.72(s，1H，CH-7)。Anal Calcd forC14H20N7O2·2HCl(377.46)C，44.55 H，5.87 N，22.26；FoundC，43.69 H，5.84 N，21.912-氨基-4-环己基胺基-6-〔(1S，2R)-二羟基丙基〕蝶啶(5)方法同于(1)的制备，用甲醇-丙酮重结晶，得黄色粉末固体产品0.27克，产率8.5％(按二乙磺酰基L-鼠李糖②计算)，m.p120-125℃；ESI-MS319.1[M+H]+(C15H22N6O2，M＝318.1)；1H-NMR(Bruker AV-300，D6-DMSO)δ1.14(d，J＝6.18Hz，3H，CH3-3’)；1.17-2.07[m，10H，N4-CH(-CH2-)5]；3.81(m，1H，CH-2’)；4.45(m，1H，CH-1’)；4.13(m，1H，N4-CH)；4.69(s，1H，OH-2’)；5.54(d，1H，OH-1’)；7.0-7.7(bs，2H，N2H2)；8.54(bd，1H，N4H)；8.75(s，1H，CH-7)。
Anal Calcd forC15H22N6O2·2.5HCl·0.5C2H5OH(432.56)C，44.43 H，6.39N，19.42；FoundC，44.16 H，5.62 N，19.232-氨基-4-环丙胺基-6-〔(1S，2R)-二羟基丙基〕蝶啶(6)方法同于(1)的制备，用甲醇-丙酮重结晶，得黄色粉末固体产品0.35克，产率12.7％(按二乙磺酰基L-鼠李糖②计算)，m.p198-200℃(分解)；ESI-MS277.1[M+H]+(C12H16N6O2，M＝276.1)；1H-NMR(Bruker AV-300，D6-DMSO)δ1.13(d，J＝6.22Hz，3H，CH3-3’)；0.73-0.82[m，4H，N4-CH(-CH2)2]；3.04(m，1H，N4-CH)；3.78(m，1H，CH-2’)；4.41(d，J＝6.47Hz，1H，CH-1’)；4.67(bs，1H，OH-2’)；5.43(bs，1H，OH-1’)；6.84(bs，2H，N2H2)；8.29(bs，1H，N4H)；8.71(s，1H，CH-7)。
Anal Calcd forC12H16N6O2·0.5HCl·CH3OH(326.57)C，47.81 H，6.32 N，25.73；FoundC，47.87 H，5.85 N，25.982-氨基-4-正丁基胺基-6-〔(1S，2R)-二羟基丙基〕蝶啶(7)方法同于(1)的制备，用甲醇-丙酮重结晶，得黄色粉末固体产品0.15克，产率5.1％(按二乙磺酰基L-鼠李糖②计算)，m.p178-187℃(分解)；ESI-MS293.2[M+H]+，315.2[M+Na]+(C13H20N6O2，M＝292.2)；1H-NMR(Bruker AV-500，D6-DMSO)δ1.12(d，J＝6.25Hz，3H，CH3-3’)；0.93(t，J＝7.44Hz，3H，N4-CH2CH2CH2CH3)；1.35(m，J＝7.32Hz，2H，N4-CH2CH2CH2CH3)；1.61(m，J＝7.41Hz，2H，N4-CH2CH2CH2CH3)；3.48(m，2H，N4-CH2CH2CH2CH3)；3.86(m，1H，CH-2’)；4.40(d，1H，CH-1’)；4.63(d，J＝5.39Hz，1H，OH-2’)；5.42(s，1H，OH-1’)；6.62(bs，2H，N2H2)；8.14(bs，1H，N4H)；8.70(s，1H，CH-7)。Anal Calcd forC13H20N6O2·0.5H2O(301.35)C51.77，H7.03，N27.89；FoundC51.85，H7.17，N27.30。
2-氨基-4-二正丁基胺基-6-〔(1S，2R)-二羟基丙基〕蝶啶(8)方法同于(1)的制备，用甲醇-丙酮重结晶，得黄色粉末固体产品0.31克，产率8.6％(按二乙磺酰基L-鼠李糖②计算)，m.p178-185℃(分解)；ESI-MS349.1[M+H]+，371.2[M+Na]+(C13H20N6O2M＝348.1)；1H-NMR(Bruker AV-500，D6-DMSO)δ1.07(d，J＝6.28Hz，3H，CH3-3’)；0.95[t，J＝7.37Hz，6H，N4(CH2CH2CH2CH3)2]；1.37[m，J＝7.37Hz，4H，N4(CH2CH2CH2CH3)2]；1.70[m，J＝7.37Hz，4H，N4(CH2CH2CH2CH3)2]；3.75-4.25[bm，5H，N4(CH2-)2，CH-2’]；3.86(m，1H，CH-2’)；4.43(d，J＝5.35Hz，1H，CH-1’)；4.67(bs，1H，OH-2’)；5.58(bs，1H，OH-1’)；6.83(bs，2H，N2H2)；8.72(s，1H，CH-7)；Anal Calcd forC17H28N6O2·1.75H2O(348.45)C，53.74 H，8.36 N，22.12；FoundC，54.12 H，8.36 N，21.632-氨基-4-(2-羟基乙基)胺基-6-〔(1S，2R)-二羟基丙基〕蝶啶(9)方法同于(1)的制备，用甲醇-丙酮重结晶，得黄色粉末固体产品0.23克，产率8.2％(按二乙磺酰基L-鼠李糖②计算)，m.p215-218℃(分解)。
ESI-MS281.0[M+H]+，303.1[M+Na]+(C11H16N6O3，M＝280)1H-NMR(Bruker AV-500，D6-DMSO)δ1.12(d，J＝6.24Hz，3H，CH3-3’)；3.65-3.58[m，4H，N4-CH2CH2OH]；3.89(m，1H，CH-2’)；4.47(d，1H，CH-1’)；4.72(bs，1H，OH-2’)；4.91[bs，1H，N4CH2CH2OH]；5.63(bd，1H，OH-1’)；7.25-7.75(bs，2H，N2H2)；8.81(s，1H，N4H)；8.79(s，1H，CH-7)；Anal Calcd forC11H16N6O3·HCl(316.64)C，41.69 H，5.41 N，26.54；FoundC，41.81 H，5.63 N，26.72
2-氨基-4-异丁氨基胺基-6-〔(1S，2R)-二羟基丙基〕蝶啶盐酸盐(10)方法同于(1)的制备，用甲醇-丙酮重结晶，得黄色粉末固体产品0.39克，产率12.0％(按二乙磺酰基L-鼠李糖②计算)，m.p275-280℃(分解)；ESI-MS293.2[M+H]+(C13H20N6O2，M＝292.2)；1H-NMR(Bruker AV-300，D6-DMSO)δ1.12(d，J＝6.24Hz，3H，CH3-3’)；0.93[d，6H，N4CH(CH3)2]；2.08(m，1H，N4CH2CH)；3.39-3.44(m，2H，N4CH2-)；3.92(m，1H，CH-2’)；4.54(d，J＝5.79Hz，1H，CH-1’)；4.79(bs，1H，OH-2’)；5.77(bs，1H，OH-1’)；7.89(bs，1H，N2H)；8.73(bs，1H，N2H)；8.85(s，1H，CH-7)；9.71(t，1H，N4H·HCl)；13.09(bs，1H，N4H·HCl)；Anal Calcd forC13H20N6O2·HCl·1.5H2O(355.2)C43.92，H6.81，N23.65；FoundC43.80，H6.73，N23.84。
表 设计合成目标化合物的编号和对应结构 2.诱导型一氧化氮合成酶抑制剂活性的研究
2.1样品与试剂氨基生物蝶呤衍生物本发明中合成的14个化合物，其中13个进行了iNOS的抑制活性研究，化合物121没有进行活性测试。活性测定是以水作溶剂进行的，将药品配制成DMSO溶液，按需要量取一定量的用水进行稀释，或加入到测定溶液中。
诱导型一氧化氮合成酶Rcombinnation from E.Col是Cayman Chenical公司产品。
四氢生物蝶呤(Tetrohtdro-L-biopterin)二盐酸盐，纯度＞99％，由CaymanChenical公司提供。
一氧化氮合成酶试剂盒由南京建成生物工程研究所提供提供，批号20040511。
2.2.主要仪器HH-4电热恒温水浴箱常州国华电器有限公司。
BS110S分析天平北京塞多利天平有限公司。
52紫外光栅分光光度计上海分析仪器总厂。
2.3.药物体外抑制诱导型一氧化氮百分率的测定试验方法在一氧化氮试剂盒的1号试剂中不加入四氢生物喋呤(BH4)，按试剂盒方法分别在试管中加入试剂1、试剂2、试剂3、iNOS样品、BH4、受试药物后混匀，37摄氏度水浴下准确反应20分钟，加入试剂4终止反应，再加入终止液后混匀，530nm处，1cm光径，蒸馏水调零，比色测定吸光值。
测定BH4的饱和浓度按照试剂盒方法按步骤加入试剂，各个试管中分别加入不同浓度的BH4，测定各管吸光值，并计算其饱和浓度。
3.2.4.测定氨基生物蝶呤(ABP)及13个氨基生物蝶呤衍生物的iNOS活性抑制百分率根据文献，配制药物浓度为BH4饱和浓度的48倍，同样按试剂盒的方法测定吸光值，并计算出抑制百分率。
抑制百分率＝(标准管吸光值-测定管吸光值)/(标准管吸光值-空白管吸光值)×100％3.2.5.氨基生物蝶呤衍生物IC50(半数抑制浓度)的测定根据前一次试验BH4饱和浓度测定结果，以及药物的抑制百分率达100％的药物浓度，我们推荐以下几个剂量，分别为32倍、24倍、18倍、13.5倍。实验中每个试管中加入的诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)和BH4的浓度是固定的。测得各管在530nm处的吸光度，用直线回归的方法计算出各自的半数抑制浓度。
表 氨基生物蝶呤衍生物对iNOS的抑制效果
注(1)表中iNOS活性数据测定时的抑制剂浓度均为110μmmol/L、BH4的饱和浓度2.3μM。Vmax为没有抑制剂时在的BH4饱和浓度作用下的iNOS活性(2)ND表示没有进行测定。(3)ABP为4-氨基生物蝶呤。
从活性测定结果可以看出，设计合成的化合物多数具有iNOS抑制效果，而12号和4号化合物同属类似结构，具有增加iNOS活性的作用，设计的化合物具有调节iNOS活性作用。
权利要求
1.下述通式(I)表示的化合物 R1和R2相同或不同，各自独立的表示有取代基、无取代基的C1-C6直链、支链烷基或芳基；苄基；R1、R2、R3和R4不同时为H；R1为H或甲基时，R2代表有取代基的或无取代基的三元～六元环烷基；-(CH2)nOH(n＝1～6)；-C6H4COGlu、-C6H4CH2COGlu、-C6H4COGlu、-C6H4CH2COGlu，Glu代表-NHCH(COOR5)CH2CH2COOR6，R5与R6相同或不同，各自独立地表示H、甲基或乙基等；-C6H4COOR7R8、-C6H4CH2COOR7R8，R7和R8相同或不同，各自独立地表示H、甲基、乙基等；或NR1R2代表哌啶基、哌嗪基甲、基哌嗪基或三元～六元脂肪环单或二取代氨基。R3和R4相同或不同，各自独立的表示H、C1-C6直链或支链烷基；各种取代的酰基如R9CO-、R9C6H4(CH2)nCO-等(n＝0～6)，其中R9为C1-C6直链或支链烷基、烷氧基；R10C6H4(CH2)nCH2-等(n＝0～5)，R10为相同或不同的C1-C6直链或支链烷基、烷氧基；
2.如权利要求1表示的化合物，其中R1和R2相同或不同，各自独立的表示有取代基、无取代基的C1-C6直链、支链烷基或芳基；苄基；R1、R2、R3和R4不同时为H；R1为H或甲基时，R2代表有取代基的或无取代基的三元～六元环烷基；-(CH2)nOH，n＝1～6；-C6H4COGlu、-C6H4CH2COGlu、-C6H4COGlu、-C6H4CH2COGlu，Glu代表-NHCH(COOR5)CH2CH2COOR6，R5与R6相同或不同，各自独立地表示H、甲基或乙基等；-C6H4COOR7R8、-C6H4CH2COOR7R8，R7和R8相同或不同，各自独立地表示H、甲基、乙基等；或NR1R2代表哌啶基、哌嗪基甲、基哌嗪基或三元～六元脂肪环单或二取代氨基。R3和R4相同或不同，各自独立的表示H、C1-C6直链或支链烷基；各种取代的酰基如R9CO-、R9C6H4(CH2)nCO-等，其中R9为C1-C6直链或支链烷基、烷氧基，(n＝0～6)；R10C6H4(CH2)nCH2-等，R10为相同或不同的C1-C6直链或支链烷基、烷氧基，(n＝0～5)；
3.权利要求1或2表示的化合物，其中R1和R2相同或不同，各自独立的表示有取代基、无取代基的C1-C6直链、支链烷基或芳基；R3和R4相同，表示H、C1-C6直链或支链烷基；各种取代的酰基如R5CO-、R5C6H4(CH2)nCO-(n＝0～6)等，其中R5为C1-C6直链或支链烷基、烷氧基；
4.权利要求1-3任意一项的化合物在制备诱导性一氧化氮合成酶药物中的应用。
5.权利要求1-3任意一项的化合物在制备在败血性和(或)出血性休克，或用细胞毒素进行肿瘤化学治疗和肝硬化或肝萎缩和(或)肝功能衰退时所引起的血压下降或(和)止血障碍药物中的应用。
6.权利要求1-3任意一项的化合物在制备预防和治疗炎症疾病药物中的应用。
7.权利要求1-3任意一项的化合物在制备预防和治疗异体器官和组织移植的排斥反应药物以及胰岛素依赖型糖尿病药物中的应用。
8.权利要求1-3任意一项的化合物在制备预防和治疗细胞毒素进行肿瘤的化学治疗、化学物质或药物以及慢性肝炎引发的多种肝损伤、肝功能衰退以及预防和治疗心肌梗塞损伤、病毒性心肌炎药物中的应用。
9.权利要求1-3任意一项的化合物在制备预防和治疗病毒性神经退化、变化疾病及痛觉过敏、癫痫、偏头痛药物中的应用。
10.一种药物组合物，其中含有治疗有效量的权利要求1-3任意一项的化合物并含有常规药用载体。
全文摘要
本发明设计并合成了一种具有控制体内一氧化氮自由基(简写为NO)过多产生的氨基生物蝶呤类衍生物，它具有通式(I)所述的化学结构。本发明具有选择性抑制诱导型一氧化氮合成酶的作用，可用以制备具有预防和治疗体内一氧化氮水平升高而产生的各种疾病的药物。
文档编号A61P29/00GK1583745SQ20041004487
公开日2005年2月23日 申请日期2004年5月26日 优先权日2004年5月26日
发明者姚其正, 姜力勋, 石静波, 冯明声, 郭平 申请人:中国药科大学
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