具有抑制一氧化氮合成酶作用的甲氨蝶呤衍生物的制作方法
专利名称：具有抑制一氧化氮合成酶作用的甲氨蝶呤衍生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一类新的MTX衍生物，具体说明涉及一种具有抑制一氧化氮合成酶作用的甲氨蝶呤衍生物，它可以提高临床药物MTX(甲氨蝶呤)的抗肿瘤，抗关节炎，治疗肠类疾病，用作计划生育等的活性。
背景技术：
(1)MTX生化和药理作用及其应用四氢叶酸(Tetrahydrofolates，简写为THF)衍生物在细胞中是一碳代谢的各种酶的极为重要底物，即为嘧啶，嘌呤生物合成中的甲酰基，羟甲基或甲基的供体，在DNA和RNA的合成、复制和修复等过程起着重要作用。四氢叶酸在细胞内的合成是由叶酸经二氢叶酸还原酶(Dihydrofolate reductase，DHFR)的作用而完成。叶酸和甲氨蝶呤(Methotrexate，缩写为MTX，其化学名为N-[4-[[2，4-diamino-6-pteridinylmethyl]methylamino]benzoyl]-L-glutamic acid)都属于蝶啶衍生物，结构相似，故MTX能够结合到DHFR的活性位点上，产生对DHFR的抑制作用，阻断了DNA和RNA生物合成所需的THF的形成，因此，MTX具有杀菌、抗病毒和抑制不正常、增殖较快细胞的作用，尤其在抗肿瘤方面显示了重要作用。1948年MTX被Seeger等人用化学方法合成得到，1949年用于临床治疗小儿白血病，从而正式开创了化学疗法治疗癌症的历史。由于迅速增殖的癌细胞吸收MTX的量多于一般正常细胞，MTX成为使用广泛的抗肿瘤药物，如用于治疗妊娠绒毛膜癌、绒毛膜腺瘤、囊状肿瘤、急性淋巴细胞白血病、乳腺癌、头颈部表皮样肿瘤、蕈样霉菌病、肺痨和非何杰金氏淋巴瘤等。MTX也是有效的免疫抑制剂，用于预防器官移植所引起的移植物抗宿主反应，以及控制炎症疾病，如肠炎，关节炎与类风湿性关节炎等，MTX也可用于治疗重度牛皮癣。此外，MTX还可用于治疗早期宫外孕，输卵管妊娠及抗早孕(张云山、朱楣光编译，甲氨蝶呤配伍米索前列醇早孕，国外医学计划生育分册，1998，17(1)20)。有报道，MTX作为计划生育用药，有着广泛的前途，如用于紧急避孕(朱波、蔡坚等，米非司酮合并甲氨蝶呤用于紧急避孕初步观察，广东医药，1999，20(1)11～12)等。
(2)MTX和NO的关系一氧化氮自由基(简写为NO)在生物体内作为重要的信使分子和效应分子，NO是通过内源性一氧化氮合酶(NO Synthase，简写为NOS)产生的。BH4是NOS的重要辅酶，它与NOS的稳定性有关，促进NOS达到最大催化活性，因此，BH4与其NOS的结合区可作为选择性的药理作用靶点。BH4和叶酸、MTX一样同属于蝶啶类化合物，故MTX在NOS的BH4结合区域中有与BH4竞争和NOS结合的作用，显然MTX对NOS的活性有抑制作用，现已证实MTX是NOS抑制剂(Collin-Osdoby P，Nickols GA，et al，J Cell Biochem，1995，57399)。
(3)MTX与所治疗疾病的关系事实上，MTX所能治疗的疾病都与体内的NO水平有着密切的关系。
A、NO在抗肿瘤治疗中的作用肿瘤中产生的NO具有双重作用，这依赖于NO的生成量一方面，持续合适浓度(pmol或fmol水平)的NO产生，有利于肿瘤生长；另一方面，高浓度(nmol水平)的NO主要起胞毒性作用，抑制和杀伤肿瘤细胞。因此，人为的改变NO的生成(如诱导产生)可抑制肿瘤生长，达到抗肿瘤作用(Thomsen LL，Miles DW，et al，Br J Cancer，1995，172(1)41；Jenkins DC，Charles IG，Thomson LL，Natl Acad Sci USA，1995，92(10)4392)。
目前，对NO介导的抗肿瘤作用人们达到了以下的共识(林震，国外医学泌尿系统手册2002，22(2)91；杨彦玲，中国癌症杂志，2001，11(4)371；王水良，癌变畸变突变，2000，12(1)60；Kolb JP，Leukemia，2000，141685；Ferry-Dumazer H，Mamani-Matsuda M，et al，Leukemia，2002，21(2)708)①NO介导的巨噬细胞对肿瘤细胞具有杀伤作用。②NO介导的内皮细胞对肿瘤细胞的溶解作用。③NO可以造成肿瘤细胞自由基损伤和能量代谢障碍。④NO对DNA有毒性与对蛋白质合成有障碍。⑤NO诱导细胞凋亡。另外，由于NO对肿瘤生长影响的多重性，NO还有促进肿瘤细胞生长的作用。NO对DNA的毒性作用并非特异性的针对肿瘤细胞，对正常细胞也同样起作用，因此能造成正常细胞DNA的损伤，DNA的损伤和NO代谢产生的亚硝酸盐均可导致基因突变和癌变。肿瘤细胞自身分泌的NO主要通过以下三种机理发挥作用①增强肿瘤细胞侵袭转移能力。②促进肿瘤血管生成、增加肿瘤新生血管的供血。③抑制宿主细胞抗肿瘤的防御功能。肿瘤细胞产生的NO主要来自iNOS被激活而过度表达(eNOS也同样起了促进作用)，催化机体合成大量的NO，参与机体免疫和肿瘤发生、发展过程，因而NOS的抑制剂对肿瘤能够产生防治作用。
总之，随着对NO在肿瘤免疫方面基础研究的不断深入，开发MTX-NO供体化合物和MTX-NOS特异性抑制剂，人为的改变NO的生成(抑制或诱导产生)，探讨在NO水平上MTX的抑制肿瘤生长机制，达到获得具有较高抗肿瘤作用的MTX新结构药物。
B、NO对组织移植的影响大量的实验研究结果表明NO在组织移植中扮演着双重角色，表明NO在移植反应中具有免疫调节剂的作用，故在免疫抑制剂MTX分子中组合上NO供体分子或者NOS抑制剂，或者对MTX进行结构修饰，可以改变MTX的应用范围，使其在抗组织移植排斥反应中产生更全面的效果。
C、NO与关节炎关节炎最常见的有骨关节炎和类风湿性关节炎等。研究已说明，NO参与关节疾病的发生和发展，患有骨关节炎或类风湿性关节炎病人的血液和关节滑液中的NO水平均明显增高，并且滑液中的NO水平高于血液中的NO水平。研究人员还观察到iNOS能在关节炎病人的关节膜中进行表达；据报道，骨关节炎病人的少许软骨在体外有机培养基中能自发释放大量NO2-，而NO2-是NO代谢的最终产物，释放NO2-的持续时间可达72小时。
由于NO参与关节疾患的病理生理过程，药物调节NO水平已成为治疗关节疾病的一条新途径，目前发现，临床已用于治疗骨关节疾病的一些药物，实际上也是通过这一途径发挥治疗作用的。如甲氨蝶呤(MTX)仍然认为是目前治疗风湿性关节炎的一线药物，虽然已有制药公司研制出治疗关节炎的新药，但仍缺乏长期安全性数据的支撑，相比之下，MTX应用时间已达半个世纪，其价格上也大大低于任何新药。显然，在保留MTX母核的基础上对其进行适当的修饰，以期提高其对iNOS选择性抑制活性，对治疗关节疾病具有重要意义。
D、一氧化氮与生殖①、NO与妊娠、分娩生理成功妊娠的先决条件之一是孕妇子宫平滑肌对妊娠具有良好的适应性。NO在细胞内形成通过旁分泌(paracrine)作用可迅速扩散到细胞外，作用于邻近的平滑肌细胞，激活细胞膜上的鸟苷酸环化酶，使该酶活性增加50～200倍，导致细胞内cGMP生成增多，cGMP进而激活cGMP依赖性蛋白激酶，或直接作用于细胞膜上的钙离子通道，引起钙离子外流或加速细胞内游离钙的结合，从而引起平滑肌细胞舒张和血管扩张。有研究发现，NOS的增多是平滑肌对妊娠的适应性变化，这使得妊娠期子宫保持静止。当妊娠达到足月时NO的生成减少，同时子宫对NO的反应性下降了，这样可导致子宫收缩性增加，以利于分娩的发动。
②、NO与脐血管组胺能引起脐血管的短暂轻微扩张，之后即转为强烈收缩。NOS抑制剂可阻断这种由组胺诱发的血管扩张，相反却能明显增强组胺的收缩血管反应。NO还能明显抑制高钾状态所诱发的脐血管的收缩反应。脐血管弛张可以增加氧和营养物质的输送，以利于胎儿生长。妊高症患者脐血管内皮细胞产生的NO含量明显低于正常孕妇，缺乏合成NO的能力，因此，不能对脐血管进行调节，以保证胎儿的正常血液供应，影响了胎儿的生长发育。
③、NO与胎儿生长发育NO是胎盘血流、氧和营养物质交换的关键因子，为保证胎儿在子宫内安全起重要作用。有研究表明，胎儿在子宫内生长发育迟缓是一氧化氮合成受到抑制所致。
MTX用于治疗早期宫外孕及抗早孕已取得了令人满意的效果。MTX在体内使二氢叶酸还原酶失去活性，间接抑制体内一碳单位代谢，阻碍细胞增殖。MTX又是NOS抑制剂，能抑制胎盘血管与脐血管的形成。妊娠时，滋养细胞增生活跃，MTX阻断其营养的供应，致其死亡。卵子受精后36～48h发育成8个细胞的桑椹胚，其表面细胞是滋养叶细胞，此时在MTX作用下抑制其生长、发育而被吸收，破坏了孕卵生存的条件，因而，着床前MTX即能中止妊娠；MTX能使滋养层对蜕膜的附着“不稳定”，同时可使滋养层停止产生HCG，降低黄体支持及孕酮的产生，中止正在进行的着床或已确立的妊娠，达到“晚”的紧急避孕作用。
半个世纪以来，MTX一直是一个临床上的一个重要的抗癌药物、免疫抑制剂和抗风湿性关节炎药物等，但是由于其抗癌谱较窄，又是一个非选择性胞毒剂，具有较大的毒性；再者，MTX在临床上已使用五十多年，癌细胞对MTX的耐药性已显露出来，故自从MTX应用临床后，国外一直有许多药物化学家对其进行结构改造，以降低其毒性，扩大其抗癌谱。他们试图对MTX的结构改造以达到增加其脂溶性，改变MTX衍生物的药物动力学性质，或者针对其它依赖于THF的酶，来改变修饰MTX，以获得这些酶的抑制剂(姚其正，蝶啶类药物的研究进展，彭司勋主编药物化学进展(第一卷)，北京中国医药科技出版社，2000，52-80)。
发明内容
本发明要解决的主要技术问题MTX抗癌谱较窄、具有较大的毒性且经五十多年的临床使用，癌细胞对MTX的耐药性已显露出来的问题，扩大MTX的治疗用途。
据研究表明BH4对NOS的稳定性有关、可促进NOS达到最大活性在，因此BH4与其NOS的结合区可作为理想的用于选择性的药理干预靶点。基于此思想，本发明合成具有与MTX结构相似的化合物，使其结构中保持有蝶啶与苯甲酰谷氨酸部分，在蝶啶环的4-位用多种基团进行修饰，其结构式可用通式I表示，以期这类MTX衍生物与BH4竞争，结合到NOS的BH4结合区中，达到干扰或抑制NOS的活性目的；同时也与叶酸竞争抑制癌细胞的生长，达到抗肿瘤的目的。这些MTX衍生物经用iNOS(inducibleNOS，诱导性NOS)进行生物活性测试，结果表明这类MTX衍生物具有抑制NO产生的作用，可以用作处理体内因NO升高而引发疾病的治疗药物。
四氢生物蝶呤(BH4)下述通式(I)表示本发明所述的MTX衍生物或其药学上可接受的盐或其水合物 R代表-OR4、-NHCH(COOR5)CH2CH2COOR6、-NHCH(COOR7)CH2CH2CH2NHC(＝NH)NH2、-NHCH(COOR8)CH2CH2CONH2，R4、R5、R6、R7、R8相同或不同，各自独立地代表H、C1-C5直链或支链的烷烃；R3代表氢；取代或无取代基的C1-C8直链或支链的烷基；C1-C8直链或支链的烷氧基；C3-C6的环烷基；-R9C＝CR10或-R9C≡CR10，R9表示H或C1-C8的直链或支链亚烷基；R10表示H、C1-C8的直链或支链烷基；R1和R2相同或不同，各自独立地表示C1-C8直链或支链的烷基；苄基；芳基；R1和R2不同时为H；R1为H或甲基时，R2代表三元～六元环烷基，-(CH2)nOH(n＝1～6)；-C6H4COGlu、-C6H4CH2COGlu、-C6H4COGlu、-C6H4CH2COGlu，Glu代表-NHCH(COOR11)CH2CH2COOR12，R11与R12相同或不同，各自独立地表示H、甲基或乙基；-C6H4COOR13、-C6H4CH2COOR14，R13和R14相同或不同，各自独立地表示H、甲基、乙基；或者NR1R2代表乙烯亚胺基、哌啶基、哌嗪基、甲基哌嗪基或三元～六元脂肪环单或二取代氨基；通式(I)不包括当R3为H或甲基时，R1或R2为H或甲基，NR1R2为哌啶基。
前述MTX衍生物或其药学上可接受的盐，其中较好的是R代表-NHCH(COOR5)CH2CH2COOR6、-NHCH(COOR7)CH2CH2CH2NHC(＝NH)NH2、-NHCH(COOR8)CH2CH2CONH2，R5、R6、R7、R8相同或不同，各自独立地代表H，C1-C4直链或支链的烷烃；R3代表氢；取代或无取代基的C1-C5直链或支链的烷基；C3-C6的环烷基；-R9C＝CR10或-R9C≡CR10，R9表示H或C1-C5的直链或支链亚烷基；R10表示H、C1-C5的直链或支链烷基；R1，R2相同或不同，各自独立地代表H，C1-C5直链或支链的烷烃；R1和R2相同，为乙基、正丙基、异丙基、丁基、苄基；R1代表H时，R2为乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、环己基、苄基、-CH2CH2OH；R1代表甲基时，R2为-CH2CH2OH。
或者NR1R2代表乙烯亚胺基、哌啶基、哌嗪基、甲基哌嗪基或三元～六元脂肪环单或二取代氨基；通式(I)不包括当R3为H或甲基时，R1或R2为H或甲基，NR1R2为哌啶基。
前述MTX衍生物或其药学上可接受的盐，其中更为合适的R代表-NHCH(COOR5)CH2CH2COOR6，R5、R6相同或不同，各自独立地代表H，C1-C4直链或支链的烷烃；R1和R2相同，为乙基、正丙基、异丙基、丁基、苄基；R1代表H时，R2为乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、环己基、苄基、-CH2CH2OH；R1代表甲基时，R2为-CH2CH2OH；R3代表H、甲基、乙炔基。
以上所述的烷基和胺基中的烷基可以是直链烷基，或是有侧链的烷基，或是环状烷基。在分子式中如果出现有立体异构体和互变异构体，则本发明中的化合物包括这些全部的立体异构体和互变异构体。
前述通式(I)表示的MTX衍生物或其药学上可接受的盐或其水合物在制备抑制诱导性一氧化氮合酶药物和抗肿瘤药物中的应用。
前述通式(I)表示MTX衍生物或其药学上可接受的盐或其水合物在制备抑制诱导性NOS和抗代谢药物中的应用，是制备在败血性和(或)出血性休克，或用细胞毒素进行肿瘤化学治疗和肝硬化或肝萎缩和(或)肝功能衰退时所引起的血压下降或(和)止血障碍药物。更具体的应用，是制备预防和治疗炎症疾病药物；是制备预防和治疗异体器官和组织移植的排斥反应药物，以及胰岛素依赖型糖尿病药物；是制备预防和治疗细胞毒素进行肿瘤的化学治疗、化学物质或药物以及慢性肝炎引发的多种肝损伤、肝功能衰退以及预防和治疗心肌梗塞损伤、病毒性心肌炎药物；是制备预防和治疗早孕、宫外孕的药物；是用于计划生育的药物。所述的应用，是制备预防和治疗病毒性神经退化、变化疾病及痛觉过敏、癫痫、偏头痛药物。
利用本发明制备的药物组合物，其中含有治疗有效量的通式(II)表示的MTX衍生物或其药学上可接受的盐或其水合物，并含有常规要用载体。
本发明所述的通式(I)表示的化合物可以它们的中性形式，也可以和无机酸或者有机酸加成形成相应的盐使用，对药物中所能用的酸包括有如盐酸、溴化氢、萘二磺酸(1，5)、磷酸、硝酸、硫酸、草酸、酒石酸、乳酸、水杨酸、苯甲酸、甲酸、乙酸、丙酸、戊酸、二乙基乙酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、丁二酸、庚二酸、己二酸、马来酸、苹果酸、氨基磺酸、苯丙酸、葡糖酸、抗坏血酸、异烟酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸，以及氨基酸等。通式I表示的化合物可和多摩尔的酸加成形成盐，这些多摩尔的酸可以是单一的也可是组合的，这主要根据需要用相应的溶剂或稀释剂的情况来决定。这些盐也可以它们的水合物形式存在。这些加成的盐可通过阴离子交换而去除。对于通式II中含有酸性组分的化合物，也可通过相应的无机或有机碱、或碱性氨基酸组成相应的盐或其水合物，例如对于这些盐有碱金属的盐，特别有效的是钠、钾、镁和铵盐，以及与有机胺和碱性氨基酸等组成相应的盐。
本发明所涉及的MTX衍生物和它们相应的盐类可和适合辅料(包括相应的医药上准许应用的赋形剂、粘合剂、缓释剂、稳定剂、香料、调味剂和色素等)做成片剂或胶囊口服，也可做成相应的针剂用于临床。
对本发明中的通式I型的化合物抑制iNOS活性的测定，根据已知的测定方法(参见钟慈声，孙安阳主编一氧化氮的生物医学，上海上海医科大学出版社，1997，p.361-363，381-385)。
因NO水平升高而引起的疾病和病症，主要包括病理性血压下降，例如败血症或出血性休克；用细胞毒素进行肿瘤的化学治疗、化学物质或药物以及慢性肝炎引发的多种肝损伤(即化学性，病毒性和免疫性肝损伤)，肝硬化或肝萎缩，和肝功能衰退；也包括进行性炎症，如类风湿性关节炎和溃疡性结肠炎，以及胰岛素依赖型糖尿病和器官移植排斥反应；也包括早孕、宫外孕以及意外妊娠，以上这些疾病和病症可用本发明如通式II表示的化合物进行治疗和预防。
另外，下列一些疾病也与诱导产生的NO水平升高有关，可用本发明的通式I的化合物来预防和治疗，在心血管循环方面，如心肌梗塞损伤、病毒性感染引起的心肌炎；在神经和中枢神经方面，如病毒性神经退化(变性)疾病，以及痛觉过敏、癫痫、偏头痛等。总之，过量NO产生与许多疾病有关，iNOS的激活产生过多的NO是重要的致病因素，研制iNOS选择抑制剂是十分必要的。
各种蝶啶衍生物广泛地存在生物体内，在生物体中起着多种功能，有代表性的如生物蝶呤和叶酸，它们在生物体中均以各自的四氢还原型而起作用。合成蝶啶类(抗叶酸类)iNOS的抑制剂必须满足以下的可能性(1)抑制剂应是蝶啶类衍生物和叶酸是同类物，这样才有可能适应NOS中的蝶啶结合区的结构上的需求；(2)所合成的蝶啶衍生物可以是非还原型的蝶啶衍生物，并且在蝶啶的4-位和6-位有较多的修饰取代基的变化，其作用与(1)一致，以竞争和NOS结合，使NOS结构和电性变化而失活。根据上两点，一般通式为I的MTX衍生物，是在其4-位上用取代氨基代替原有的氨基，故能成为iNOS抑制剂。
本发明通式I所表示的化合物为本次发明新合成的化合物，新合成的化合物均经过各种物理方法进行了结构鉴定，包括1H-NMR、MS、和元素分析。化合物都是按照或者参照已发表的方法进行合成。
通式I化合物的合成有以下步骤1、2-氨基-4-取代胺基-6-溴甲基蝶啶(A)的合成
式中NR1R2＝N(CH2CH3)2；HNCH(CH3)2；NHCH(CH2)2；NH(CH2)3CH3；N(CH2CH2CH3)2；N(CH2CH2CH2CH3)2；N(CH3)CH2CH2OH；NHCH(CH2)5等。
首先将对氯苯胺重氮化，然后和2，6-二氨基-4-氯嘧啶结合生成2，6-二氨基-4-氯-5-对氯苯偶氮嘧啶，接着用取代胺取代氯，所得的化合物用锌粉在酸性条件下还原偶氮基，得化合物2，5，6-三氨基-4-取代胺嘧啶(嘧啶衍生物的合成方法参考Froehlich L，KotsonisP，Traub H，et al，J Med Chem，1999，424108-4121)。然后再和3-溴-2-氧丙醛肟环合得化合物(A)。
2、3-溴-2-氧丙醛肟(B)的合成 双烯酮先在四氯化碳溶液中与溴加成开环，然后在活泼亚甲基上发生亚硝酸反应，经脱二氧化碳，重排，得化合物(B)。
3、对甲氨基苯甲酰-L-谷氨酸二钠盐(C)和对氨基苯甲酰-L-谷氨酸(D)的合成
4、目的化合物的合成4.1.化合物1-8的合成 4.2.化合物9-16的合成 在4.1和4.2中，将2-氨基-4-取代胺基-6-溴甲基蝶啶(A)分别与对氨基取代苯甲酰-L-谷氨酸C、D于酸水溶液中反应，可以得到4-位氨基取代的MTX衍生物。
本发明抗癌谱较宽、毒性改善，治疗用途较MTX有所扩大。
具体实施例方式
1.仪器与试剂本实验的各化合物熔点用Mel-TEMP熔点仪测定，温度未经校正。MS用HP1100LC/MSD质谱仪测定。薄层层析(TLC)板用硅胶GF254(青岛海洋化工厂生产)与浓度为0.8％的CMC-Na蒸馏水溶液搅拌均匀后铺成，然后再经100-110℃活化1h，置入干燥器内保存备用，于紫外灯下(波长254nm和365nm)显色；柱层析采用100-200或200-300目硅胶(青岛海洋化工厂生产)，干法装柱。H-NMR谱用BruckAV-300型核磁共振仪测定，不特别说明，所用溶剂为D6-DMSO。元素分析用Elementar Vario ELIII仪器测定。试剂均为市售化学纯或分析纯产品，除特别说明外，不经处理直接使用2.化合物的制备N-[4-[[2-氨基-4-(N-环丙基)氨基-6-蝶啶甲基]氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸(1)将0.4g(1.36mmol)化合物A(式中NR1R2＝NH-环丙基)和0.72g(2.71mmol)对氨基苯甲酰-L-谷氨酸(D)悬浮于30mL水中，加入5mL40％氢溴酸使溶解，然后滴入2mol/L NaOH溶液调节pH至1～2，于60～65℃搅拌反应3h，在反应过程中有黄色固体析出。冷冻过夜后过滤，水洗，乙醇洗，乙醚洗，真空干燥，得粗品黄色粉末0.51g。将上述粗品和0.2g氧化镁少许水润湿后研细移入反应瓶中，加入15mL水，于内温55～60℃搅拌45分钟后(尚有少许沉淀不溶解)，加活性炭脱色，过滤，滤液用稀氢溴酸酸化至pH2，析出黄色絮状固体，冷冻过夜，滤取固体，水洗，乙醇洗，乙醚洗，真空干燥，得0.41g黄色粉末(1)，收率63.0％。m.p.＞200℃(dec.)；ESI-MS481.2[M+H]+，503.2[M+Na]+；1H-NMR(AV-300，D6-DMSO)δ0.87(m，4H，Cyclopropyl-CH2CH2)，1.89～2.06(m，2H，Glu-CH2.)，2.32(m，2H，Glu-CH2)，3.13～3.21(m，1H，Cyclopropyl-CH)，4.31～4.36(m，1H，Glu-*CH)，4.56(s，2H，9-CH2)，6.71(d，J＝8.5Hz，2H，Ph-CH)，6.91～7.45(bs，2H，NH2)，7.69(d，J＝8.5Hz，2H，Ph-CH)，7.95(d，1H，Cyclopropyl-NH)，8.17(s，1H，CONH)，8.75(s，1H，7-CH)，9.18(bs，1H，10-NH)；Anal.Calcd forC22H24N8O5·1.5H2O·0.5HBr(Mr＝548.01)C48.22，H5.06，N20.45；FoundC48.40，H5.27，N20.48。
N-[4-[[2-氨基-4-(N-异丙基)氨基-6-蝶啶甲基]氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸(2)方法同(1)的合成。将0.4g(1.35mmol)A(式中NR1R2＝NHCH(CH3)2)和0.72g(2.7mmol)对氨基苯甲酰-L-谷氨酸(D)悬浮于30mL水中，加入5mL 40％氢溴酸使溶解，然后滴入2mol/LNaOH溶液调节pH至1.7，于60～65℃搅拌反应3h。后经处理得0.32g黄色粉末(2)，收率49.3％。mp＞200℃(dec.)。ESI-MS483.3[M+H]+，505.2[M+Na]+；1H-NMR(AV-300 D6-DMSO)δ1.30(d，6H，2×CH3)，2.03～2.07(m，2H，Glu-CH2)，2.30(t，2H，Glu-CH2COOH)，4.34(m，1H，Glu-*CH)，4.48～4.59(m，3H，i-Propyl-CH and 9-CH2)，6.76(d，J＝8.5Hz，2H，Ph-CH)，6.90～7.40(m，2H，NH2)，7.69(d，J＝8.5Hz，2H，Ph-CH)，7.90(bs，1H，i-Propyl-NH)，8.15(d，1H，NHCO)，8.74(s，1H，7-CH)，8.87(d，1H，10-NH)，12.25(bs，2H，2-COOH)；Anal.Calcd forC22H26N8O5·0.25C2H6O·0.75HBr(Mr＝554.78)C，48.71 H，5.13 N，20.20；FoundC，48.94H，5.29 N，19.96。
N-[4-[[2-氨基-4-(N-正丁基)氨基-6-蝶啶甲基]氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸(3)方法同(1)的合成。将0.4g(1.29mmol)A(式中NR1R2＝NHCH2CH2CH2CH3)和0.68g(2.56mmol)对氨基苯甲酰-L-谷氨酸(D)悬浮于30mL水中，加入5mL40％氢溴酸使溶解，然后滴入2mol/LNaOH溶液调节pH至1.7，于60～65℃搅拌反应3h。后经处理得0.3g黄色粉末(3)，收率47.0％。mp169～171℃。ESI-MS495.1[M-H]-；1H-NMR(AV-300 D6-DMSO)δ0.92(t，3H，n-Bu-CH3)，1.35(m，2H，n-Bu-CH2CH3)，1.64(m，2H，n-Bu-CH2Et)，1.86～2.08(m，2H，Glu-CH2)，2.32(t，2H，Glu-CH2COOH)，3.53(t，2H，n-Bu-CH2C3H7).4.33(m，1H，Glu-*CH)，4.54(s，2H，9-CH2)，6.71(d，J＝8.5Hz，2H，Ph-CH)，6.88～7.25(m，2H，NH2)，7.69(d，J＝8.5Hz，2H，Ph-CH) 8.16(d，1H，NHCO)，8.72(s，1H，7-CH)，8.92(bs，1H，n-Bu-NH)；Anal Calcd for C23H28N8O5·H2O·0.5HBr(Mr＝555.05)C，49.77H，5.54 N，20.19；FoundC，49.68 H，5.91 N，20.19。
N-[4-[[2-氨基-4-[N-甲基，N-(2-羟基乙基)氨基-6-蝶啶甲基]氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸(4)方法同(1)的合成。将0.4g(1.28mmol)A(式中NR1R2＝(CH3)CH2CH2OH)和0.68g(2.56mmol)对氨基苯甲酰-L-谷氨酸(D)悬浮于30mL水中，加入5mL40％氢溴酸使溶解，然后滴入2mol/L NaOH溶液调节pH至1.7，于60～65℃搅拌反应3h。后经处理得0.29g黄褐色粉末(4)，收率45.6％。mp＞196℃(dec.)。ESI-MS497.2[M-H]-；1H-NMR(AV-300 D6-DMSO)δ1.90～2.02(m，2H，Glu-CH2)，2.26～2.33(m，2H，Glu-CH2COOH)，3.70(t，2H，CH2OH)，4.10(m，5H，CH3NCH2)，4.29～4.37(m，1H，Glu-*CH)，4.47(s，2H，9-CH2)，6.53～6.83(m，5H，Ph-CH and 10-NH and NH2)，7.65(d，J＝8.5Hz，2H，Ph-CH)，8.38(d，1H，NHCO)，8.63(s，1H，7-CH)；Anal Calcd for C22H26N8O6H2O·0.5NH3(Mr＝525.03)C，50.33 H，5.66 N，22.68；FoundC，50.21 H，5.62N，22.69。
N-[4-[[2-氨基-4-(N-环己基)氨基-6-蝶啶甲基]氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸(5)方法同(1)的合成。将0.4g(1.19mmol)A(式中NR1R2＝NH-环己基)和0.63g(2.37mmol)对氨基苯甲酰-L-谷氨酸(D)悬浮于30mL水中，加入5mL 40％氢溴酸使溶解，然后滴入2mol/L NaOH溶液调节pH至1.7，于60～65℃搅拌反应3h。后经处理得0.28g黄色粉末(5)，收率45.2％。mp190～1 92℃。ESI-MS521.2[M-H]-；1H-NMR(AV-300 D6-DMSO)δ1.30～2.04(m，12H，Cyclohexyl-2’，3’，4’，5’，6’-CH2and Glu-CH2)，2.33(t，2H，Glu-CH2COOH)，4.06(m，1H，Cyclo-hexyl-CH)，4.34(m，1H，Glu-*CH)，4.51(s，2H，9-CH2)，6.68～6.87(m，5H，Ph-CH and 10-NH and NH2)，7.70(m，3H，Ph-CH andCyclohexyl-NH)，8.13(d，1H，NHCO)，8.68(s，1H，7-CH)；Anal Calcd forC25H30N8O5·H2O·0.5C2H6O·0.5HBr(Mr＝604.07)C，51.70 H，5.92 N，18.54；FoundC，51.79H，6.14 N，18.34。
N-[4-[[2-氨基-4-(N，N-二乙基)氨基-6-蝶啶甲基]氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸(6)
方法同(1)的合成。将0.5g(1.61mmol)A(式中NR1R2＝N(CH2CH3)2)和0.86g(3.22mmol)对氨基苯甲酰-L-谷氨酸(D)悬浮于40mL水中，加入7mL40％氢溴酸使溶解，然后滴入2mol/L NaOH溶液调节pH至1.7，于60～65℃搅拌反应3h。后经处理得0.45g黄色粉末(6)，收率56.4％。mp186～188℃。ESI-MS495.2[M-H]-；1H-NMR(AV-300 D6-DMSO)δ1.13(t，6H，2×CH3)，1.82～1.95(bm，2H，Glu-CH2)，2.23(t，2H，Glu-CH2COOH)，3.82(bs，4H，2×-CH2-)，4.23(m，1H，Glu-*CH)，4.42(s，2H，9-CH2)，6.52(d，2H，Ph-CH)，6.45(d，2H，NH2)，7.69(m，3H，Ph-CH and NHCO)，8.58(s，1H，7-CH)；Anal Calcd for C23H28N8O5·2H2O(Mr＝532.55)C，51.87 H，6.06N，21.04；FoundC，52.27 H，6.21 N，20.80。
N-[4-[[2-氨基-4-(N，N-二正丁基)氨基-6-蝶啶甲基]氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸(7)方法同(1)的合成。将0.5g(1.36mmol)A(式中NR1R2＝(CH2CH2CH2CH3)2)和0.73g(2.72mmol)对氨基苯甲酰-L-谷氨酸(D)悬浮于40mL水中，加入7mL 40％氢溴酸使溶解，然后滴入2mol/LNaOH溶液调节pH至1.7，于60～65℃搅拌反应3h。后经处理得0.35g黄色粉末(7)，收率46.5％。mp162～164℃。ESI-MS553.3[M+H]+，575.2[M+Na]+；1H-NMR(AV-300 D6-DMSO)δ0.81(t，6H，2×n-Bu-CH3)，1.23(m，4H，2×n-Bu-CH2CH3)，1.56(m，4H，2×n-Bu-CH2Et)，1.84～2.01(m，2H，Glu-CH2)，6.55(d，J＝8.5Hz，2H，Ph-CH)，6.70～7.00(m，3H，NH2and 10-NH)，7.54(d，J＝8.5Hz，2H，Ph-CH)，8.03(d，1H，NHCO)，8.59(s，1H，7-CH)；Anal Calcd for C27H36N8O5·1.5H2O(Mr＝579.66)C，55.95 H，6.78 N，19.33；FoundC，55.95 H，6.75 N，19.60。
N-[4-[[2-氨基-4-(N，N-二正丙基)氨基-6-蝶啶甲基]氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸(8)方法同(1)的合成。将0.5g(1.47mmol)A(式中NR1R2＝(CH2CH2CH3)2)和0.78g(2.95mmol)对氨基苯甲酰-L-谷氨酸(D)悬浮于40mL水中，加入7mL40％氢溴酸使溶解，然后滴入2mol/L NaOH溶液调节pH至1.7，于60～65℃搅拌反应3h。后经处理得0.45g黄色粉末(8)，收率58.4％。mp160～162℃。ESI-MS525.3[M+H]+，547.2[M+Na]+；1H-NMR(AV-300 D6-DMSO)δ0.80～0.94(m，6H，2×n-Pr-CH3)，1.60～1.7(m，4H，2×n-Pr-CH2Me)，1.69～1.72(m，2H，Glu-CH2)，2.29(m，2H，Glu-CH2)，3.81(bs，4H，CH2NCH2)，4.34(m，1H，Glu-CH)，4.46～4.96(m，2H，CH2)，6.86～6.90(m，4H，Ph-CH，NH2)，7.66(d，J＝8.5Hz，2H，Ph-CH)，8.13(d，1H，NHCO)，8.58(d，1H，7-CH)，12.36(bs，2H，2×COOH)；Anal Calcd for C25H32N8O5·0.5NH3·0.5H2O(Mr＝542.11)C，55.39 H，6.41 N，21.96；FoundC，55.50 H，6.38 N，21.6
N-[4-[[2-氨基-4-(N，N-二乙基)氨基-6-蝶啶甲基]甲胺基]苯甲酰基]-L-谷氨酸(9)将0.5g(1.6mmol)A(式中NR1R2＝N(CH2CH3)2)和1.04g(32mmol)对甲氨基苯甲酰-L-谷氨酸二钠盐(C)悬浮于40mL水中，加入7mL40％氢溴酸使溶解，然后滴入2mol/LNaOH溶液调节pH至1.7，于60～65℃搅拌反应3h，冷至20℃后迅速倾入10mL2mol/LNaOH溶液中，开始析出的沉淀完全溶解，以稀氢溴酸调节pH4～4.5，析出黄色固体，冷却放置过夜。次日过滤水洗，乙醇洗，乙醚洗，真空干燥，得粗品黄色粉末0.63g。将上述粗品和0.3g氧化镁少许水润湿后研细移入反应瓶中，加入15mL水，于内温55～60℃搅拌45分钟后(尚有少许沉淀不溶解)，加活性炭脱色，过滤，滤液用稀氢溴酸酸化至pH2，析出黄色絮状固体，冷冻过夜，滤取固体，水洗，乙醇洗，乙醚洗，真空干燥，得0.45g黄色粉末(9)，收率54.9％。mp162～164℃。ESI-MS511.2[M+H]+；1H-NMR(AV-300 D6-DMSO)δ1.11(t，6H，2×CH3)，1.89～2.05(m，2H，Glu-CH2)，2.31(t，2H，Glu-CH2COOH)，3.13(s，3H，N10-CH3)，3.83(bs，4H，2×CH2)，4.30～4.35(m，1H，Glu-*CH)，4.79(s，2H，9-CH2)，6.52(m，2H，NH2)，6.76(d，J＝8.5Hz，2H，Ph-CH)，7.69(m，3H，Ph-CH and NHCO)，8.59(s，1H，7-CH)；Anal Calcd for C24H30N8O5·1.25H2O(Mr＝533.07)C，54.08 H，6.14 N，21.02；FoundC，54.27 H，6.45 N，21.00。
N-[4-[[2-氨基-4-(N-环丙基)氨基-6-蝶啶甲基]甲胺基]苯甲酰基]-L-谷氨酸(10)方法同(9)的合成。将0.4g(1.36mmol)A(式中NR1R2＝NH-环丙基)和0.88g(2.72mmol)对甲氨基苯甲酰-L-谷氨酸二钠盐(C)悬浮于30mL水中，加入5mL 40％氢溴酸使溶解，然后滴入2mol/LNaOH溶液调节pH至1.7，于60～65℃搅拌反应3h。后经处理得0.36g黄色粉末(10)，收率53.7％。mp187～189℃。ESI-MS495.1[M+H]+，517.3[M+Na]+；1H-NMR(AV-300 D6-DMSO)δ0.74～0.77(m，4H，2CH2-cyclopropyl)，1.91～2.07(m，2H，Glu-CH2)，2.32(t，2H，Glu-CH2COOH)，3.01～3.05(m，1H，Cyclopropyl-CH)，3.18(s，3H，N10-CH3)，4.33～4.37(m，1H，Glu-*CH)，4.78(s，2H，9-CH2)，6.81(m，4H，Ph-CHand NH2)，7.73(d，J＝8.5Hz，2H，Ph-CH)，7.94(d，1H，NH-C3H5)，8.18(s，1H，CONH)，8.49(s，1H，7-CH)，1.38(bs，2H，2×COOH)；Anal Calcd for C23H26N8O5·1.5H2O·0.5HBr(Mr＝548.01)C，48.22 H，5.06 N，20.45；FoundC，48.40 H，5.27 N，20.48。
N-[4-[[2-氨基-4-(N-异丙基)氨基-6-蝶啶甲基]甲胺基]苯甲酰基]-L-谷氨酸(11)方法同(9)的合成。将0.5g(1.68mmol)A(式中NR1R2＝NHCH(CH3)2)和1.09g(3.36mmol)对甲氨基苯甲酰-L-谷氨酸二钠盐(C)悬浮于40mL水中，加入7mL40％氢溴酸使溶解，然后滴入2mol/L NaOH溶液调节pH至1.7，于60～65℃搅拌反应3h。后经处理得0.35g黄色粉末(11)，收率41.9％。mp178～180℃。ESI-MS495.2[M-H]-；1H-NMR(AV-300 D6-DMSO)δ1.22(d，6H，2CH3)，1.26～2.07(m，2H，Glu-CH2)，2.31(t，2H，Glu-CH2COOH)，3.16(s，3H，N10-CH3)，4.34(m，2H，Glu-*CH and i-Pr-CH)，4.80(s，2H，9-CH2)，6.70(bs，2H，NH2)，6.82(d，J＝8.5Hz，2H，Ph-CH)，7.47(d，1H，i-Pr-NH)，7.73(d，J＝8.5Hz，2H，Ph-CH)，8.18(d，1H，NHCO)，8.74(s，1H，7-CH)，12.25(bs，2H，2×COOH)；Anal Calcd for C23H28N8O5·H2O·0.5C2H6O·0.5HBr(Mr＝578.03)C，49.87 H，5.84N，19.38；FoundC，49.68 H，6.13 N，18.89，N-[4-[[2-氨基-4-(N-正丁基)氨基-6-蝶啶甲基]甲胺基]苯甲酰基]-L-谷氨酸(12)方法同(9)的合成。将0.5g(1.6mmol)A(式中NR1R2＝NHCH2CH2CH2CH3)和1.04g(3.2mmol)对甲氨基苯甲酰-L-谷氨酸二钠盐(C)悬浮于40mL水中，加入7mL40％氢溴酸使溶解，然后滴入2mol/LNaOH溶液调节pH至1.7，于60～65℃搅拌反应3h。后经处理得0.37g黄色粉末(12)，收率45.1％。mp158～160℃。ESI-MS509.2[M-H]-；1H-NMR(AV-300 D6-DMSO)δ0.90(t，3H，n-Bu-CH3)，1.31(m，2H，n-Bu-CH2CH3)，1.56(m，2H，n-Bu-CH2Et)，1.91～2.06(m，2H，Glu-CH2)，2.31(t，2H，Glu-CH2COOH)，3.18(s，3H，N10-CH3)，3.46(t，2H，n-Bu-CH2C3H7)，4.33(m，1H，Glu-*CH)，4.78(s，2H，9-CH2)，6.71(m，2H，NH2)，6.81(d，J＝8.5Hz，2H，Ph-CH)，7.72(d，J＝8.5Hz，2H，Ph-CH)，7.95(m，1H，n-Bu-NH)，8.18(d，1H，NHCO)，8.52(s，1H，7-CH)；Anal Calcd for C24H30N8O5·H2O(Mr＝528.57)C，54.54 H，6.10 N，21.20；FoundC，54.84 H，6.47 N，21.19.
N-[4-[[2-氨基-4-(N-环己基)氨基-6-蝶啶甲基]甲胺基]苯甲酰基]-L-谷氨酸(13)方法同(9)的合成。将0.5g(1.48mmol)A(式中NR1R2＝NH-环己基)和0.96g(2.97mmol)对甲氨基苯甲酰-L-谷氨酸二钠盐(C)悬浮于40mL水中，加入7mL40％氢溴酸使溶解，然后滴入2mol/L NaOH溶液调节pH至1.7，于60～65℃搅拌反应3h。后经处理得0.33g黄色粉末(13)，收率41.5％。mp176～178℃。ESI-MS535.3[M-H]-；1H-NMR(AV-300 D6-DMSO)δ1.25～2.04(m，12H，Cyclohexyl-2’，3’，4’，5’，6’-CH2andGlu-CH2)，2.32(t，2H，Glu-CH2COOH)，3.16(s，3H，CH3)，4.03(m，1H，Cyclohexyl-CH)，4.35(m，1H，Glu-*CH)，4.82(s，2H，9-CH2)，6.52～6.82(m，2H，NH2)，6.85(d，J＝8.5Hz，2H，Ph-CH)，7.61～7.69(m，3H，Ph-CH and Cyclohexyl-NH)，8.20(d，1H，NHCO)，8.52(s，1H，7-CH)；Anal Calcd for C26H32N8O5·C2H6O·0.25HBr(Mr＝602.89)C，55.78 H，6.39N，18.59；FoundC，55.45 H，6.30 N，18.66。
N-[4-[[2-氨基4-[N-甲基，N-(2-羟基乙基)氨基-6-蝶啶甲基]甲胺基]苯甲酰基]-L-谷氨酸(14)方法同(9)的合成。将0.4g(1.28mmol)A(式中NR1R2＝N(CH3)CH2CH2OH)和0.83g(2.56mmol)对甲氨基苯甲酰-L-谷氨酸二钠盐(C)悬浮于30mL水中，加入5mL40％氢溴酸使溶解，然后滴入2mol/LNaOH溶液调节pH至1.7，于60～65℃搅拌反应3h。后经处理得0.3g黄褐色粉末(14)，收率45.8％。mp＞180℃(dec.)。ESI-MS511.3[M-H]-；1H-NMR(AV-300 D6-DMSO)δ1.89～2.10(m，2H，Glu-CH2)，2.34(m，2H，Glu-CH2COOH)，3.16(s，3H，10N-CH3)，3.36(t，2H，CH2OH)，3.62～3.87(m，5H，CH3NCH2)，4.35(m，1H，Glu-*CH)，4.71(s，1H，OH)，4.83(s，2H，9-CH2)，6.59～6.78(m，4H，Ph-CH and and NH2)，7.71(d，J＝8.5Hz，2H，Ph-CH)，8.21(d，1H，NHCO)，8.61(s，1H，7-CH)；Anal Calcd for C23H28N8O6·H2O(Mr＝530.58)C，52.07H，5.71 N，21.12；FoundC，52.37 H，5.72 N，21.11，N-[4-[[2-氨基-4-(N，N-二正丁基)氨基-6-蝶啶甲基]甲胺基]苯甲酰基]-L-谷氨酸(15)方法同(9)的合成。将0.6g(1.63mmol)A(式中NR1R2＝N(CH2CH2CH2CH3)2)和1.06g(3.27mmol)对甲氨基苯甲酰-L-谷氨酸二钠盐(C)悬浮于30mL水中，加入5mL 40％氢溴酸使溶解，然后滴入2mol/L NaOH溶液调节pH至1.7，于60～65℃搅拌反应3h。后经处理得0.37g黄褐色粉末(15)，收率40.0％。mp148～150℃。ESI-MS567.3[M+H]+，589.3[M+Na]+；1H-NMR(AV-300 D6-DMSO)δ0.88(t，6H，2×n-Bu-CH3)，1.25～1.3(m，4H，2×n-Bu-CH2CH3)，1.55～1.65(m，4H，2×n-Bu-CH2Et)，2.05(m，2H，Glu-CH2)，2.32(t，2H，Glu-CH2COOH)，3.16(s，3H，10N-CH3)，3.89(m，4H，2×n-Bu-CH2)，4.33～4.38(m，1H，Glu-*CH)，4.76(s，2H，9-CH2)，6.55(m，2H，NH2)，6.78(d，J＝8.5Hz，2H，Ph-CH)，7.72(m，J＝8.5Hz，2H，Ph-CH)，8.54(s，1H，7-CH)；Anal Calcd forC28H38N8O5·0.5CH4O·0.5H2O(Mr＝591.68)C，57.85 H，6.98 N，18.94；FoundC，58.06H，6.98 N，18.80。
N-[4-[[2-氨基-4-(N，N-二正丙基)氨基-6-蝶啶甲基]甲胺基]苯甲酰基]-L-谷氨酸(16)方法同(9)的合成。将0.5g(1.47mmol)A(式中NR1R2＝N(CH2CH2CH3)2)和0..92g(2.95mmol)对甲氨基苯甲酰-L-谷氨酸二钠盐(C)悬浮于40mL水中，加入7mL40％氢溴酸使溶解，然后滴入2mol/LNaOH溶液调节pH至1.7，于60～65℃搅拌反应3h。后经处理得0.47g黄色粉未(16)，收率59.4％。mp138～140℃。ESI-MS529.2[M+H]+，561.3[M+Na]+；1H-NMR(AV-300 D6-DMSO)δ0.88(t，6H，2×n-Pr-CH3)，1.67(q，4H，2×n-Pr-CH2Me)，1.92～2.06(m，2H ，Glu-CH2)，2.51(t，2H，Glu-CH2)，3.17(s，1H，CH3)，3.85(bs，4H，CH2NCH2)，4.34(m，1H，Glu-CH)，4.76(s，2H，CH2)，6.55(m，2H，NH2)，6.78(d，J＝8.5Hz，2H，Ph-CH)，7.71(d，J＝8.5Hz，2H，Ph-CH)，8.19(d，1H，NHCO)，8.63(s，1H，7-CH)，12.4(bs，2H，2×COOH)；Anal Calcd for C26H34N8O5·1.25H2O(Mr＝561.13)C，55.65 H，6.56 N，19.97；FoundC，55.94 H，6.71 N，19.48。
3、活性测定MTX衍生物抑制诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的抑制百分率和相应的IC50测定a、所用仪器HH-4型数显恒温水浴锅常州国华电器有限公司BS110S分析天平北京赛多利天平有限公司752紫外光栅分光光度计上海分析仪器总厂b、测定原理与基本方法利用诱导型一氧化氮合酶催化NO生成时必需辅助因子四氢生物蝶呤(BH4)的原理，在体外固定了反应中iNOS和BH4的浓度，加入不同的药物(MTX衍生物)，测定一氧化氮(NO)的生成量，算出抑制百分率。用同样的方法测定不同药物浓度对反应的抑制率，用回归方法计算出IC50。
c.试剂与样品合成的通式I部分MTX衍生物，以及由浙江台州康多利药业公司提供的MTX(1)和AMT(氨基蝶呤，2)计18个，临用前按BH4摩尔浓度的48倍用二甲亚砜溶解备用。
诱导型一氧化氮合酶Inducible Nitric Oxide Synthase；Recombinant enzymeexpressed in E.Coli，由Cayman chemical公司提供。
四氧生物蝶呤二盐酸盐，MW＝314.2，纯度＞99％ 由Cayman chemical公司提供。
一氧化氮合酶试剂盒 由南京建成生物工研究所提供，批号20040511，d.药物体外抑制诱导型一氧化氮合酶百分率的测定(参见钟慈声，孙安阳主编一氧化氮的生物医学，上海上海医科大学出版社，1997，p.28-30，361-363，381-385)。
在一氧化氮合酶试剂盒的1号试剂中不加入四氢生物蝶呤(BH4)，按试剂盒方法分别在其它试管中加入试剂1、试剂2、试剂3、iNOS样品、BH4、受试药物后混匀，37℃水浴准确反应20分钟，加入试剂4终止反应，再加入终止液后混匀，530nm处，1cm光径，蒸馏水调零，比色测定吸光值。
测定BH4的饱和浓度按照试剂盒方法按步骤加入试剂，各试管中分别加入不同浓度的BH4，测定各试管吸光值，并计算其饱和浓度。
测定化合物的抑制百分率根据文献，配置药物浓度为BH4饱和浓度的48倍，同样按试剂盒方法测定吸光值，并计算出抑制百分率。
抑制百分率＝(标准管吸光值-测定管吸光值)/(标准管吸光值-空白管吸光值)×100％MTX衍生物半数抑制浓度(ID50)的测定根据前一次实验BH4饱和浓度测定结果，以及药物的抑制百分率达100％的药物浓度，向下推几个药物剂量，分别为32倍、24倍、18倍、13.5倍(剂量比为1∶0.75)。实验中每个试管中加入的诱导型一氧化氮(iNOS)和BH4的浓度是固定的。测定各管在530nm处的吸光度，用直线回归的方法计算出各自的半数抑制浓度。
所测定的18个MTX衍生物的分子结构与它们对iNOS的抑制率、ID50列于下表1。
表1 MTX衍生物对iNOS的抑制活性
注(1)表中化合物1-18的结构如下图，图中R1、R2、R3见表头； (2)化合物1为甲氨蝶呤(MTX)，化合物2为氨基蝶呤(AMT)。
表1结果表明，仅有4个通式II MTX衍生物对iNOS没有抑制作用，绝大多数通式II MTX衍生物对iNOS有抑制效果，其中有4个化合物在一定浓度下可完全抑制iNOS的活性。
权利要求
1.下述通式(I)表示的化合物 其中R代表-OR4、-NHCH(COOR5)CH2CH2COOR6、-NHCH(COOR7)CH2CH2CH2NHC(＝NH)NH2、-NHCH(COOR8)CH2CH2CONH2，R4、R5、R6、R7、R8相同或不同，各自独立地代表H、C1-C5直链或支链的烷烃；R1和R2相同或不同，各自独立地表示C1-C8直链或支链的烷基；苄基；芳基；R1和R2不同时为H；R1为H或甲基时，R2代表三元～六元环烷基，-(CH2)nOH(n＝1～6)；-C6H4COGlu、-C6H4CH2COGlu、-C6H4COGlu、-C6H4CH2COGlu，Glu代表-NHCH(COOR9)CH2CH2COOR10，R9与R10相同或不同，各自独立地表示H、甲基或乙基；-C6H4COOR11、-C6H4CH2COOR12，R11和R12相同或不同，各自独立地表示H、甲基、乙基；或者NR1R2代表乙烯亚胺基、哌啶基、哌嗪基、甲基哌嗪基或三元～六元脂肪环单或二取代氨基；R3代表氢；取代或无取代基的C1-C8直链或支链的烷基；C1-C8直链或支链的烷氧基；C3-C6的环烷基；-R13C＝CR14或-R13C≡CR14，R13表示H或C1-C8的直链或支链亚烷基；R14表示H、C1-C8的直链或支链烷基；通式(I)不包括当R3为H或甲基时，R1或R2为H或甲基，NR1R2为哌啶基。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中R代表-NHCH(COOR4)CH2CH2COOR5、-NHCH(COOR6)CH2CH2CH2NHC(＝NH)NH2、-NHCH(COOR7)CH2CH2CONH2，R4、R5、R6、R7相同或不同，各自独立地代表H，C1-C4直链或支链的烷烃；R1，R2相同或不同，各自独立地代表H，C1-C5直链或支链的烷烃；R1和R2相同，为乙基、正丙基、异丙基、丁基、苄基；R1代表H时，R2为乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、环己基、苄基、-CH2CH2OH；R1代表甲基时，R2为-CH2CH2OH。或者NR1R2代表乙烯亚胺基、哌啶基、哌嗪基、甲基哌嗪基或三元～六元脂肪环单或二取代氨基；R3代表氢；取代或无取代基的C1-C5直链或支链的烷基；C3-C6的环烷基；-R8C＝CR9或-R8C≡CR9，R8表示H或C1-C5的直链或支链亚烷基；R9表示H、C1-C5的直链或支链烷基；
3.根据权利要求1或2所述的化合物，其中R代表-NHCH(COOR4)CH2CH2COOR5，R4、R5相同或不同，各自独立地代表H，C1-C4直链或支链的烷烃；R1和R2相同，为乙基、正丙基、异丙基、丁基、苄基；R1代表H时，R2为乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、环己基、苄基、-CH2CH2OH；R1代表甲基时，R2为-CH2CH2OH；R3代表氢；取代或无取代基的C1-C8直链或支链的烷基；C1-C8直链或支链的烷氧基；C3-C6的环烷基；-R6C＝CR7或-R6C≡CR7，R6表示H或C1-C5的直链或支链亚烷基；R7表示H、C1-C5的直链或支链烷基。
4.权利要求1至3任意一项所述化合物在制备诱导性一氧化氮合酶药物和抗肿瘤药物中的应用。
5.权利要求1至3任意一项所述化合物在制备在败血性和(或)出血性休克或用细胞毒素进行肿瘤化学治疗和肝硬化或肝萎缩和(或)肝功能衰退时所引起的血压下降或(和)止血障碍药物中的应用。
6.权利要求1至3任意一项所述化合物在制备预防和治疗炎症疾病、异体器官和组织移植的排斥反应药物以及胰岛素依赖型糖尿病药物中的应用。
7.权利要求1至3任意一项所述化合物在制备预防和治疗细胞毒素进行肿瘤的化学治疗、化学物质或药物以及慢性肝炎引发的多种肝损伤、肝功能衰退以及预防和治疗心肌梗塞损伤、病毒性心肌炎药物中的应用。
8.权利要求1至3任意一项所述化合物在制备预防和治疗病毒性神经退化、变化疾病及痛觉过敏、癫痫、偏头痛药物中的应用。
9.权利要求1至3任意一项所述化合物在制备用于计划生育的药物中的应用。
10.一种药物组合物，其中含有治疗有效量的权利要求1至3任意一项所述化合物，并含有常规药用载体。
全文摘要
本发明涉及一种具有抑制一氧化氮合成酶作用的甲氨蝶呤衍生物，它对甲氨蝶呤(MTX)的4－位氨基进行结构修饰，具有通式(1)所述的化学结构。本发明抗癌谱较宽、毒性改善，治疗用途较MTX有所扩大，具有抑制一氧化氮合成酶的作用和抑制肿瘤细胞生长的作用，可用于制备抗肿瘤、抗关节炎、治疗肠类疾病、用作计划生育等的药物。
文档编号A61P9/00GK1583746SQ200410044878
公开日2005年2月23日 申请日期2004年5月26日 优先权日2004年5月26日
发明者姚其正, 冯明声, 石静波, 姜力勋, 郭平 申请人:中国药科大学
技术领域：
本发明涉及一类新的MTX衍生物，具体说明涉及一种具有抑制一氧化氮合成酶作用的甲氨蝶呤衍生物，它可以提高临床药物MTX(甲氨蝶呤)的抗肿瘤，抗关节炎，治疗肠类疾病，用作计划生育等的活性。
背景技术：
(1)MTX生化和药理作用及其应用四氢叶酸(Tetrahydrofolates，简写为THF)衍生物在细胞中是一碳代谢的各种酶的极为重要底物，即为嘧啶，嘌呤生物合成中的甲酰基，羟甲基或甲基的供体，在DNA和RNA的合成、复制和修复等过程起着重要作用。四氢叶酸在细胞内的合成是由叶酸经二氢叶酸还原酶(Dihydrofolate reductase，DHFR)的作用而完成。叶酸和甲氨蝶呤(Methotrexate，缩写为MTX，其化学名为N-[4-[[2，4-diamino-6-pteridinylmethyl]methylamino]benzoyl]-L-glutamic acid)都属于蝶啶衍生物，结构相似，故MTX能够结合到DHFR的活性位点上，产生对DHFR的抑制作用，阻断了DNA和RNA生物合成所需的THF的形成，因此，MTX具有杀菌、抗病毒和抑制不正常、增殖较快细胞的作用，尤其在抗肿瘤方面显示了重要作用。1948年MTX被Seeger等人用化学方法合成得到，1949年用于临床治疗小儿白血病，从而正式开创了化学疗法治疗癌症的历史。由于迅速增殖的癌细胞吸收MTX的量多于一般正常细胞，MTX成为使用广泛的抗肿瘤药物，如用于治疗妊娠绒毛膜癌、绒毛膜腺瘤、囊状肿瘤、急性淋巴细胞白血病、乳腺癌、头颈部表皮样肿瘤、蕈样霉菌病、肺痨和非何杰金氏淋巴瘤等。MTX也是有效的免疫抑制剂，用于预防器官移植所引起的移植物抗宿主反应，以及控制炎症疾病，如肠炎，关节炎与类风湿性关节炎等，MTX也可用于治疗重度牛皮癣。此外，MTX还可用于治疗早期宫外孕，输卵管妊娠及抗早孕(张云山、朱楣光编译，甲氨蝶呤配伍米索前列醇早孕，国外医学计划生育分册，1998，17(1)20)。有报道，MTX作为计划生育用药，有着广泛的前途，如用于紧急避孕(朱波、蔡坚等，米非司酮合并甲氨蝶呤用于紧急避孕初步观察，广东医药，1999，20(1)11～12)等。
(2)MTX和NO的关系一氧化氮自由基(简写为NO)在生物体内作为重要的信使分子和效应分子，NO是通过内源性一氧化氮合酶(NO Synthase，简写为NOS)产生的。BH4是NOS的重要辅酶，它与NOS的稳定性有关，促进NOS达到最大催化活性，因此，BH4与其NOS的结合区可作为选择性的药理作用靶点。BH4和叶酸、MTX一样同属于蝶啶类化合物，故MTX在NOS的BH4结合区域中有与BH4竞争和NOS结合的作用，显然MTX对NOS的活性有抑制作用，现已证实MTX是NOS抑制剂(Collin-Osdoby P，Nickols GA，et al，J Cell Biochem，1995，57399)。
(3)MTX与所治疗疾病的关系事实上，MTX所能治疗的疾病都与体内的NO水平有着密切的关系。
A、NO在抗肿瘤治疗中的作用肿瘤中产生的NO具有双重作用，这依赖于NO的生成量一方面，持续合适浓度(pmol或fmol水平)的NO产生，有利于肿瘤生长；另一方面，高浓度(nmol水平)的NO主要起胞毒性作用，抑制和杀伤肿瘤细胞。因此，人为的改变NO的生成(如诱导产生)可抑制肿瘤生长，达到抗肿瘤作用(Thomsen LL，Miles DW，et al，Br J Cancer，1995，172(1)41；Jenkins DC，Charles IG，Thomson LL，Natl Acad Sci USA，1995，92(10)4392)。
目前，对NO介导的抗肿瘤作用人们达到了以下的共识(林震，国外医学泌尿系统手册2002，22(2)91；杨彦玲，中国癌症杂志，2001，11(4)371；王水良，癌变畸变突变，2000，12(1)60；Kolb JP，Leukemia，2000，141685；Ferry-Dumazer H，Mamani-Matsuda M，et al，Leukemia，2002，21(2)708)①NO介导的巨噬细胞对肿瘤细胞具有杀伤作用。②NO介导的内皮细胞对肿瘤细胞的溶解作用。③NO可以造成肿瘤细胞自由基损伤和能量代谢障碍。④NO对DNA有毒性与对蛋白质合成有障碍。⑤NO诱导细胞凋亡。另外，由于NO对肿瘤生长影响的多重性，NO还有促进肿瘤细胞生长的作用。NO对DNA的毒性作用并非特异性的针对肿瘤细胞，对正常细胞也同样起作用，因此能造成正常细胞DNA的损伤，DNA的损伤和NO代谢产生的亚硝酸盐均可导致基因突变和癌变。肿瘤细胞自身分泌的NO主要通过以下三种机理发挥作用①增强肿瘤细胞侵袭转移能力。②促进肿瘤血管生成、增加肿瘤新生血管的供血。③抑制宿主细胞抗肿瘤的防御功能。肿瘤细胞产生的NO主要来自iNOS被激活而过度表达(eNOS也同样起了促进作用)，催化机体合成大量的NO，参与机体免疫和肿瘤发生、发展过程，因而NOS的抑制剂对肿瘤能够产生防治作用。
总之，随着对NO在肿瘤免疫方面基础研究的不断深入，开发MTX-NO供体化合物和MTX-NOS特异性抑制剂，人为的改变NO的生成(抑制或诱导产生)，探讨在NO水平上MTX的抑制肿瘤生长机制，达到获得具有较高抗肿瘤作用的MTX新结构药物。
B、NO对组织移植的影响大量的实验研究结果表明NO在组织移植中扮演着双重角色，表明NO在移植反应中具有免疫调节剂的作用，故在免疫抑制剂MTX分子中组合上NO供体分子或者NOS抑制剂，或者对MTX进行结构修饰，可以改变MTX的应用范围，使其在抗组织移植排斥反应中产生更全面的效果。
C、NO与关节炎关节炎最常见的有骨关节炎和类风湿性关节炎等。研究已说明，NO参与关节疾病的发生和发展，患有骨关节炎或类风湿性关节炎病人的血液和关节滑液中的NO水平均明显增高，并且滑液中的NO水平高于血液中的NO水平。研究人员还观察到iNOS能在关节炎病人的关节膜中进行表达；据报道，骨关节炎病人的少许软骨在体外有机培养基中能自发释放大量NO2-，而NO2-是NO代谢的最终产物，释放NO2-的持续时间可达72小时。
由于NO参与关节疾患的病理生理过程，药物调节NO水平已成为治疗关节疾病的一条新途径，目前发现，临床已用于治疗骨关节疾病的一些药物，实际上也是通过这一途径发挥治疗作用的。如甲氨蝶呤(MTX)仍然认为是目前治疗风湿性关节炎的一线药物，虽然已有制药公司研制出治疗关节炎的新药，但仍缺乏长期安全性数据的支撑，相比之下，MTX应用时间已达半个世纪，其价格上也大大低于任何新药。显然，在保留MTX母核的基础上对其进行适当的修饰，以期提高其对iNOS选择性抑制活性，对治疗关节疾病具有重要意义。
D、一氧化氮与生殖①、NO与妊娠、分娩生理成功妊娠的先决条件之一是孕妇子宫平滑肌对妊娠具有良好的适应性。NO在细胞内形成通过旁分泌(paracrine)作用可迅速扩散到细胞外，作用于邻近的平滑肌细胞，激活细胞膜上的鸟苷酸环化酶，使该酶活性增加50～200倍，导致细胞内cGMP生成增多，cGMP进而激活cGMP依赖性蛋白激酶，或直接作用于细胞膜上的钙离子通道，引起钙离子外流或加速细胞内游离钙的结合，从而引起平滑肌细胞舒张和血管扩张。有研究发现，NOS的增多是平滑肌对妊娠的适应性变化，这使得妊娠期子宫保持静止。当妊娠达到足月时NO的生成减少，同时子宫对NO的反应性下降了，这样可导致子宫收缩性增加，以利于分娩的发动。
②、NO与脐血管组胺能引起脐血管的短暂轻微扩张，之后即转为强烈收缩。NOS抑制剂可阻断这种由组胺诱发的血管扩张，相反却能明显增强组胺的收缩血管反应。NO还能明显抑制高钾状态所诱发的脐血管的收缩反应。脐血管弛张可以增加氧和营养物质的输送，以利于胎儿生长。妊高症患者脐血管内皮细胞产生的NO含量明显低于正常孕妇，缺乏合成NO的能力，因此，不能对脐血管进行调节，以保证胎儿的正常血液供应，影响了胎儿的生长发育。
③、NO与胎儿生长发育NO是胎盘血流、氧和营养物质交换的关键因子，为保证胎儿在子宫内安全起重要作用。有研究表明，胎儿在子宫内生长发育迟缓是一氧化氮合成受到抑制所致。
MTX用于治疗早期宫外孕及抗早孕已取得了令人满意的效果。MTX在体内使二氢叶酸还原酶失去活性，间接抑制体内一碳单位代谢，阻碍细胞增殖。MTX又是NOS抑制剂，能抑制胎盘血管与脐血管的形成。妊娠时，滋养细胞增生活跃，MTX阻断其营养的供应，致其死亡。卵子受精后36～48h发育成8个细胞的桑椹胚，其表面细胞是滋养叶细胞，此时在MTX作用下抑制其生长、发育而被吸收，破坏了孕卵生存的条件，因而，着床前MTX即能中止妊娠；MTX能使滋养层对蜕膜的附着“不稳定”，同时可使滋养层停止产生HCG，降低黄体支持及孕酮的产生，中止正在进行的着床或已确立的妊娠，达到“晚”的紧急避孕作用。
半个世纪以来，MTX一直是一个临床上的一个重要的抗癌药物、免疫抑制剂和抗风湿性关节炎药物等，但是由于其抗癌谱较窄，又是一个非选择性胞毒剂，具有较大的毒性；再者，MTX在临床上已使用五十多年，癌细胞对MTX的耐药性已显露出来，故自从MTX应用临床后，国外一直有许多药物化学家对其进行结构改造，以降低其毒性，扩大其抗癌谱。他们试图对MTX的结构改造以达到增加其脂溶性，改变MTX衍生物的药物动力学性质，或者针对其它依赖于THF的酶，来改变修饰MTX，以获得这些酶的抑制剂(姚其正，蝶啶类药物的研究进展，彭司勋主编药物化学进展(第一卷)，北京中国医药科技出版社，2000，52-80)。
发明内容
本发明要解决的主要技术问题MTX抗癌谱较窄、具有较大的毒性且经五十多年的临床使用，癌细胞对MTX的耐药性已显露出来的问题，扩大MTX的治疗用途。
据研究表明BH4对NOS的稳定性有关、可促进NOS达到最大活性在，因此BH4与其NOS的结合区可作为理想的用于选择性的药理干预靶点。基于此思想，本发明合成具有与MTX结构相似的化合物，使其结构中保持有蝶啶与苯甲酰谷氨酸部分，在蝶啶环的4-位用多种基团进行修饰，其结构式可用通式I表示，以期这类MTX衍生物与BH4竞争，结合到NOS的BH4结合区中，达到干扰或抑制NOS的活性目的；同时也与叶酸竞争抑制癌细胞的生长，达到抗肿瘤的目的。这些MTX衍生物经用iNOS(inducibleNOS，诱导性NOS)进行生物活性测试，结果表明这类MTX衍生物具有抑制NO产生的作用，可以用作处理体内因NO升高而引发疾病的治疗药物。
四氢生物蝶呤(BH4)下述通式(I)表示本发明所述的MTX衍生物或其药学上可接受的盐或其水合物 R代表-OR4、-NHCH(COOR5)CH2CH2COOR6、-NHCH(COOR7)CH2CH2CH2NHC(＝NH)NH2、-NHCH(COOR8)CH2CH2CONH2，R4、R5、R6、R7、R8相同或不同，各自独立地代表H、C1-C5直链或支链的烷烃；R3代表氢；取代或无取代基的C1-C8直链或支链的烷基；C1-C8直链或支链的烷氧基；C3-C6的环烷基；-R9C＝CR10或-R9C≡CR10，R9表示H或C1-C8的直链或支链亚烷基；R10表示H、C1-C8的直链或支链烷基；R1和R2相同或不同，各自独立地表示C1-C8直链或支链的烷基；苄基；芳基；R1和R2不同时为H；R1为H或甲基时，R2代表三元～六元环烷基，-(CH2)nOH(n＝1～6)；-C6H4COGlu、-C6H4CH2COGlu、-C6H4COGlu、-C6H4CH2COGlu，Glu代表-NHCH(COOR11)CH2CH2COOR12，R11与R12相同或不同，各自独立地表示H、甲基或乙基；-C6H4COOR13、-C6H4CH2COOR14，R13和R14相同或不同，各自独立地表示H、甲基、乙基；或者NR1R2代表乙烯亚胺基、哌啶基、哌嗪基、甲基哌嗪基或三元～六元脂肪环单或二取代氨基；通式(I)不包括当R3为H或甲基时，R1或R2为H或甲基，NR1R2为哌啶基。
前述MTX衍生物或其药学上可接受的盐，其中较好的是R代表-NHCH(COOR5)CH2CH2COOR6、-NHCH(COOR7)CH2CH2CH2NHC(＝NH)NH2、-NHCH(COOR8)CH2CH2CONH2，R5、R6、R7、R8相同或不同，各自独立地代表H，C1-C4直链或支链的烷烃；R3代表氢；取代或无取代基的C1-C5直链或支链的烷基；C3-C6的环烷基；-R9C＝CR10或-R9C≡CR10，R9表示H或C1-C5的直链或支链亚烷基；R10表示H、C1-C5的直链或支链烷基；R1，R2相同或不同，各自独立地代表H，C1-C5直链或支链的烷烃；R1和R2相同，为乙基、正丙基、异丙基、丁基、苄基；R1代表H时，R2为乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、环己基、苄基、-CH2CH2OH；R1代表甲基时，R2为-CH2CH2OH。
或者NR1R2代表乙烯亚胺基、哌啶基、哌嗪基、甲基哌嗪基或三元～六元脂肪环单或二取代氨基；通式(I)不包括当R3为H或甲基时，R1或R2为H或甲基，NR1R2为哌啶基。
前述MTX衍生物或其药学上可接受的盐，其中更为合适的R代表-NHCH(COOR5)CH2CH2COOR6，R5、R6相同或不同，各自独立地代表H，C1-C4直链或支链的烷烃；R1和R2相同，为乙基、正丙基、异丙基、丁基、苄基；R1代表H时，R2为乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、环己基、苄基、-CH2CH2OH；R1代表甲基时，R2为-CH2CH2OH；R3代表H、甲基、乙炔基。
以上所述的烷基和胺基中的烷基可以是直链烷基，或是有侧链的烷基，或是环状烷基。在分子式中如果出现有立体异构体和互变异构体，则本发明中的化合物包括这些全部的立体异构体和互变异构体。
前述通式(I)表示的MTX衍生物或其药学上可接受的盐或其水合物在制备抑制诱导性一氧化氮合酶药物和抗肿瘤药物中的应用。
前述通式(I)表示MTX衍生物或其药学上可接受的盐或其水合物在制备抑制诱导性NOS和抗代谢药物中的应用，是制备在败血性和(或)出血性休克，或用细胞毒素进行肿瘤化学治疗和肝硬化或肝萎缩和(或)肝功能衰退时所引起的血压下降或(和)止血障碍药物。更具体的应用，是制备预防和治疗炎症疾病药物；是制备预防和治疗异体器官和组织移植的排斥反应药物，以及胰岛素依赖型糖尿病药物；是制备预防和治疗细胞毒素进行肿瘤的化学治疗、化学物质或药物以及慢性肝炎引发的多种肝损伤、肝功能衰退以及预防和治疗心肌梗塞损伤、病毒性心肌炎药物；是制备预防和治疗早孕、宫外孕的药物；是用于计划生育的药物。所述的应用，是制备预防和治疗病毒性神经退化、变化疾病及痛觉过敏、癫痫、偏头痛药物。
利用本发明制备的药物组合物，其中含有治疗有效量的通式(II)表示的MTX衍生物或其药学上可接受的盐或其水合物，并含有常规要用载体。
本发明所述的通式(I)表示的化合物可以它们的中性形式，也可以和无机酸或者有机酸加成形成相应的盐使用，对药物中所能用的酸包括有如盐酸、溴化氢、萘二磺酸(1，5)、磷酸、硝酸、硫酸、草酸、酒石酸、乳酸、水杨酸、苯甲酸、甲酸、乙酸、丙酸、戊酸、二乙基乙酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、丁二酸、庚二酸、己二酸、马来酸、苹果酸、氨基磺酸、苯丙酸、葡糖酸、抗坏血酸、异烟酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸，以及氨基酸等。通式I表示的化合物可和多摩尔的酸加成形成盐，这些多摩尔的酸可以是单一的也可是组合的，这主要根据需要用相应的溶剂或稀释剂的情况来决定。这些盐也可以它们的水合物形式存在。这些加成的盐可通过阴离子交换而去除。对于通式II中含有酸性组分的化合物，也可通过相应的无机或有机碱、或碱性氨基酸组成相应的盐或其水合物，例如对于这些盐有碱金属的盐，特别有效的是钠、钾、镁和铵盐，以及与有机胺和碱性氨基酸等组成相应的盐。
本发明所涉及的MTX衍生物和它们相应的盐类可和适合辅料(包括相应的医药上准许应用的赋形剂、粘合剂、缓释剂、稳定剂、香料、调味剂和色素等)做成片剂或胶囊口服，也可做成相应的针剂用于临床。
对本发明中的通式I型的化合物抑制iNOS活性的测定，根据已知的测定方法(参见钟慈声，孙安阳主编一氧化氮的生物医学，上海上海医科大学出版社，1997，p.361-363，381-385)。
因NO水平升高而引起的疾病和病症，主要包括病理性血压下降，例如败血症或出血性休克；用细胞毒素进行肿瘤的化学治疗、化学物质或药物以及慢性肝炎引发的多种肝损伤(即化学性，病毒性和免疫性肝损伤)，肝硬化或肝萎缩，和肝功能衰退；也包括进行性炎症，如类风湿性关节炎和溃疡性结肠炎，以及胰岛素依赖型糖尿病和器官移植排斥反应；也包括早孕、宫外孕以及意外妊娠，以上这些疾病和病症可用本发明如通式II表示的化合物进行治疗和预防。
另外，下列一些疾病也与诱导产生的NO水平升高有关，可用本发明的通式I的化合物来预防和治疗，在心血管循环方面，如心肌梗塞损伤、病毒性感染引起的心肌炎；在神经和中枢神经方面，如病毒性神经退化(变性)疾病，以及痛觉过敏、癫痫、偏头痛等。总之，过量NO产生与许多疾病有关，iNOS的激活产生过多的NO是重要的致病因素，研制iNOS选择抑制剂是十分必要的。
各种蝶啶衍生物广泛地存在生物体内，在生物体中起着多种功能，有代表性的如生物蝶呤和叶酸，它们在生物体中均以各自的四氢还原型而起作用。合成蝶啶类(抗叶酸类)iNOS的抑制剂必须满足以下的可能性(1)抑制剂应是蝶啶类衍生物和叶酸是同类物，这样才有可能适应NOS中的蝶啶结合区的结构上的需求；(2)所合成的蝶啶衍生物可以是非还原型的蝶啶衍生物，并且在蝶啶的4-位和6-位有较多的修饰取代基的变化，其作用与(1)一致，以竞争和NOS结合，使NOS结构和电性变化而失活。根据上两点，一般通式为I的MTX衍生物，是在其4-位上用取代氨基代替原有的氨基，故能成为iNOS抑制剂。
本发明通式I所表示的化合物为本次发明新合成的化合物，新合成的化合物均经过各种物理方法进行了结构鉴定，包括1H-NMR、MS、和元素分析。化合物都是按照或者参照已发表的方法进行合成。
通式I化合物的合成有以下步骤1、2-氨基-4-取代胺基-6-溴甲基蝶啶(A)的合成
式中NR1R2＝N(CH2CH3)2；HNCH(CH3)2；NHCH(CH2)2；NH(CH2)3CH3；N(CH2CH2CH3)2；N(CH2CH2CH2CH3)2；N(CH3)CH2CH2OH；NHCH(CH2)5等。
首先将对氯苯胺重氮化，然后和2，6-二氨基-4-氯嘧啶结合生成2，6-二氨基-4-氯-5-对氯苯偶氮嘧啶，接着用取代胺取代氯，所得的化合物用锌粉在酸性条件下还原偶氮基，得化合物2，5，6-三氨基-4-取代胺嘧啶(嘧啶衍生物的合成方法参考Froehlich L，KotsonisP，Traub H，et al，J Med Chem，1999，424108-4121)。然后再和3-溴-2-氧丙醛肟环合得化合物(A)。
2、3-溴-2-氧丙醛肟(B)的合成 双烯酮先在四氯化碳溶液中与溴加成开环，然后在活泼亚甲基上发生亚硝酸反应，经脱二氧化碳，重排，得化合物(B)。
3、对甲氨基苯甲酰-L-谷氨酸二钠盐(C)和对氨基苯甲酰-L-谷氨酸(D)的合成
4、目的化合物的合成4.1.化合物1-8的合成 4.2.化合物9-16的合成 在4.1和4.2中，将2-氨基-4-取代胺基-6-溴甲基蝶啶(A)分别与对氨基取代苯甲酰-L-谷氨酸C、D于酸水溶液中反应，可以得到4-位氨基取代的MTX衍生物。
本发明抗癌谱较宽、毒性改善，治疗用途较MTX有所扩大。
具体实施例方式
1.仪器与试剂本实验的各化合物熔点用Mel-TEMP熔点仪测定，温度未经校正。MS用HP1100LC/MSD质谱仪测定。薄层层析(TLC)板用硅胶GF254(青岛海洋化工厂生产)与浓度为0.8％的CMC-Na蒸馏水溶液搅拌均匀后铺成，然后再经100-110℃活化1h，置入干燥器内保存备用，于紫外灯下(波长254nm和365nm)显色；柱层析采用100-200或200-300目硅胶(青岛海洋化工厂生产)，干法装柱。H-NMR谱用BruckAV-300型核磁共振仪测定，不特别说明，所用溶剂为D6-DMSO。元素分析用Elementar Vario ELIII仪器测定。试剂均为市售化学纯或分析纯产品，除特别说明外，不经处理直接使用2.化合物的制备N-[4-[[2-氨基-4-(N-环丙基)氨基-6-蝶啶甲基]氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸(1)将0.4g(1.36mmol)化合物A(式中NR1R2＝NH-环丙基)和0.72g(2.71mmol)对氨基苯甲酰-L-谷氨酸(D)悬浮于30mL水中，加入5mL40％氢溴酸使溶解，然后滴入2mol/L NaOH溶液调节pH至1～2，于60～65℃搅拌反应3h，在反应过程中有黄色固体析出。冷冻过夜后过滤，水洗，乙醇洗，乙醚洗，真空干燥，得粗品黄色粉末0.51g。将上述粗品和0.2g氧化镁少许水润湿后研细移入反应瓶中，加入15mL水，于内温55～60℃搅拌45分钟后(尚有少许沉淀不溶解)，加活性炭脱色，过滤，滤液用稀氢溴酸酸化至pH2，析出黄色絮状固体，冷冻过夜，滤取固体，水洗，乙醇洗，乙醚洗，真空干燥，得0.41g黄色粉末(1)，收率63.0％。m.p.＞200℃(dec.)；ESI-MS481.2[M+H]+，503.2[M+Na]+；1H-NMR(AV-300，D6-DMSO)δ0.87(m，4H，Cyclopropyl-CH2CH2)，1.89～2.06(m，2H，Glu-CH2.)，2.32(m，2H，Glu-CH2)，3.13～3.21(m，1H，Cyclopropyl-CH)，4.31～4.36(m，1H，Glu-*CH)，4.56(s，2H，9-CH2)，6.71(d，J＝8.5Hz，2H，Ph-CH)，6.91～7.45(bs，2H，NH2)，7.69(d，J＝8.5Hz，2H，Ph-CH)，7.95(d，1H，Cyclopropyl-NH)，8.17(s，1H，CONH)，8.75(s，1H，7-CH)，9.18(bs，1H，10-NH)；Anal.Calcd forC22H24N8O5·1.5H2O·0.5HBr(Mr＝548.01)C48.22，H5.06，N20.45；FoundC48.40，H5.27，N20.48。
N-[4-[[2-氨基-4-(N-异丙基)氨基-6-蝶啶甲基]氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸(2)方法同(1)的合成。将0.4g(1.35mmol)A(式中NR1R2＝NHCH(CH3)2)和0.72g(2.7mmol)对氨基苯甲酰-L-谷氨酸(D)悬浮于30mL水中，加入5mL 40％氢溴酸使溶解，然后滴入2mol/LNaOH溶液调节pH至1.7，于60～65℃搅拌反应3h。后经处理得0.32g黄色粉末(2)，收率49.3％。mp＞200℃(dec.)。ESI-MS483.3[M+H]+，505.2[M+Na]+；1H-NMR(AV-300 D6-DMSO)δ1.30(d，6H，2×CH3)，2.03～2.07(m，2H，Glu-CH2)，2.30(t，2H，Glu-CH2COOH)，4.34(m，1H，Glu-*CH)，4.48～4.59(m，3H，i-Propyl-CH and 9-CH2)，6.76(d，J＝8.5Hz，2H，Ph-CH)，6.90～7.40(m，2H，NH2)，7.69(d，J＝8.5Hz，2H，Ph-CH)，7.90(bs，1H，i-Propyl-NH)，8.15(d，1H，NHCO)，8.74(s，1H，7-CH)，8.87(d，1H，10-NH)，12.25(bs，2H，2-COOH)；Anal.Calcd forC22H26N8O5·0.25C2H6O·0.75HBr(Mr＝554.78)C，48.71 H，5.13 N，20.20；FoundC，48.94H，5.29 N，19.96。
N-[4-[[2-氨基-4-(N-正丁基)氨基-6-蝶啶甲基]氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸(3)方法同(1)的合成。将0.4g(1.29mmol)A(式中NR1R2＝NHCH2CH2CH2CH3)和0.68g(2.56mmol)对氨基苯甲酰-L-谷氨酸(D)悬浮于30mL水中，加入5mL40％氢溴酸使溶解，然后滴入2mol/LNaOH溶液调节pH至1.7，于60～65℃搅拌反应3h。后经处理得0.3g黄色粉末(3)，收率47.0％。mp169～171℃。ESI-MS495.1[M-H]-；1H-NMR(AV-300 D6-DMSO)δ0.92(t，3H，n-Bu-CH3)，1.35(m，2H，n-Bu-CH2CH3)，1.64(m，2H，n-Bu-CH2Et)，1.86～2.08(m，2H，Glu-CH2)，2.32(t，2H，Glu-CH2COOH)，3.53(t，2H，n-Bu-CH2C3H7).4.33(m，1H，Glu-*CH)，4.54(s，2H，9-CH2)，6.71(d，J＝8.5Hz，2H，Ph-CH)，6.88～7.25(m，2H，NH2)，7.69(d，J＝8.5Hz，2H，Ph-CH) 8.16(d，1H，NHCO)，8.72(s，1H，7-CH)，8.92(bs，1H，n-Bu-NH)；Anal Calcd for C23H28N8O5·H2O·0.5HBr(Mr＝555.05)C，49.77H，5.54 N，20.19；FoundC，49.68 H，5.91 N，20.19。
N-[4-[[2-氨基-4-[N-甲基，N-(2-羟基乙基)氨基-6-蝶啶甲基]氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸(4)方法同(1)的合成。将0.4g(1.28mmol)A(式中NR1R2＝(CH3)CH2CH2OH)和0.68g(2.56mmol)对氨基苯甲酰-L-谷氨酸(D)悬浮于30mL水中，加入5mL40％氢溴酸使溶解，然后滴入2mol/L NaOH溶液调节pH至1.7，于60～65℃搅拌反应3h。后经处理得0.29g黄褐色粉末(4)，收率45.6％。mp＞196℃(dec.)。ESI-MS497.2[M-H]-；1H-NMR(AV-300 D6-DMSO)δ1.90～2.02(m，2H，Glu-CH2)，2.26～2.33(m，2H，Glu-CH2COOH)，3.70(t，2H，CH2OH)，4.10(m，5H，CH3NCH2)，4.29～4.37(m，1H，Glu-*CH)，4.47(s，2H，9-CH2)，6.53～6.83(m，5H，Ph-CH and 10-NH and NH2)，7.65(d，J＝8.5Hz，2H，Ph-CH)，8.38(d，1H，NHCO)，8.63(s，1H，7-CH)；Anal Calcd for C22H26N8O6H2O·0.5NH3(Mr＝525.03)C，50.33 H，5.66 N，22.68；FoundC，50.21 H，5.62N，22.69。
N-[4-[[2-氨基-4-(N-环己基)氨基-6-蝶啶甲基]氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸(5)方法同(1)的合成。将0.4g(1.19mmol)A(式中NR1R2＝NH-环己基)和0.63g(2.37mmol)对氨基苯甲酰-L-谷氨酸(D)悬浮于30mL水中，加入5mL 40％氢溴酸使溶解，然后滴入2mol/L NaOH溶液调节pH至1.7，于60～65℃搅拌反应3h。后经处理得0.28g黄色粉末(5)，收率45.2％。mp190～1 92℃。ESI-MS521.2[M-H]-；1H-NMR(AV-300 D6-DMSO)δ1.30～2.04(m，12H，Cyclohexyl-2’，3’，4’，5’，6’-CH2and Glu-CH2)，2.33(t，2H，Glu-CH2COOH)，4.06(m，1H，Cyclo-hexyl-CH)，4.34(m，1H，Glu-*CH)，4.51(s，2H，9-CH2)，6.68～6.87(m，5H，Ph-CH and 10-NH and NH2)，7.70(m，3H，Ph-CH andCyclohexyl-NH)，8.13(d，1H，NHCO)，8.68(s，1H，7-CH)；Anal Calcd forC25H30N8O5·H2O·0.5C2H6O·0.5HBr(Mr＝604.07)C，51.70 H，5.92 N，18.54；FoundC，51.79H，6.14 N，18.34。
N-[4-[[2-氨基-4-(N，N-二乙基)氨基-6-蝶啶甲基]氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸(6)
方法同(1)的合成。将0.5g(1.61mmol)A(式中NR1R2＝N(CH2CH3)2)和0.86g(3.22mmol)对氨基苯甲酰-L-谷氨酸(D)悬浮于40mL水中，加入7mL40％氢溴酸使溶解，然后滴入2mol/L NaOH溶液调节pH至1.7，于60～65℃搅拌反应3h。后经处理得0.45g黄色粉末(6)，收率56.4％。mp186～188℃。ESI-MS495.2[M-H]-；1H-NMR(AV-300 D6-DMSO)δ1.13(t，6H，2×CH3)，1.82～1.95(bm，2H，Glu-CH2)，2.23(t，2H，Glu-CH2COOH)，3.82(bs，4H，2×-CH2-)，4.23(m，1H，Glu-*CH)，4.42(s，2H，9-CH2)，6.52(d，2H，Ph-CH)，6.45(d，2H，NH2)，7.69(m，3H，Ph-CH and NHCO)，8.58(s，1H，7-CH)；Anal Calcd for C23H28N8O5·2H2O(Mr＝532.55)C，51.87 H，6.06N，21.04；FoundC，52.27 H，6.21 N，20.80。
N-[4-[[2-氨基-4-(N，N-二正丁基)氨基-6-蝶啶甲基]氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸(7)方法同(1)的合成。将0.5g(1.36mmol)A(式中NR1R2＝(CH2CH2CH2CH3)2)和0.73g(2.72mmol)对氨基苯甲酰-L-谷氨酸(D)悬浮于40mL水中，加入7mL 40％氢溴酸使溶解，然后滴入2mol/LNaOH溶液调节pH至1.7，于60～65℃搅拌反应3h。后经处理得0.35g黄色粉末(7)，收率46.5％。mp162～164℃。ESI-MS553.3[M+H]+，575.2[M+Na]+；1H-NMR(AV-300 D6-DMSO)δ0.81(t，6H，2×n-Bu-CH3)，1.23(m，4H，2×n-Bu-CH2CH3)，1.56(m，4H，2×n-Bu-CH2Et)，1.84～2.01(m，2H，Glu-CH2)，6.55(d，J＝8.5Hz，2H，Ph-CH)，6.70～7.00(m，3H，NH2and 10-NH)，7.54(d，J＝8.5Hz，2H，Ph-CH)，8.03(d，1H，NHCO)，8.59(s，1H，7-CH)；Anal Calcd for C27H36N8O5·1.5H2O(Mr＝579.66)C，55.95 H，6.78 N，19.33；FoundC，55.95 H，6.75 N，19.60。
N-[4-[[2-氨基-4-(N，N-二正丙基)氨基-6-蝶啶甲基]氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸(8)方法同(1)的合成。将0.5g(1.47mmol)A(式中NR1R2＝(CH2CH2CH3)2)和0.78g(2.95mmol)对氨基苯甲酰-L-谷氨酸(D)悬浮于40mL水中，加入7mL40％氢溴酸使溶解，然后滴入2mol/L NaOH溶液调节pH至1.7，于60～65℃搅拌反应3h。后经处理得0.45g黄色粉末(8)，收率58.4％。mp160～162℃。ESI-MS525.3[M+H]+，547.2[M+Na]+；1H-NMR(AV-300 D6-DMSO)δ0.80～0.94(m，6H，2×n-Pr-CH3)，1.60～1.7(m，4H，2×n-Pr-CH2Me)，1.69～1.72(m，2H，Glu-CH2)，2.29(m，2H，Glu-CH2)，3.81(bs，4H，CH2NCH2)，4.34(m，1H，Glu-CH)，4.46～4.96(m，2H，CH2)，6.86～6.90(m，4H，Ph-CH，NH2)，7.66(d，J＝8.5Hz，2H，Ph-CH)，8.13(d，1H，NHCO)，8.58(d，1H，7-CH)，12.36(bs，2H，2×COOH)；Anal Calcd for C25H32N8O5·0.5NH3·0.5H2O(Mr＝542.11)C，55.39 H，6.41 N，21.96；FoundC，55.50 H，6.38 N，21.6
N-[4-[[2-氨基-4-(N，N-二乙基)氨基-6-蝶啶甲基]甲胺基]苯甲酰基]-L-谷氨酸(9)将0.5g(1.6mmol)A(式中NR1R2＝N(CH2CH3)2)和1.04g(32mmol)对甲氨基苯甲酰-L-谷氨酸二钠盐(C)悬浮于40mL水中，加入7mL40％氢溴酸使溶解，然后滴入2mol/LNaOH溶液调节pH至1.7，于60～65℃搅拌反应3h，冷至20℃后迅速倾入10mL2mol/LNaOH溶液中，开始析出的沉淀完全溶解，以稀氢溴酸调节pH4～4.5，析出黄色固体，冷却放置过夜。次日过滤水洗，乙醇洗，乙醚洗，真空干燥，得粗品黄色粉末0.63g。将上述粗品和0.3g氧化镁少许水润湿后研细移入反应瓶中，加入15mL水，于内温55～60℃搅拌45分钟后(尚有少许沉淀不溶解)，加活性炭脱色，过滤，滤液用稀氢溴酸酸化至pH2，析出黄色絮状固体，冷冻过夜，滤取固体，水洗，乙醇洗，乙醚洗，真空干燥，得0.45g黄色粉末(9)，收率54.9％。mp162～164℃。ESI-MS511.2[M+H]+；1H-NMR(AV-300 D6-DMSO)δ1.11(t，6H，2×CH3)，1.89～2.05(m，2H，Glu-CH2)，2.31(t，2H，Glu-CH2COOH)，3.13(s，3H，N10-CH3)，3.83(bs，4H，2×CH2)，4.30～4.35(m，1H，Glu-*CH)，4.79(s，2H，9-CH2)，6.52(m，2H，NH2)，6.76(d，J＝8.5Hz，2H，Ph-CH)，7.69(m，3H，Ph-CH and NHCO)，8.59(s，1H，7-CH)；Anal Calcd for C24H30N8O5·1.25H2O(Mr＝533.07)C，54.08 H，6.14 N，21.02；FoundC，54.27 H，6.45 N，21.00。
N-[4-[[2-氨基-4-(N-环丙基)氨基-6-蝶啶甲基]甲胺基]苯甲酰基]-L-谷氨酸(10)方法同(9)的合成。将0.4g(1.36mmol)A(式中NR1R2＝NH-环丙基)和0.88g(2.72mmol)对甲氨基苯甲酰-L-谷氨酸二钠盐(C)悬浮于30mL水中，加入5mL 40％氢溴酸使溶解，然后滴入2mol/LNaOH溶液调节pH至1.7，于60～65℃搅拌反应3h。后经处理得0.36g黄色粉末(10)，收率53.7％。mp187～189℃。ESI-MS495.1[M+H]+，517.3[M+Na]+；1H-NMR(AV-300 D6-DMSO)δ0.74～0.77(m，4H，2CH2-cyclopropyl)，1.91～2.07(m，2H，Glu-CH2)，2.32(t，2H，Glu-CH2COOH)，3.01～3.05(m，1H，Cyclopropyl-CH)，3.18(s，3H，N10-CH3)，4.33～4.37(m，1H，Glu-*CH)，4.78(s，2H，9-CH2)，6.81(m，4H，Ph-CHand NH2)，7.73(d，J＝8.5Hz，2H，Ph-CH)，7.94(d，1H，NH-C3H5)，8.18(s，1H，CONH)，8.49(s，1H，7-CH)，1.38(bs，2H，2×COOH)；Anal Calcd for C23H26N8O5·1.5H2O·0.5HBr(Mr＝548.01)C，48.22 H，5.06 N，20.45；FoundC，48.40 H，5.27 N，20.48。
N-[4-[[2-氨基-4-(N-异丙基)氨基-6-蝶啶甲基]甲胺基]苯甲酰基]-L-谷氨酸(11)方法同(9)的合成。将0.5g(1.68mmol)A(式中NR1R2＝NHCH(CH3)2)和1.09g(3.36mmol)对甲氨基苯甲酰-L-谷氨酸二钠盐(C)悬浮于40mL水中，加入7mL40％氢溴酸使溶解，然后滴入2mol/L NaOH溶液调节pH至1.7，于60～65℃搅拌反应3h。后经处理得0.35g黄色粉末(11)，收率41.9％。mp178～180℃。ESI-MS495.2[M-H]-；1H-NMR(AV-300 D6-DMSO)δ1.22(d，6H，2CH3)，1.26～2.07(m，2H，Glu-CH2)，2.31(t，2H，Glu-CH2COOH)，3.16(s，3H，N10-CH3)，4.34(m，2H，Glu-*CH and i-Pr-CH)，4.80(s，2H，9-CH2)，6.70(bs，2H，NH2)，6.82(d，J＝8.5Hz，2H，Ph-CH)，7.47(d，1H，i-Pr-NH)，7.73(d，J＝8.5Hz，2H，Ph-CH)，8.18(d，1H，NHCO)，8.74(s，1H，7-CH)，12.25(bs，2H，2×COOH)；Anal Calcd for C23H28N8O5·H2O·0.5C2H6O·0.5HBr(Mr＝578.03)C，49.87 H，5.84N，19.38；FoundC，49.68 H，6.13 N，18.89，N-[4-[[2-氨基-4-(N-正丁基)氨基-6-蝶啶甲基]甲胺基]苯甲酰基]-L-谷氨酸(12)方法同(9)的合成。将0.5g(1.6mmol)A(式中NR1R2＝NHCH2CH2CH2CH3)和1.04g(3.2mmol)对甲氨基苯甲酰-L-谷氨酸二钠盐(C)悬浮于40mL水中，加入7mL40％氢溴酸使溶解，然后滴入2mol/LNaOH溶液调节pH至1.7，于60～65℃搅拌反应3h。后经处理得0.37g黄色粉末(12)，收率45.1％。mp158～160℃。ESI-MS509.2[M-H]-；1H-NMR(AV-300 D6-DMSO)δ0.90(t，3H，n-Bu-CH3)，1.31(m，2H，n-Bu-CH2CH3)，1.56(m，2H，n-Bu-CH2Et)，1.91～2.06(m，2H，Glu-CH2)，2.31(t，2H，Glu-CH2COOH)，3.18(s，3H，N10-CH3)，3.46(t，2H，n-Bu-CH2C3H7)，4.33(m，1H，Glu-*CH)，4.78(s，2H，9-CH2)，6.71(m，2H，NH2)，6.81(d，J＝8.5Hz，2H，Ph-CH)，7.72(d，J＝8.5Hz，2H，Ph-CH)，7.95(m，1H，n-Bu-NH)，8.18(d，1H，NHCO)，8.52(s，1H，7-CH)；Anal Calcd for C24H30N8O5·H2O(Mr＝528.57)C，54.54 H，6.10 N，21.20；FoundC，54.84 H，6.47 N，21.19.
N-[4-[[2-氨基-4-(N-环己基)氨基-6-蝶啶甲基]甲胺基]苯甲酰基]-L-谷氨酸(13)方法同(9)的合成。将0.5g(1.48mmol)A(式中NR1R2＝NH-环己基)和0.96g(2.97mmol)对甲氨基苯甲酰-L-谷氨酸二钠盐(C)悬浮于40mL水中，加入7mL40％氢溴酸使溶解，然后滴入2mol/L NaOH溶液调节pH至1.7，于60～65℃搅拌反应3h。后经处理得0.33g黄色粉末(13)，收率41.5％。mp176～178℃。ESI-MS535.3[M-H]-；1H-NMR(AV-300 D6-DMSO)δ1.25～2.04(m，12H，Cyclohexyl-2’，3’，4’，5’，6’-CH2andGlu-CH2)，2.32(t，2H，Glu-CH2COOH)，3.16(s，3H，CH3)，4.03(m，1H，Cyclohexyl-CH)，4.35(m，1H，Glu-*CH)，4.82(s，2H，9-CH2)，6.52～6.82(m，2H，NH2)，6.85(d，J＝8.5Hz，2H，Ph-CH)，7.61～7.69(m，3H，Ph-CH and Cyclohexyl-NH)，8.20(d，1H，NHCO)，8.52(s，1H，7-CH)；Anal Calcd for C26H32N8O5·C2H6O·0.25HBr(Mr＝602.89)C，55.78 H，6.39N，18.59；FoundC，55.45 H，6.30 N，18.66。
N-[4-[[2-氨基4-[N-甲基，N-(2-羟基乙基)氨基-6-蝶啶甲基]甲胺基]苯甲酰基]-L-谷氨酸(14)方法同(9)的合成。将0.4g(1.28mmol)A(式中NR1R2＝N(CH3)CH2CH2OH)和0.83g(2.56mmol)对甲氨基苯甲酰-L-谷氨酸二钠盐(C)悬浮于30mL水中，加入5mL40％氢溴酸使溶解，然后滴入2mol/LNaOH溶液调节pH至1.7，于60～65℃搅拌反应3h。后经处理得0.3g黄褐色粉末(14)，收率45.8％。mp＞180℃(dec.)。ESI-MS511.3[M-H]-；1H-NMR(AV-300 D6-DMSO)δ1.89～2.10(m，2H，Glu-CH2)，2.34(m，2H，Glu-CH2COOH)，3.16(s，3H，10N-CH3)，3.36(t，2H，CH2OH)，3.62～3.87(m，5H，CH3NCH2)，4.35(m，1H，Glu-*CH)，4.71(s，1H，OH)，4.83(s，2H，9-CH2)，6.59～6.78(m，4H，Ph-CH and and NH2)，7.71(d，J＝8.5Hz，2H，Ph-CH)，8.21(d，1H，NHCO)，8.61(s，1H，7-CH)；Anal Calcd for C23H28N8O6·H2O(Mr＝530.58)C，52.07H，5.71 N，21.12；FoundC，52.37 H，5.72 N，21.11，N-[4-[[2-氨基-4-(N，N-二正丁基)氨基-6-蝶啶甲基]甲胺基]苯甲酰基]-L-谷氨酸(15)方法同(9)的合成。将0.6g(1.63mmol)A(式中NR1R2＝N(CH2CH2CH2CH3)2)和1.06g(3.27mmol)对甲氨基苯甲酰-L-谷氨酸二钠盐(C)悬浮于30mL水中，加入5mL 40％氢溴酸使溶解，然后滴入2mol/L NaOH溶液调节pH至1.7，于60～65℃搅拌反应3h。后经处理得0.37g黄褐色粉末(15)，收率40.0％。mp148～150℃。ESI-MS567.3[M+H]+，589.3[M+Na]+；1H-NMR(AV-300 D6-DMSO)δ0.88(t，6H，2×n-Bu-CH3)，1.25～1.3(m，4H，2×n-Bu-CH2CH3)，1.55～1.65(m，4H，2×n-Bu-CH2Et)，2.05(m，2H，Glu-CH2)，2.32(t，2H，Glu-CH2COOH)，3.16(s，3H，10N-CH3)，3.89(m，4H，2×n-Bu-CH2)，4.33～4.38(m，1H，Glu-*CH)，4.76(s，2H，9-CH2)，6.55(m，2H，NH2)，6.78(d，J＝8.5Hz，2H，Ph-CH)，7.72(m，J＝8.5Hz，2H，Ph-CH)，8.54(s，1H，7-CH)；Anal Calcd forC28H38N8O5·0.5CH4O·0.5H2O(Mr＝591.68)C，57.85 H，6.98 N，18.94；FoundC，58.06H，6.98 N，18.80。
N-[4-[[2-氨基-4-(N，N-二正丙基)氨基-6-蝶啶甲基]甲胺基]苯甲酰基]-L-谷氨酸(16)方法同(9)的合成。将0.5g(1.47mmol)A(式中NR1R2＝N(CH2CH2CH3)2)和0..92g(2.95mmol)对甲氨基苯甲酰-L-谷氨酸二钠盐(C)悬浮于40mL水中，加入7mL40％氢溴酸使溶解，然后滴入2mol/LNaOH溶液调节pH至1.7，于60～65℃搅拌反应3h。后经处理得0.47g黄色粉未(16)，收率59.4％。mp138～140℃。ESI-MS529.2[M+H]+，561.3[M+Na]+；1H-NMR(AV-300 D6-DMSO)δ0.88(t，6H，2×n-Pr-CH3)，1.67(q，4H，2×n-Pr-CH2Me)，1.92～2.06(m，2H ，Glu-CH2)，2.51(t，2H，Glu-CH2)，3.17(s，1H，CH3)，3.85(bs，4H，CH2NCH2)，4.34(m，1H，Glu-CH)，4.76(s，2H，CH2)，6.55(m，2H，NH2)，6.78(d，J＝8.5Hz，2H，Ph-CH)，7.71(d，J＝8.5Hz，2H，Ph-CH)，8.19(d，1H，NHCO)，8.63(s，1H，7-CH)，12.4(bs，2H，2×COOH)；Anal Calcd for C26H34N8O5·1.25H2O(Mr＝561.13)C，55.65 H，6.56 N，19.97；FoundC，55.94 H，6.71 N，19.48。
3、活性测定MTX衍生物抑制诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的抑制百分率和相应的IC50测定a、所用仪器HH-4型数显恒温水浴锅常州国华电器有限公司BS110S分析天平北京赛多利天平有限公司752紫外光栅分光光度计上海分析仪器总厂b、测定原理与基本方法利用诱导型一氧化氮合酶催化NO生成时必需辅助因子四氢生物蝶呤(BH4)的原理，在体外固定了反应中iNOS和BH4的浓度，加入不同的药物(MTX衍生物)，测定一氧化氮(NO)的生成量，算出抑制百分率。用同样的方法测定不同药物浓度对反应的抑制率，用回归方法计算出IC50。
c.试剂与样品合成的通式I部分MTX衍生物，以及由浙江台州康多利药业公司提供的MTX(1)和AMT(氨基蝶呤，2)计18个，临用前按BH4摩尔浓度的48倍用二甲亚砜溶解备用。
诱导型一氧化氮合酶Inducible Nitric Oxide Synthase；Recombinant enzymeexpressed in E.Coli，由Cayman chemical公司提供。
四氧生物蝶呤二盐酸盐，MW＝314.2，纯度＞99％ 由Cayman chemical公司提供。
一氧化氮合酶试剂盒 由南京建成生物工研究所提供，批号20040511，d.药物体外抑制诱导型一氧化氮合酶百分率的测定(参见钟慈声，孙安阳主编一氧化氮的生物医学，上海上海医科大学出版社，1997，p.28-30，361-363，381-385)。
在一氧化氮合酶试剂盒的1号试剂中不加入四氢生物蝶呤(BH4)，按试剂盒方法分别在其它试管中加入试剂1、试剂2、试剂3、iNOS样品、BH4、受试药物后混匀，37℃水浴准确反应20分钟，加入试剂4终止反应，再加入终止液后混匀，530nm处，1cm光径，蒸馏水调零，比色测定吸光值。
测定BH4的饱和浓度按照试剂盒方法按步骤加入试剂，各试管中分别加入不同浓度的BH4，测定各试管吸光值，并计算其饱和浓度。
测定化合物的抑制百分率根据文献，配置药物浓度为BH4饱和浓度的48倍，同样按试剂盒方法测定吸光值，并计算出抑制百分率。
抑制百分率＝(标准管吸光值-测定管吸光值)/(标准管吸光值-空白管吸光值)×100％MTX衍生物半数抑制浓度(ID50)的测定根据前一次实验BH4饱和浓度测定结果，以及药物的抑制百分率达100％的药物浓度，向下推几个药物剂量，分别为32倍、24倍、18倍、13.5倍(剂量比为1∶0.75)。实验中每个试管中加入的诱导型一氧化氮(iNOS)和BH4的浓度是固定的。测定各管在530nm处的吸光度，用直线回归的方法计算出各自的半数抑制浓度。
所测定的18个MTX衍生物的分子结构与它们对iNOS的抑制率、ID50列于下表1。
表1 MTX衍生物对iNOS的抑制活性
注(1)表中化合物1-18的结构如下图，图中R1、R2、R3见表头； (2)化合物1为甲氨蝶呤(MTX)，化合物2为氨基蝶呤(AMT)。
表1结果表明，仅有4个通式II MTX衍生物对iNOS没有抑制作用，绝大多数通式II MTX衍生物对iNOS有抑制效果，其中有4个化合物在一定浓度下可完全抑制iNOS的活性。
权利要求
1.下述通式(I)表示的化合物 其中R代表-OR4、-NHCH(COOR5)CH2CH2COOR6、-NHCH(COOR7)CH2CH2CH2NHC(＝NH)NH2、-NHCH(COOR8)CH2CH2CONH2，R4、R5、R6、R7、R8相同或不同，各自独立地代表H、C1-C5直链或支链的烷烃；R1和R2相同或不同，各自独立地表示C1-C8直链或支链的烷基；苄基；芳基；R1和R2不同时为H；R1为H或甲基时，R2代表三元～六元环烷基，-(CH2)nOH(n＝1～6)；-C6H4COGlu、-C6H4CH2COGlu、-C6H4COGlu、-C6H4CH2COGlu，Glu代表-NHCH(COOR9)CH2CH2COOR10，R9与R10相同或不同，各自独立地表示H、甲基或乙基；-C6H4COOR11、-C6H4CH2COOR12，R11和R12相同或不同，各自独立地表示H、甲基、乙基；或者NR1R2代表乙烯亚胺基、哌啶基、哌嗪基、甲基哌嗪基或三元～六元脂肪环单或二取代氨基；R3代表氢；取代或无取代基的C1-C8直链或支链的烷基；C1-C8直链或支链的烷氧基；C3-C6的环烷基；-R13C＝CR14或-R13C≡CR14，R13表示H或C1-C8的直链或支链亚烷基；R14表示H、C1-C8的直链或支链烷基；通式(I)不包括当R3为H或甲基时，R1或R2为H或甲基，NR1R2为哌啶基。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中R代表-NHCH(COOR4)CH2CH2COOR5、-NHCH(COOR6)CH2CH2CH2NHC(＝NH)NH2、-NHCH(COOR7)CH2CH2CONH2，R4、R5、R6、R7相同或不同，各自独立地代表H，C1-C4直链或支链的烷烃；R1，R2相同或不同，各自独立地代表H，C1-C5直链或支链的烷烃；R1和R2相同，为乙基、正丙基、异丙基、丁基、苄基；R1代表H时，R2为乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、环己基、苄基、-CH2CH2OH；R1代表甲基时，R2为-CH2CH2OH。或者NR1R2代表乙烯亚胺基、哌啶基、哌嗪基、甲基哌嗪基或三元～六元脂肪环单或二取代氨基；R3代表氢；取代或无取代基的C1-C5直链或支链的烷基；C3-C6的环烷基；-R8C＝CR9或-R8C≡CR9，R8表示H或C1-C5的直链或支链亚烷基；R9表示H、C1-C5的直链或支链烷基；
3.根据权利要求1或2所述的化合物，其中R代表-NHCH(COOR4)CH2CH2COOR5，R4、R5相同或不同，各自独立地代表H，C1-C4直链或支链的烷烃；R1和R2相同，为乙基、正丙基、异丙基、丁基、苄基；R1代表H时，R2为乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、环己基、苄基、-CH2CH2OH；R1代表甲基时，R2为-CH2CH2OH；R3代表氢；取代或无取代基的C1-C8直链或支链的烷基；C1-C8直链或支链的烷氧基；C3-C6的环烷基；-R6C＝CR7或-R6C≡CR7，R6表示H或C1-C5的直链或支链亚烷基；R7表示H、C1-C5的直链或支链烷基。
4.权利要求1至3任意一项所述化合物在制备诱导性一氧化氮合酶药物和抗肿瘤药物中的应用。
5.权利要求1至3任意一项所述化合物在制备在败血性和(或)出血性休克或用细胞毒素进行肿瘤化学治疗和肝硬化或肝萎缩和(或)肝功能衰退时所引起的血压下降或(和)止血障碍药物中的应用。
6.权利要求1至3任意一项所述化合物在制备预防和治疗炎症疾病、异体器官和组织移植的排斥反应药物以及胰岛素依赖型糖尿病药物中的应用。
7.权利要求1至3任意一项所述化合物在制备预防和治疗细胞毒素进行肿瘤的化学治疗、化学物质或药物以及慢性肝炎引发的多种肝损伤、肝功能衰退以及预防和治疗心肌梗塞损伤、病毒性心肌炎药物中的应用。
8.权利要求1至3任意一项所述化合物在制备预防和治疗病毒性神经退化、变化疾病及痛觉过敏、癫痫、偏头痛药物中的应用。
9.权利要求1至3任意一项所述化合物在制备用于计划生育的药物中的应用。
10.一种药物组合物，其中含有治疗有效量的权利要求1至3任意一项所述化合物，并含有常规药用载体。
全文摘要
本发明涉及一种具有抑制一氧化氮合成酶作用的甲氨蝶呤衍生物，它对甲氨蝶呤(MTX)的4－位氨基进行结构修饰，具有通式(1)所述的化学结构。本发明抗癌谱较宽、毒性改善，治疗用途较MTX有所扩大，具有抑制一氧化氮合成酶的作用和抑制肿瘤细胞生长的作用，可用于制备抗肿瘤、抗关节炎、治疗肠类疾病、用作计划生育等的药物。
文档编号A61P9/00GK1583746SQ200410044878
公开日2005年2月23日 申请日期2004年5月26日 优先权日2004年5月26日
发明者姚其正, 冯明声, 石静波, 姜力勋, 郭平 申请人:中国药科大学
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