一种通过干细胞外泌体微囊泡递送DNA断裂因子抑制酶的方法与流程

本发明属于细胞生物学领域，具体为一种通过干细胞外泌体微囊泡递送dna断裂因子抑制酶的方法。

背景技术：

1、干细胞是一群具有高度自我更新和多向分化潜能的细胞，理论上具有分化为人体所有组织器官类型细胞的能力，因而是再生医学和组织工程的理想细胞来源。随着细胞生物学技术、临床医疗技术的研究深入和发展，科学家们发现干细胞可以补充成熟器官中的衰老、损伤或死亡细胞，已被越来越广泛地尝试用于多种终末期、难治性疾病的研究中，干细胞对肿脑卒中、糖尿病、帕金森、阿尔茨海默症、心肌梗死等方面的研究也逐渐深入，所以促进干细胞

2、间充质干细胞20世纪60年代首次从骨髓中被鉴定。此后，间充质干细胞在多种组织中分离出来，包括骨髓、脐血、胎盘、脂肪、牙龈、口腔黏膜、羊水、脑等。间充质干细胞可以向多种细胞分化，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞，成肌细胞、血管内皮细胞、神经细胞等。现有的技术可以很成熟的对其进行分离、扩增等体外培养，因此间充质干细胞可以作为组织工程研究中理想的种子细胞。间充质干细胞具有容易分离、增殖潜能高及基因稳定的优点，还能迁移到受损组织对抗炎症、影响微环境，促血管生成、抗纤维化、抗凋亡，释放细胞因子参与修复过程和组织再生。

3、细胞凋亡最显著特征之一就是染色体dna表现为梯状断裂，其形成的原因是凋亡特异的核酸内切酶在核小体间水解染色体dna而产生180bp及其整数倍的dna片段，在琼脂糖凝胶电泳中产生“梯带”（dna ladder）。在这一现象被发现之后的十几年中，人们一直在寻找水解染色体dna的凋亡特异核酸酶。1996年王晓东实验室从人hela细胞可溶性胞质提取物中分离纯化了一种蛋白质，并将其命名为人dna断裂因子（human dna fragmentationfactor, dff）。进一步实验结果表明，dff由分子量分别为40 kd和45 kd的两个亚基构成。其中40 kd亚基（dff40）具有细胞凋亡特异的dna内切酶活性，45 kd亚基（dff45）为dff40的特异性抑制物，可与dff40结合并专一抑制其核酸酶活性，而对其他dna酶（dna酶i、ii、微球菌核酸酶等）均无抑制作用。在正常细胞中dff45与dff40结合并抑制其活性。当细胞发生凋亡时，dff45被胱冬肽酶（caspase）-3水解为3个小片段，释放出活性dff40，切割染色体dna形成dna梯。到目前为止，只在人、鼠和果蝇细胞中发现了凋亡特异核酸内切酶及其抑制物，而在其他物种中均无类似凋亡特异核酸酶的报道。

4、间充质干细胞因为取材方便、容易分离培养，在适当条件下可分化成骨骼、皮肤、血管及神经等多种组织细胞，目前广泛用于组织修复、器官重建等多个领域。虽然间充质干细胞处于发育早期阶段，但是在培养的过程中以及冻存过程中，间充质干细胞仍然会出现凋亡的情况，所以降低间充质干细胞的凋亡，会提高间充质干细胞的培养获得率，增强修复效果，对提高间充质干细胞后续研究及临床转化应用的效果具有重要的临床意义。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中的不足，本发明旨在提供一种通过干细胞外泌体微囊泡递送dna断裂因子抑制酶的方法，具体为通过干细胞外泌体包装并递送dna断裂因子抑制酶-重组人dff45蛋白，可以提高重组人dff45蛋白的递送效率，提高脐带间充质干细胞内dna断裂因子抑制酶的表达量，降低脐带间充质干细胞的凋亡率，是一种可以提高递送效率方法，从而提高脐带间充质干细胞的增殖速度。

2、为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、一种通过干细胞外泌体微囊泡递送dna断裂因子抑制酶的方法，其特征步骤为：

4、第一步：脐带间充质干细胞培养

5、从液氮罐中取出冻存的脐带间充质干细胞，在37℃水浴中迅速晃动使内部尽快融化，2000 rpm离心10 min，弃去上清液，加入dmem培养基，并吹打成单个细胞，2000 rpm离心10 min，弃去上清液，添加含有10%胎牛血清的dmem培养液，并吹打成单个细胞，将细胞接种至新的175 cm2培养瓶中，放置于37℃恒温5%co2培养箱中进行培养，每1-2天更换新dmem培养基。

6、第二步：脐带间充质干细胞外泌体分离及纯化

7、连续培养脐带间充质干细胞，每次更换新培养基时将培养后的培养基收集至50ml离心管中，使用75%的酒精浸泡对超速离心管进行清洁，超速离心管晾干后，在无菌的环境下采用移动紫外灭菌车紫外照射灭菌30 min。将两管共100 ml培养上清液放置于超速离心管中，放在天平上精准配平。4℃条件下，10000×g 离心30 min，去除细胞小碎片。4℃条件下，100000 ×g离心90 min，弃去上清液，沉淀为外泌体和杂蛋白。在无菌环境下加入无菌pbs溶液，吹打重悬沉淀，4℃条件下，120000 ×g 离心90 min，弃去上清液，采用exo-spin外泌体试剂盒分离纯化外泌体。

8、第三步：制备重组人dna断裂因子45（dff45）

9、提取正常培养hela细胞的总rna，并以总rna为模板进行pcr扩增dff45序列，进行琼脂糖凝胶电泳后，纯化获得dff45序列，与pmd18-t克隆载体连接，转化至大肠杆菌dh5α菌种中，进行扩增后提取重组pmd18-t-dff45质粒，进行双酶切，进行测序，培养并纯化pet28a表达载体，同样进行双酶切，将测序准确后的dff45序列与酶切后的pet28a表达载体连接，并转化至bl21（de3）感受态大肠杆菌中，扩大化培养并促进表达后提取重组人dff45蛋白，使用亲和层析柱进行纯化，获得纯化的重组人dff45蛋白。

10、第四步：干细胞外泌体包装及递送重组人dff45蛋白

11、在无菌的环境下，取1 μm重组人dff45蛋白及1ml干细胞外泌体悬液，在冰水浴中放置30 min，42℃温水浴90 s，迅速放入冰水浴中冷却3 min。取出培养至p5代的脐带间充质干细胞，弃去上清液，添加新dmem培养基，将包装好重组人dff45蛋白的干细胞外泌体按照重组人dff45蛋白终浓度为2 μm/l加入至培养基中，将培养瓶放置在42℃温水浴2 min，然后放置于37℃恒温5%co2培养箱中进行培养。

12、本发明所述干细胞外泌体微囊泡可以提高重组人dff45蛋白的递送效率，促进更多的重组人dff45蛋白递送至脐带间充质干细胞中，可以降低脐带间充质干细胞的凋亡率，从而达到提高脐带间充质干细胞增殖效率的重组蛋白递送方法。

13、本发明中采用脐带间充质干细胞外泌体微囊泡递送dna断裂因子抑制酶的培养方法培养的脐带间充质干细胞中dna断裂因子抑制酶的表达量较常规培养方法和采用常规递送dna断裂因子抑制酶的培养方法培养的脐带间充质干细胞明显增加，与常规培养方法相比较将将脐带间充质干细胞的增殖速度提高26.38%，较常规递送dna断裂因子抑制酶的培养方法培养的脐带间充质干细胞增殖速度提高7.52%，而且将普通常规培养方法脐带间充质干细胞的凋亡率由14.32%降低至的8.53%。

技术特征：

1.一种通过干细胞外泌体微囊泡递送dna断裂因子抑制酶的方法，其特征在于包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种通过干细胞外泌体微囊泡递送dna断裂因子抑制酶的方法，其特征在于，所述第一步包括：

3.根据权利要求2所述的一种通过干细胞外泌体微囊泡递送dna断裂因子抑制酶的方法，其特征在于离心条件为1500-3000 rpm离心5-20 min，dmem培养液中添加了含有10%胎牛血清，放置温度为30-40℃恒温5%co2培养箱中进行培养。

4.根据权利要求1所述的一种通过干细胞外泌体微囊泡递送dna断裂因子抑制酶的方法，其特征在于其中所述第一步包括：

5.根据权利要求4所述的一种通过干细胞外泌体微囊泡递送dna断裂因子抑制酶的方法，其特征在于在步骤（2）中，每次更换新培养基时将培养后的培养基收集至离心管中，使用酒精浸泡对超速离心管进行清洁，超速离心管晾干后，在无菌的环境下采用移动紫外灭菌车紫外照射灭菌。将两管共培养上清液放置于超速离心管中，放在天平上精准配平，2-6℃条件下离心，去除细胞小碎片，2-6℃条件下离心，弃去上清液，沉淀为外泌体和杂蛋白，后在无菌环境下加入无菌pbs溶液，吹打重悬沉淀，2-6℃条件下，离心，弃去上清液后，采用exo-spin外泌体试剂盒分离纯化外泌体。

6.根据权利要求1所述的一种通过干细胞外泌体微囊泡递送dna断裂因子抑制酶的方法，其特征在于其中所述第一步包括：

7.根据权利要求1所述的一种通过干细胞外泌体微囊泡递送dna断裂因子抑制酶的方法，其特征在于其中所述第一步包括：

8.根据权利要求1所述的一种通过干细胞外泌体微囊泡递送dna断裂因子抑制酶的方法，其特征在于其中所述第一步中，取1 μm重组人dff45蛋白及1ml干细胞外泌体悬液，在冰水浴中放置后，温水浴，后迅速放入冰水浴中冷却，取出培养至p5代的脐带间充质干细胞，弃去上清液，添加新dmem培养基，将包装好重组人dff45蛋白的干细胞外泌体按照重组人dff45蛋白终浓度为2 μm/l加入至培养基中，将培养瓶放置在温水浴。

技术总结
本发明涉及细胞生物学领域，具体的将是通过脐带间充质干细胞外泌体微囊泡包装重组人DFF45蛋白，并递送至培养的脐带间充质干细胞内，发挥调节凋亡特异核酸酶活性和作用效果，降低脐带间充质干细胞的凋亡率，同时还可以提高脐带间充质干细胞增殖效果的，本方法采用脐带间充质干细胞外泌体微囊泡递送DNA断裂因子抑制酶的培养方法培养的脐带间充质干细胞中DNA断裂因子抑制酶的表达量较常规培养方法和采用常规递送DNA断裂因子抑制酶的培养方法培养的脐带间充质干细胞明显增加，与常规培养方法相比较将将脐带间充质干细胞的增殖速度提高26.38%，较常规递送DNA断裂因子抑制酶的培养方法培养的脐带间充质干细胞增殖速度提高7.52%，而且将普通常规培养方法脐带间充质干细胞的凋亡率由14.32%降低至的8.53%。

技术研发人员：刘慧玉,王晓林,郭建东,李春雨,李春歌
受保护的技术使用者：启生源（山东）生命科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23