一种凋亡囊泡的规模化制备方法与流程

本发明属于生物组织工程，具体涉及一种凋亡囊泡的规模化制备方法。

背景技术：

1、人类机体每日有超过上百亿的细胞发生凋亡，所产生的大量apovs在维持组织和器官稳态具有重要作用；在不同生理病理环境下，机体产生的apovs是异质性的，发挥不同的生物功能，广泛参与免疫调节、组织和器官稳态维持以及疾病发展。干细胞细胞外囊泡治疗疾病的主要机理包括：1）抗原呈递：通过抗原递呈作用于免疫细胞用于抗癌和抗感染；2）免疫调控：通过作用于靶细胞，对于自身免疫性疾病和神经退行性疾病的治疗起到免疫抑制作用，对于癌症治疗起到免疫激活的作用；3）囊泡可到达损伤组织修复损伤组织。间充质干细胞凋亡过程中会产生大量的凋亡囊泡（apovs），其粒径大小在100nm~ 1µm之间，apovs含有各种各样的蛋白质、核酸、脂质和细胞器成分。大量研究表明，apovs作为一种特定的凋亡产物在动物发育和维持组织和器官稳态中发挥着多种重要作用，全身输注外源性间充质干细胞来源的apovs在各种疾病中具有独特的治疗效果，可用于包括肺纤维化、肝脏、免疫紊乱、骨质疏松症、皮肤损伤、肿瘤等十多种疾病的治疗。此外，apovs的低免疫原性、易于存储和易于给药等特性，使其具有广泛的应用优势。

2、细胞凋亡囊泡的制备的方法比较多样化，主要是通过凋亡诱导的方式获得。目前凋亡囊泡的诱导方式有以下几种。

3、一是紫外照射进行凋亡诱导，分离上清制备apovs，但该方法仅表层细胞被照射可产生囊泡，产量较低，限制产能。

4、二是过氧化氢进行凋亡诱导，分离上清制备apovs，此方法简单易行。

5、三是星形孢菌素（sts）进行凋亡诱导，分离上清制备apovs，此方法简单易行，也是目前凋亡囊泡诱导最常用的方法。

6、凋亡囊泡的制备方法主要包括以下几种方式。

7、一是超速离心法，此种方法得到的凋亡囊泡量多，但是纯度不足，由于微泡和外泌体没有非常统一的鉴定标准，也有一些研究认为此种方法得到的凋亡囊泡不纯，可能含有外泌体。

8、二是过滤离心，这种操作简单省时，不影响凋亡囊泡的生物活性，但同样存在纯度不足的问题。

9、三是密度梯度离心法，用此种方法分离到的凋亡囊泡纯度高，但是前期准备工作繁杂，耗时，产量少。

10、公布号为cn 115820548 a的专利《一种动物组织来源的凋亡囊泡的制备方法及其应用》中凋亡囊泡是利用sts凋亡诱导，差速离心方法收集纯化所得，所得的凋亡囊泡具有调控大鼠骨髓间充质干细胞活性、促进大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化、促进成纤维细胞迁移等作用在调控细胞活性。

11、cn 116350659 a专利《脂肪组织凋亡囊泡的应用、制剂及其制备方法》中，对脂肪组织进行培养并诱导凋亡，再通过梯度离心分离得到脂肪组织的凋亡细胞外囊泡，可以促进皮肤伤口愈合，疤痕减少。

12、从以上的分析中可以看出，现在已有较多的专利进行了凋亡囊泡的分离，但其制备方法大都采用培养瓶、细胞培养液和诱导剂，适合小规模制备，所得凋亡囊泡产量低且成本高。随着生产需求的提高，现有的培养瓶制备方法由于其产量和成本的限制，不能满足规模化生产，因此，亟需开发一种低成本、可应用于规模化生产的凋亡囊泡制备技术。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种提高凋亡囊泡产量的规模化制备方法。

2、为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案包括以下步骤：

3、一种凋亡囊泡的规模化制备方法，其特征在于，包括：

4、1）将p3-p5代人脐带间充质干细胞加入十层细胞工厂中，加入500ml含10%fbs的α-mem完全培养基，摇匀后置于37℃，5% co2细胞培养箱中培养；

5、2）当间充质干细胞生长融合度达到85-90%时，进行换液，生理盐水洗涤细胞后，加入生理盐水、白介素-6和星形孢菌素进行凋亡诱导；

6、3）凋亡诱导结束后，充分震荡细胞工厂，得混悬液，然后进行分步离心，即得凋亡囊泡。

7、其中，步骤2）的诱导液中生理盐水为0.9%的生理盐水。

8、其中，步骤2）的诱导液中白介素-6的浓度为5-10ng/l。

9、其中，步骤2）的诱导液中星形孢菌素的浓度为300-500nm。

10、其中，步骤2）中凋亡诱导的时间为24小时。

11、其中，步骤3）中分步离心包括以下步骤：

12、s1：凋亡诱导后得到的混悬液，离心机设置800g，4℃，离心10min，收集上清液；

13、s2：s1中收集的上清液，离心机设置2000g，4℃，离心10min，收集上清液；

14、s3：s2中收集的上清液，离心机设置16000g，4℃，离心30min，收集沉淀；

15、s4：s3中收集的沉淀用生理盐水重悬后，采用0.22μm滤器过滤除菌，即得凋亡囊泡，于-20℃保存。

16、本发明的有益效果为：

17、1）本发明提供的人脐带间充质干细胞凋亡囊泡规模化制备方法，采用十层细胞工厂制备凋亡囊泡，较大的培养面积减少了细胞培养装置，同时可减少人工操作，降低污染风险。

18、2）采用生理盐水、白介素-6及星形孢菌素诱导液对脐带间充质干细胞进行凋亡诱导，获取凋亡囊泡。白介素-6及星形孢菌素的浓度及作用时间决定了凋亡囊泡的数量，本发明筛选白介素-6及星形孢菌素最优处理浓度，可获取高产量的人脐带间充质干细胞凋亡囊泡。

19、3）本发明制备方法中使用的诱导方法为饥饿诱导与白介素-6及星形孢菌素混合处理。星形孢菌素是通过激活胱天蛋白酶-3诱导细胞凋亡的一种方法。加入白介素-6后，白介素-6刺激会阻断jak/stat信号通路，抑制增殖并促进细胞凋亡。通过白介素-6及星形孢菌素二者发挥协同作用，来促进细胞凋亡，提高凋亡囊泡的产量。

技术特征：

1.一种凋亡囊泡的规模化制备方法，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的制备方法，所述步骤2）的诱导液中生理盐水为0.9%的生理盐水。

3.根据权利要求1所述的制备方法，所述步骤2）的诱导液中白介素-6的浓度为5-10ng/l。

4.根据权利要求1所述的制备方法，所述步骤2）的诱导液中星形孢菌素的浓度为300-500nm。

5.根据权利要求1所述的制备方法，所述步骤2）中凋亡诱导的时间为24小时。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3）中分步离心包括以下步骤：

技术总结
本发明公开了一种凋亡囊泡的规模化制备方法。采用十层细胞工厂制备凋亡囊泡，较大的培养面积减少了细胞培养装置，同时可减少人工操作，降低污染风险。采用生理盐水、白介素‑6及星形孢菌素诱导液对脐带间充质干细胞进行凋亡诱导，获取凋亡囊泡。筛选白介素‑6及星形孢菌素最优处理浓度，可获取高产量的人脐带间充质干细胞凋亡囊泡。通过白介素‑6及星形孢菌素二者发挥协同作用，来促进细胞凋亡，提高凋亡囊泡的产量。

技术研发人员：雷凯,宋轲,程蕊苹,倪华
受保护的技术使用者：山东佰鸿干细胞生物技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23